携带G487T和T916C的白念珠菌ERG 11及外流泵基因表达与氟康唑耐药的关系

目的:检测携带相同突变的耐氟康唑白念珠菌多个耐药基因的表达。方法:选取耐氟康唑白念珠菌14株(均携带相同的ERG11突变G487T和T916C),氟康唑敏感白念珠菌14株,通过实时定量PCR反应检测两组多个耐药基因的表达。结果:14株携带相同突变的耐氟康唑白念珠菌主动外排基因CDR1和CDR2 mRNA表达较敏感组显著增加(P0.01);而ERG11、FLU1和MDR1基因mRNA水平较敏感株表达无明显差异(P0.05)。结论:携带G487T和T916C突变的白念珠菌的耐氟康唑机制可能与主动外排泵基因CDR1和CDR2的高表达密切相关。     

汉防己甲素对氟康唑抗白念珠菌活性的增效作用

目的 探讨体外汉防己甲素对氟康唑抗白念珠菌活性是否有增效作用.方法 参照微量稀释法确定汉防己甲素对白念珠菌的非细胞毒性剂量,并测定氟康唑单独及联合汉防己甲素时对16株白念珠菌的MIC.结果 在终质量浓度≤40μg/ml汉防己甲素的作用下,白念珠菌的存活率>95%.其中汉防己甲素(30～40μg/mL)可抑制白念珠菌菌丝相形成.氟康唑单独作用时,对16株白念珠菌的MIC值为0.250～64μg/mL;与汉防己甲素(40μg/mL)联合时,氟康唑对受试菌的MIC值降至0.125～16μg/mL,且终点清晰,“拖尾现象”消火.结论 汉防己甲素在体外对氟康唑的抗白念珠菌活性有增效作用.     

白念珠菌临床株多药耐药蛋白基因表达与氟康唑耐药的关系

目的 探讨临床分离白念珠菌氟康唑耐药株/敏感株多药耐药蛋白基因CDR1、CDR2、MDR1的表达情况。方法 试剂盒法抽提白念珠菌氟康唑耐药株/敏感株的总RNA后，逆转录成cDNA，采用实时定量PCR技术观察白念珠菌多药耐药蛋白基因的表达。结果 白念珠菌耐药株组CDR2基因的△CT值为7.52 ± 2.53，敏感株组为9.28 ± 3.15，两组比较，t = 2.37，P ＜ 0.05，耐药株的表达量要高于敏感株。结论 白念珠菌CDR2基因的高表达与氟康唑耐药有关。     

白念珠菌临床株FLU1基因表达与氟康唑耐药的关系

近年来,深部真菌感染发生率逐渐增高,其中以白念珠菌(Candida albicans)的感染最为常见.由于氟康唑的生物利用度高(>90%),不良反应小,常被作为首选药物,广泛用于念珠菌感染的预防和治疗.随着氟康唑的长期、大量使用,念珠菌耐药性的问题日益突出.白念珠菌主要耐药机制包括,细胞对药物外排能力的不断增强、药物作用靶点编码基因突变或高度表达等.本研究针对编码药物外排泵蛋白的FLU1基因,采用实时定量PCR技术检测白念珠菌氟康唑耐药株和敏感株的FLU1基因的表达差异,初步探讨FLU1基因表达与氟康唑耐药的关系.     

外排泵基因在白念珠菌生物膜耐药性产生中的作用

目的观察白念珠菌在生物膜形成不同时期对氟康唑的敏感性,及外排泵基因在生物膜耐药性产生过程中的作用。方法采用96孔微量培养皿进行白念珠菌生物膜的培养,用MTT法检测其对氟康唑的敏感性,并用半定量RT-PCR法测定生物膜形成不同时期CDR1、CDR2及MDR1基因表达的差异性。结果白念珠菌生物膜在较早期(2h)对氟康唑仍然敏感(2～4μg/mL),随着白念珠菌生物膜的不断成熟,其耐药性不断增高;CDR1及CDR2基因在生物膜形成的早中期及成熟期的表达明显上调,尤其早期的高表达更为明显,而MDR1基因的表达只在生物膜形成早期有明显的高表达。结论白念珠菌生物膜的耐药性随着其结构的成熟而不断增高;CDR1,CDR2及MDR1基因在生物膜形成早期有明显的高表达,但与生物膜耐药性的增加并不一致。因此,生物膜的耐药性可能是多种机制作用的结果。     

