大鼠小脑部分表达序列标签的鉴定

目的:为了获取大鼠小脑特异表达的cDNA序列,筛选新的EST基因片段,以便进一步获取有意义的cDNA全基因。方法:以大鼠大脑、脑干mRNA逆转录cDNA作为driver(驱动)cDNA,大鼠小脑mRNA逆转录cDNA作为tester(测试)cDNA,经消减杂交法,消除与大脑及脑干相同的cDNA,并富集低丰度基因,从而获得大鼠小脑特异表达基因片段,以及低表达基因片段,克隆制备成大鼠小脑特异表达cDNA文库。结果:共挑选出32个阳性克隆质粒,测序得到34个不同基因片段的序列。最后用反Northern杂交去除假阳性,筛选出8个有意义的差异表达cDNA基因片段。同时,将测序结果与Genbank进行同源性比较,发现13个新的EST序列,并申请获得基因序列号(AW288461-AW288474)。结论:抑制消减杂交法是一种筛选特异表达基因的有效方法。本结果可为研究脑功能的分子机制提供有益的资料。     

应用抑制性消减杂交技术筛选及鉴定高温致金黄地鼠神经管畸形下调表达基因

目的克隆高温致金黄地鼠神经管畸形下调表达基因，探讨其分子生物学机理。方法应用抑制性消减杂交技术构建高温致畸金黄地鼠胚胎神经管反向消减cDNA文库；联合蓝白斑和菌落PCR方法筛选阳性克隆进行测序和同源性分析；用Northern印迹方法证实这些基因的表达。结果成功构建高温致畸金黄地鼠胚胎神经管反向消减cDNA文库，从中筛选到15个基因，均与GenBank中已知基因有同源性。Northern印迹证实这些基因在高温致畸胚胎神经管中均呈下调表达。结论发现了高温致金黄地鼠神经管畸形过程中的一些重要相关基因并对其功能进行了初步探讨。     

胃癌下调基因组cDNA抑制消减文库的建立及鉴定

目的 建立胃癌下调基因组cDNA抑制消减文库并鉴定。方法 采用高灵敏度的抑制消减杂交技术，建立五人份正常胃粘膜mRNA(Tester)抑制消减杂交胃癌mRNA(Driver)的差异表达文库，用PCR及差异表达克隆菌转膜反向杂交判定其消减效率。结果 所构建胃癌下调基因抑制消减杂交cDNA文库，消减效率高，胃癌下调基因在正常胃粘膜及胃癌组织中的差异表达符合率达86％。结论 成功建立了用于筛选胃癌下调基因的抑制消减杂交cDNA文库。     

肺腺癌同源正常组织中差异表达基因的克隆

目的 从与肺腺癌同源的正常组织中筛选差异表达基因，以期从分子水平阐明机体抑制肿瘤发生的机制。方法 利用抑制性消减杂交分别肺癌组织及肺腺癌同源正常组织cDNA片段，并建立相应的cDNA文库。用肺腺癌组织及与其同源的正常组织cDNA片段作为探针，分别进行逆向和正向斑点杂交，筛选与同源正常组织探针杂交而不与肺腺癌组织探针杂交的阳性克隆并测序，测序结果与GenBank中的序列进行同源性分析。结果 在肺腺癌同源正常组织中，获得12个差异表达基因片段，其中4个与细胞凋亡相关基因有较高的同源性；8个与人类不同染色体的不同区域有较高的同源性，功能不详。结论 推测肺腺癌同源正常组织中存在凋亡相关基因等，它们可能通过多种途径促进细胞凋亡而抑制细胞异常增殖，从而达到抑制肿瘤发生的目的。     

一个新的小鼠腭裂候选基因cDNA序列的克隆

目的 克隆并筛选与小鼠腭裂发生相关候选新基因。方法 利用聚合酶链反应改良扣除杂交技术，克隆正常组与腭裂组小鼠腭突组织中差异表达的基因，经反向点杂交鉴定后挑选阳性克隆并测序及同源性分析，Northern印迹杂交检测所获的新基因mRNA的全长。结果 经大规模测序后得4个新的表达序列标签，其中1个片段全长为809bp，Northern印迹杂交结果显示为该基因的eDNA全长。结论 获得一个新的与小鼠腭裂发生相关的候选基因的cDNA全长。     