白念珠菌506株对氟康唑和伊曲康唑的体外药敏试验

目的了解白念珠菌临床株对氟康唑和伊曲康唑的体外药物敏感性。方法收集鉴定白念珠菌临床株,采用美国国家临床实验室标准化研究所CLSI(即以前的NCCLS)推荐的M27-A2微量肉汤稀释法,进行氟康唑和伊曲康唑的MIC值测定。结果共收集白念珠菌506株,检测出氟康唑耐药株3株,剂量依赖性敏感株1株,耐药率为0.59%;伊曲康唑耐药株18株,剂量依赖性敏感株269株,耐药率为3.56%;其中1株对氟康唑和伊曲康唑交叉耐药。结论白念珠菌对唑类药物有耐药及交叉耐药现象的发生;伊曲康唑耐药率高于氟康唑。     

微量稀释法测定白念珠菌对氟康唑的MIC值及两种药敏试验的比较

目的: 测定临床分离白念珠菌对氟康唑的耐药.方法: 应用1997年美国临床和实验室标准化研究院(CLSI)推荐的微苗稀释法(M27-A)对我科真菌实验室分离保存的120株白念珠菌进行了氟康唑的体外药物敏感试验,并对药敏结果进行分析.结果: 120株白念珠菌中73株对氟康唑敏感,13株剂量依赖敏感,34株耐药.结论: 白念珠菌对氟康唑的敏感性下降,可能与氟康唑的广泛应用有关.     

白念珠菌经汉防己甲素作用前后的差异蛋白质组学分析

目的 研究汉防己甲素对白念珠菌蛋白质表达的影响,寻找汉防己甲素作用相关蛋白质.方法 以白念珠菌氟康唑敏感株CA-3为研究对象,常规培养白念珠菌,实验分两组,分别为不加药的CA-3组及加汉防己甲素(终浓度为250 mg/L)的CA-3组,汉防己甲素作用6 h后收集细胞,提取两组样本的总蛋白质,运用固相pH梯度双相凝胶电泳分离,Image Master 2D Platinum软件分析蛋白图谱的差异,以经基质辅助激光解吸电离飞行时间串联质谱(MALDI-TOF/TOF-MS)对蛋白质进行质谱鉴定.结果 成功建立汉防己甲素作用前后白念珠菌敏感株蛋白质双相凝胶电泳图谱,图像重复性好.图像分析出差异蛋白质26个,最终质谱鉴定出差异蛋白质7个,其中上调蛋白质1个,为Pst1;下调蛋白质6个,分别为Idh1、Asc1、Rps5、Asn1、Asn1、Srb1.结论 汉防己甲素作用于白念珠菌敏感株前后蛋白质有差异,Pst1、Idh1、Asc1、Rps5、Asn1、Asn1、Srb1在汉防己甲素对白念珠菌作用中起重要作用.

Abstract：

Objective To study the effects of tetrandrine on the protein expression profile of C. albicans,and to screen for proteins associated with the effect of tetrandrine. Methods Fluconazole-sensitive C. albicans CA-3 was cultured with or without tetrandrine (250 mg/L) for 6 hours followed by the collection of Candida cells. Total proteins were extracted from these cells and separated by using immobilized pH gradient two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis. Protein spots were detected and analyzed by Image Master 2D Platinum software, and MALDI-TOF/TOF-MS-based method was used to identify these proteins. Results The two-dimensional gel electrophoresis maps of C. albicans proteins before and after the treatment with tetrandrine were successfully obtained with high repeatability. Image analysis revealed a total of 26 differentially expressed protein spots in C. albicans treated with tetrandrine, and 7 differentially expressed proteins were identified by the mass chromatographic analysis, including 1 up-regulated protein (Pst1), and 6 down-regulated proteins (Idh1,Asc1, Rps5, Asn1, Asn1, Srb1 ). Conclusions The expressions of some proteins in fluconazole-sensitive C. albicans experience significant changes after tetrandrine treatment, and Pst1, Idh1, Asc1, Rps5, Asn1, Asn1 and Srb1 may considerab1y contribute to the effects of tetrandrine on C. albicans.     

常见致病真菌唑类耐药基因研究进展

随着唑类抗真菌药物在临床的广泛应用,耐药现象日益突出.真菌耐药基因突变或表达水平的改变是对唑类耐药的主要原因之一,也一直是国内外关注的热点.参与真菌唑类耐药的基因主要涉及影响麦角甾醇合成途径的相关基因,如ERG11、ERG3;药物外排蛋白相关基因,如编码ABC蛋白的CDR基因、编码MFS泵的MDR基因、钙调神经磷酸酶通路的靶基因RTA2基因.然而,一些基因是否介导真菌唑类耐药仍存在争议或证据不足,如白念珠菌的FLU1基因、光滑念珠菌的ERG11基因.不同类型真菌唑类耐药的主导基因也有差异.     

RVVC白念珠菌氟康唑敏感株和耐药株对外周血DC_s分化成熟的影响

目的 探讨复发性外阴阴道念珠菌病(RVVC)患者阴道白念珠菌对氟康唑敏感情况及其对人外周血单核细胞源树突状细胞(DCs)形态及表面分子的影响。方法 科玛嘉念珠菌显色培养基及芽管试验分离、鉴定白念珠菌;MIC法判断敏感菌及耐药菌;体外培养正常人外周血单核细胞源DCs,实验组以不同剂量氟康唑敏感菌悬液、耐药菌悬液刺激,对照组以同等剂量标准菌悬液刺激后,倒置显微镜观察细胞形态变化,流式细胞仪检测细胞表面分子的表达。结果 RVVC患者阴道分泌物共分离出白念珠菌108株,其中对氟康唑敏感67株(62.04%),耐药41株(37.96%);各实验组与对照组DCs细胞形态无明显差别。DCs表面分子CD80,CD86表达量均与白念珠菌悬液剂量呈正相关;加入标准菌株悬液的对照组DCs表面分子CD80,CD86表达明显高于同等剂量加入敏感菌悬液和耐药菌悬液的实验组,且加入敏感菌悬液的实验1组DCs表面分子CD80,CD86表达明显高于同等剂量加入耐药菌悬液的实验2组。结论 在一定剂量范围内,白念珠菌可促进DCs表面分子CD80,CD86表达,使DCs进一步成熟,氟康唑敏感菌株优于耐药菌株,但两者均不及标准菌株。     

白念珠菌ERG11基因启动子部分序列分析

目的 探讨白念珠菌菌丝相与酵母相ERG11基因启动子部分(-440～-1)碱基序列的差异以及ERG11基因启动子突变与白念珠菌对氟康唑敏感性的关系。方法 分别提取从同一亲本来源、对氟康唑敏感性不同的白念珠菌菌丝相与酵母相基因组DNA,根据ERG11基因启动子序列及其编码序列设计一对引物,对ERG11基因上游启动子部分碱基序列(-503～53)进行PCR扩增,经PCR产物直接测序比较白念珠菌菌丝相与酵母相ERG11基因启动子序列(-440～-1)的差异以及对氟康唑敏感性不同的白念珠菌ERG11基因启动子序列的差异。结果 白念珠菌菌丝相与酵母相ERG11启动子序列未发现差异。氟康唑敏感株白念珠菌ERG11基因启动子的-365,-353,-328,-310,-308,-299,-295,-293,-292,290,-289位点为杂合状态,且在-284位点有一等位基因发生单碱基缺失(-284delT);而在白念珠菌氟康唑剂量依赖性敏感和耐药株上述杂合现象消失。结论 白念珠菌菌丝相与酵母相ERG11基因启动子-440～-1区碱基序列无差异;ERG11基因启动子突变可能与白念珠菌对氟康唑耐药有关。     