小鼠生发泡完整卵母细胞一个特异基因的克隆及其在胚胎的表达

目的：克隆和筛选小鼠生发泡完整卵母细胞(Gv卵)特异基因，并检测其一在胚胎中的表达。方法：应用抑制性消减杂交技术(SSH)，建立Gv卵特异的cDNA文库。通过斑点杂交法进一步筛选并对阳性克隆进行序列测定和同源性分析；采用RT-PC方法观察其一在着床前胚胎的表达。结果：克隆发现18个基因和8个EST序列在GV卵中特异表达。RT-PCR显示该阳性克隆的基因在GV卵、MII卵、1-细胞胚胎和2-细胞胚胎有表达，其短片段是预期要扩增者，从MII卵开始表达下降；长片段在Gv卵、MII卵、1．细胞胚胎和2-细胞胚胎表达未见明显变化。长、短片段两端序列一致。结论：该基因是GV卵特异cDNA文库中的一个基因，且是母源性基因，提示该基因在卵母细胞成熟和合子基因激活中起一定作用。     

心肌成纤维细胞在血管紧张素Ⅱ刺激下表达下调基因的分离和鉴定

目的：对成年大鼠心肌成纤维细胞（CF）受血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）刺激后下调基因表达谱进行筛选及分析。 方法： 以受AngⅡ刺激CF为驱动方，未刺激CF为实验方，进行抑制消减杂交（SSH）建立消减cDNA文库。经斑点杂交筛选文库后将部分阳性克隆测序及进行同源性分析。 结果： 共获得17条下调表达基因，分别与胞内信号转导、转录抑制、纤维沉积和细胞骨架重构相关，并克隆到4条新基因表达序列标签（EST）。 结论： SSH有效地克隆了成年大鼠CF受AngⅡ刺激后下调表达基因，对这些基因的研究将有助于阐明心肌改建的分子机制。     

IgA肾病肾阴虚证cDNA文库的构建

目的应用抑制性消减杂交（suppression subtractive hybridization,SSH）技术构建汉族人IgA肾病肾阴虚证cDNA消减文库。方法选择IgA肾病且中医辨证为肾阴虚证的患者以及正常人作为其对照组,进行正向和反向消减杂交。采用Trizol BD法提取总RNA,用SMART技术逆转录并扩增总cDNA,用RsaⅠ酶切基因组cDNA成大小不等的片段,分别与两种不同的接头连接,进行2次消减杂交及2次抑制性PCR,然后将PCR产物与U载体连接,经蓝白斑筛选后,再用PCR方法插入片段筛选出阳性重组质粒,构建IgA肾病肾阴虚证消减文库。结果用SSH方法筛选出了IgA肾病肾阴虚证的差异cDNA片段,其中正向消减文库共获得325个阳性克隆．反向消减文库获得306个阳性克隆,从而成功地构建了IgA肾病肾阴虚证的cDNA消减文库。结论SSH技术能够快速有效地分离差异cDNA片段,成功构建了IgA肾病肾阴虚证的cDNA文库,为进一步克隆肾阴虚证的相关基因奠定了基础。     

构建不稳定型心绞痛淋巴细胞差异表达cDNA消减文库

目的:构建不稳定型心绞痛淋巴细胞差异表达cDNA消减文库。方法:将不稳定型心绞痛病人(n=15)和稳定型心绞痛病人(n=15)的淋巴细胞的RNA进行抑制性消减杂交(SSH), 将获得的顺向和逆向消减产物分别与T/A载体连接, 采用1×TSS一步法转化大肠杆菌JM109, 获得消减cDNA文库, 采用蓝白斑筛选和菌落PCR筛选有插入片段的克隆。结果:各组cDNA文库各获得2000个阳性克隆, cDNA片段大部分分布于(200-600)bp之间。结论:本研究构建了不稳定型心绞痛淋巴细胞消减cDNA文库, 此cDNA文库有助于进一步筛选不稳定型心绞痛淋巴细胞中的差异表达基因。     