浅部与深部感染来源白念珠菌氟康唑耐药株药物敏感性及耐药基因突变比较

【摘要】 目的 比较浅部、深部感染来源的氟康唑耐药白念珠菌体外对8种抗真菌药物的敏感性及耐药基因突变。方法 26株深部感染来源白念珠菌耐药株、33株浅部感染来源白念珠菌耐药株,参照CLSI酵母菌检测方案M27-A4测定上述菌株对氟康唑、伏立康唑、伊曲康唑、泊沙康唑、两性霉素B、氟胞嘧啶、特比萘芬、米卡芬净8种药物单独或联合的体外敏感性。提取所有耐药菌株DNA,通过PCR检测ERG3、ERG11、FUR1 3种耐药基因的突变情况。满足正态分布和方差齐性检验的定量资料两组间比较采用独立样本t检验,不满足者组间比较采用Mann-Whitney U检验,定性资料组间比较采用卡方检验。结果 氟康唑、伊曲康唑、伏立康唑、泊沙康唑、氟胞嘧啶的最小抑菌浓度（MIC）在浅部感染组和深部感染组间差异均有统计学意义（均P＜0.05）,而两性霉素B、米卡芬净的MIC两组间差异无统计学意义（均P > 0.05）。96.6%的菌株特比萘芬MIC值＞64 μg/ml,无法进行组间对比。15株白念珠菌（7株深部感染来源、8株浅部感染来源）特比萘芬 + 唑类（氟康唑、伏立康唑、伊曲康唑、泊沙康唑）联合药敏试验均显示为协同效应,部分抑菌浓度（FIC）指数0.033～0.187;氟胞嘧啶 + 唑类、氟胞嘧啶 + 两性霉素B、两性霉素B + 氟康唑组合均无明显协同作用,FIC指数0.56～1.125。浅部感染来源白念珠菌ERG3基因突变包括错义突变V351A（33株,100%）,深部感染来源白念珠菌包括错义突变V351A（13株,50%）、A353T（4株,15%）;浅部感染来源白念珠菌ERG11基因突变包括错义突变I437V（32株,97%）、Y132H（23株,70%）、T123I（16株,48%）、K128T（6株,18%）、D116E（5株,15%）、A114S（4株,12%）、E266D（2株,6%）、G448E（2株,6%）、G465S（2株,6%）,深部感染来源白念珠菌包括I437V（23株,88%）、E266D（13株,50%）、E260G（5株,19%）、V488I（4株,15%）;浅部感染来源白念珠菌 FUR1基因突变包括错义突变R101C（11株,33%）,深部感染来源白念珠菌未检出错义突变。结论 浅部与深部感染来源白念珠菌氟康唑耐药株对药物的敏感性及基因突变位点均有所差别。     