抑制性消减杂交技术筛选重组IFNβ下调HepG2细胞靶基因

目的利用抑制性消减杂交（SSH）技术构建重组干扰素β（IFNβ）刺激人肝癌细胞系HepG2差异表达基因的cDNA消减文库，筛选IFNβ下凋HepG2相关基因。方法重组IFNβ2000U／ml刺激对数生长期HepG2细胞，以生理盐水作用的HepG2细胞为阴性对照；制备细胞裂解液，从中提取mRNA并逆转录为cDNA，经Rsa Ⅰ酶切后将实验组cDNA分成两份，分别与两种不同的接头连接，再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性PCR，将产物与T／A载体连接，构建cDNA消减文库，并转染大肠埃希菌进行文库扩增，随机挑选克隆PCR后进行测序及同源性分析。结果成功构建重组IFNβ刺激HepG2细胞差异表达基因的cDNA消减文库。文库扩增后，得到58个阳性克隆，进行菌落PCR分析，均得到200～1000bp插入片段。随机挑选其中35个插入片段测序，并通过生物信息学分析，结果共获得12种编码基因。结论应用SSH技术成功构建了IFNβ刺激HepG2细胞差异表达基因的cDNA消减文库，为进一步了解IFNβ在肝细胞内的免疫调节机制提供了依据。     

单眼视网膜摘除鸽视盖差异表达基因的筛选

目的　筛选单眼剥夺鸽视盖差异表达的基因。　方法　采用抑制消减杂交技术构建左侧视网膜剥夺后左视盖基因差异表达的文库 ,对部分重组克隆进行序列分析 ,反Northern进一步去除假阳性。　结果　随机测序 15 0个表达序列标签 ,16个表达序列标签经反Northern证实为真阳性 ,包括与基因库已知基因同源的及未发现明确的同源序列 ,138个基因片段已申请序列号。　结论　视盖差异表达基因的研究为深入研究视觉发育、视中枢的分子构筑提供有益的线索     

The genetic profiling of preferentially expressed genes in murine splenic CD8α+ dendritic cells

In the murine splenocytes, CD8α+ dendritic cells (abbreviated as 8+DC) and CD8α− dendritic cells (abbreviated as 8−DC) are identified with some vague features for each of them. 8+DCs but not 8−DCs cross-prime cytotoxic T cells in vivo. We aim to distinguish the two subtypes of DC based on gene expression profiling. Suppressive subtractive hybridization was undertaken to get differentially expressed genes from such subtracted cDNA library specific to 8+DC. A total of 114 sequences from the subtracted cDNA library specific to 8+DC library were analyzed. Most of them are known proteins, but some of them were novel, either totally novel genes or homologs to known genes, but with novel exon. About 55 probably novel exons were discovered, and 11 exons had longer length than those in gene bank. The clones 12, 44, 79, and 110 have no match with known sequences in gene bank. Then, semi-quantitative PCR was done to compare the expression of the enriched sequences between 8+DC and 8−DC. About 14 genes are differentially expressed in 8+DC. Therefore, SSH is an effective method to clone differentially expressed genes for 8+DC compared to 8−DC.     

低压缺氧延迟预适应小鼠海马差异表达基因的筛选及鉴定研究

目的：探索低压缺氧延迟预适应小鼠海马差异表达基因。 方法： 将近交系Babl/c小鼠放入减压舱，模拟海拔 7 000 m高度减压2.5 h/d，连续3 d。第3次减压毕36 h后，提取海马总RNA，SMART PCR合成cDNA，经抑制消减杂交，建立消减cDNA文库。随机挑取文库单克隆，用反向Northern杂交，分别对来自于正、反向文库的452个和74个克隆进行了筛选。 结果： 用消减探针筛选时，217个基因片段的杂交信号在延迟预适应海马增加2倍以上，85个基因片段的杂交信号则降低66%以下。用未消减探针筛选时，135个基因片段的杂交信号在延迟预适应海马增加2倍以上，44个基因片段的杂交信号则降低66%以下。对部分基因片段测序显示，小鼠线粒体细胞色素C氧化酶亚单位1、线粒体NADH脱氢酶亚单位1和6、小鼠DSS1和克隆号为IMAGE:3582855的基因在延迟预适应海马表达增加。克隆号为IMAGE: 3593193的基因、与成年雄性小鼠嗅脑的一个cDNA高度相似的基因及与小鼠bladder RCB-0544 MBT-2 cDNA高度相似的基因在延迟预适应海马表达降低。 结论： 小鼠海马低压缺氧延迟预适应多种基因表达发生改变，它们可能是产生低压缺氧延迟预适应的重要机制之一。     