阿萨希毛孢子菌对氟康唑耐药性的体外诱导及其稳定性研究

【摘要】 目的 探讨体外以浓度梯级倍增的氟康唑诱导不同来源阿萨希毛孢子菌（T.asahii）获得耐药子代,并观察它们的耐药稳定性。 方法　保存的11株T.asahii中筛选出的氟康唑MIC值较低的临床分离株CBS2479及环境分离株CBS8904,在含氟康唑浓度梯级倍增的PDA固体培养基中分别传代培养,每次转种前均用E-test法测定氟康唑对其MIC值,直至其 ＞ 256 μg/ml;选用氟康唑MIC值 ＞ 256 μg/ml的耐药菌株CBS2479R/CBS8904R分别在不含氟康唑的PDA培养基中连续传代培养,并监测每代菌株MIC值,观察其耐药稳定性。 结果 氟康唑MIC值分别为0.25 μg/ml及1.5 μg/ml的T.asahii CBS2479/CBS8904均被成功地诱导为氟康唑MIC值 ＞ 256 μg/ml的耐药子代菌株CBS2479R/CBS8904R;将其在不含氟康唑PDA培养基中连续传代18 d,CBS2479R氟康唑MIC值未见下降;CBS8904R氟康唑MIC值逐渐下降,至第18天时降为64 μg/ml。 结论　氟康唑在体外能诱导不同来源的T.asahii均对其产生耐药性,不同来源的T.asahii其耐药子代的稳定性不同。 【关键词】 阿萨希毛孢子菌; 氟康唑; 抗药性     

光滑假丝酵母菌耐药基因CDR1、CDR2、SNQ2表达的研究

目的:探讨光滑假丝酵母菌耐三唑类抗真菌药物临床株耐药基因表达情况.方法:34株复发性外阴阴道假丝酵母菌病的临床分离株,通过265 rDNA D1/D2区分子鉴定为光滑假丝酵母菌,应用法国生物梅里埃酵母菌药敏试剂盒ATBTM FUNGUS3,进行体外药物敏感性试验.实时荧光定量PCR方法检测34株菌株耐药基因CDR1、CDR2、SNQ2表达量.结果:34株光滑假丝酵母菌中,有2株为敏感株,2株对ITR剂量依赖敏感,30株为耐药株,且呈现交叉耐药现象.对氟康唑(FCA)、伊曲康唑(ITR)、伏立康唑(VRC)抗真菌药物的耐药率分别为26.32％、86.84％、34.21％.耐药株CDR1、SNQ2基因表达明显高于敏感株(P＜0.0005),CDR2表达量无差别(P＞0.05).结论:光滑假丝酵母菌对三唑类药物MIC值高,其药物敏感性低与耐药基因CDR1、SNQ2的过度表达有关.     

临床分离白念珠菌ERG4基因高表达与唑类抗真菌药物耐药的关系

目的 探讨临床分离白念珠菌ERG4基因高表达与唑类抗真菌药物耐药的关系。 方法 M27-A2微量肉汤稀释法对34株临床分离白念珠菌菌株进行体外药物敏感性试验。抽提白念珠菌ERG4基因的总RNA,并逆转录合成cDNA,采用实时荧光定量PCR（FQ-RT-PCR）方法检测ERG4基因mRNA表达水平。结果 白念珠菌耐氟康唑菌株组ERG4基因表达量（4.20 ± 2.56）高于敏感组（1.72 ± 1.33）（t = 3.99,P < 0.05）;耐伊曲康唑组（3.60 ± 2.47）高于敏感组（1.66 ± 1.61）（t = 3.71,P < 0.05）;耐伏立康唑组（3.99 ± 2.72）高于敏感组（2.07 ± 1.58）（t = 2.91,P < 0.05）;对氟康唑、伊曲康唑、伏立康唑同时耐药菌株组（4.49 ± 2.73）显著高于敏感组（1.69 ± 1.82）（t = 3.81,P < 0.05）。 结论 临床分离白念珠菌耐药菌株ERG4基因高表达与氟康唑、伊曲康唑和伏立康唑耐药及交叉耐药有关,但白念珠菌ERG4基因高表达在耐药中的作用还有待于通过基因下调进一步研究证实。     