淡色库蚊性别差异表达cDNA文库的构建和分析

目的为探讨媒介与病原、媒介与宿主的相互作用，建立传播疾病的淡色库蚊性别差异表达cDNA文库。从而筛选阻断疾病传播的疫苗候选分子。方法以淡色库蚊雌蚊成蚊为检测方（Tester）、雄蚊成蚊为驱动方（Driver），进行正向抑制性消减杂交；以雄蚊成蚊为Tester、雌蚊成蚊为Driver，进行反向抑制性消减杂交。将获得的正向抑制性消减杂交产物克隆入pGEM-T easy vector，并以菌液PCR扩增鉴定插入片段。随机抽取100个阳性克隆进行DNA序列分析，并将所得ESTs序列进行在线BLAST分析。结果从100个阳性克隆中测得98个ESTs序列，在测定的序列中与已知基因具有同源性的有57个，其余41个ESTs与已知基因不具有同源性。结论抑制性消减杂交技术建立雌蚊特异性基因文库，发现了淡色库蚊雌蚊新的ESTs序列，为性别相关基因的功能及性别调控。探讨媒介与病原、媒介与宿主的相互作用及其筛选传播阻断疫苗候选分子的研究奠定了基础。     

热适应差异表达基因消减文库的筛选

目的：研究热适应大鼠的肝细胞基因差异表达，探讨热适应的分子机制。 方法： 构建热适应差异表达基因消减文库［1］，扩增并克隆T/A载体形成重组质粒，转化感受态细胞后分离获得目的基因，采用PCR-select differential screening技术筛选差异表达基因，测序后所得序列与GenBank中的已知序列进行比对，确定其可能的功能。 结果： 确认8个上调表达基因，与GenBank中已知序列进行比较，证实其中有3种已知基因，5个新序列表达标签（EST）。 结论： 相关基因表达水平上调可能参与生物体热适应的信号转导通路，而p53可能是热适应分子环路的又一节点。     

左侧视网膜剥夺鸽右视盖差异表达基因的克隆与鉴定

采用抑制消减杂交技术构建左侧视网膜剥夺后右视盖基因差异表达的文库 ,研究在无光刺激的条件下视盖发育受阻的分子机制。随机测序 2 1个序列 ,6个序列经反 Northern证实为真阳性 ,3个序列未发现明确的同源序列 ,另外 3个分别与 homosapiens SH3 GL2、G.domesticaus、 transthyretin有较高的同源性。 2 1个序列中 ,11个基因片段被分配序列号。这些结果为深入研究视觉发育提供了有益的线索     

丙型肝炎病毒非结构蛋白NS4A反式激活基因的克隆化研究

目的应用抑制性消减杂交（SSH）技术构建丙型肝炎病毒非结构蛋白4A（HCV NS4A）转染细胞差异表达cDNA消减文库，克隆HCV NS4A蛋白反式激活相关基因。方法以HCV NS4A表达质粒pcDNA3．1（-）-NS4A转染Hep G2细胞，以空载体pcDNA3．1（-）为对照，制备转染后的细胞裂解液，提取mRNA并逆转录为cDNA，进行SSH分析。将富集的二次PCR产物与TIA载体连接，并转染大肠埃希菌进行文库扩增，随机挑取克隆，聚合酶链反应（PCR）扩增后进行测序及同源性分析。结果文库扩增后得到36个阳性克隆，经菌落PCR分析显示200～1000bp插入片段。对其中的25个片段测序，并进行同源性分析，显示18种已知基因编码蛋白和2种未知功能基因序列，包括一些与细胞周期、细胞凋亡、信号传导及肿瘤发生等细胞生长调节密切相关的蛋白编码基因，可能是NS4A反式激活靶基因。结论成功构建了HCV NS4A反式激活基因差异表达的cDNA消减文库，为进一步阐明HCV NS4A反式调节的靶基因等提供了相关的平台。