白念珠菌对氟康唑耐药的差异性膜蛋白质组学分析

目的 鉴定并分析白念珠菌氟康唑敏感株与耐药株的差异表达膜蛋白质。 方法 以同一亲本来源的白念珠菌氟康唑敏感株CA-3和耐药株CA-16为研究对象,以双向聚丙烯酰胺凝胶电泳（2D-PAGE）技术分析菌株之间膜蛋白图谱的差异,以基质辅助激光解吸电离飞行时间串联质谱（MALDI-TOF/TOF-MS）鉴定表达差异的蛋白质,通过白念珠菌蛋白质数据库进行检索分析。结果 白念珠菌氟康唑耐药株较敏感株有22种差异表达蛋白质点,其中有6种蛋白质上调,为Adh1p、Csp37p、Pgk1p、Pgk1p和2个未命名蛋白质（gi227305312、gi53954641）;16种蛋白质下调,分别为Aco1p、Aco1p、Hsp78p、Gut2p、Sdh12p、Ilv2p、Ndh51p、Ndh51p、Atp1p、Pda1p、Srb1p、Idh1p、Tdh1p、Cyt1p、Cox4p、Cox13p。结论 白念珠菌氟康唑耐药株较敏感株差异膜蛋白主要涉及能量代谢、线粒体功能等。 【关键词】 念珠菌,白色; 氟康唑; 抗药性,真菌; 膜蛋白质类; 蛋白质组学     

耐氟康唑的白念珠菌对常见抗真菌药物的敏感性检测

目的测定耐氟康唑白念珠菌对常见抗真菌药物的敏感性,并探讨pH值对微量液基稀释法的影响。方法参照美国临床实验室标准研究所(CLSI)颁布的酵母菌抗真菌药物敏感性试验方案M27-A2,测定氟康唑(FLC)、伏立康唑(VOR)、伊曲康唑(ITC)、两性霉素B(AMB)和米卡芬净(MCFG)的最小抑菌浓度(MIC),并调整RPMI-1640液体培养基的pH值至4.5,测定FLC、VOR和ITC的MIC值。结果FLC的MIC值均>64μg/mL;VOR的MIC值,6株菌>16μg/mL,1株为2μg/mL,3株<1μg/mL;ITC的MIC值,7株≥1μg/mL,3株为0.25～0.5μg/mL;MCFG的MIC值为0.125～0.25μg/mL,AMB的MIC值为1～2μg/mL;使用pH值为4.5的RPMI-1640液体培养基,5种抗真菌药物的MIC值变化不明显。结论10株耐氟康唑的白念珠菌对MCFG均敏感,部分菌株对VOR和(或)ITC交叉耐药;部分耐FLC的白念珠菌对AMB的敏感度有所降低。降低RPMI-1640的pH值,可明显减少拖尾现象,但不影响药敏结果的判定。     

Vulvovaginal carriage of yeasts other than Candida albicans

AIMS: We investigated the spectrum of yeasts isolated, and compared the epidemiological and laboratory characteristics of women carrying vulvovaginal Candida albicans with those carrying yeasts other than C. albicans. METHOD: Between April and June 2001, 5802 consecutively received genital swabs from women were plated onto Candida ID chromogenic media (BioMerieux). Blue colonies were reported as C. albicans; all other colonies (white and pink) were identified to species level using the Vitek YBC card (BioMerieux). In vitro susceptibility to amphotericin (AMB), fluconazole (FLU), itraconazole (ITZ), and voriconazole (VOR) was determined for approximately 40% of non-C. albicans yeasts using a standardised microdilution method. RESULTS: Yeast was isolated from 1221 women (21%). Of these, C. albicans only was isolated from 1087 (89%) and yeasts other than C. albicans from 129 (11%) women. C. glabrata comprised 89 (69%) of the latter. Women in whom other yeasts were recovered were older than those with C. albicans (mean 43, versus 33 years, p <0.001). All isolates tested (n=53) were susceptible to AMB and VOR. Seven (24%) C. glabrata strains were susceptible to FLU with 21 (72%) testing susceptible-dose dependent. CONCLUSION: Yeasts other than C. albicans are common vaginal isolates even in a primary care population. The species isolated are less susceptible to FLU than most C. albicans.