乙型肝炎病毒X蛋白表达及其对HepG2细胞凋亡的影响

目的探讨HBV X蛋白表达对转染x基因HepG2细胞的影响。方法构建真核表达质粒pCDNA3．1（＋）／x，磷酸钙沉淀法转染到人肝癌细胞株HepG2；Western—blot检测X蛋白表达；流式细胞仪检测细胞周期和凋亡率；MTT法测定细胞活力。结果磷酸钙沉淀法能有效的导入X基因且Western—blot能检测到X蛋白表达；MTT法、流式细胞术结果显示X蛋白表达组细胞活力受抑制（P≤0．01），凋亡率增加（P≤0．01）。结论HBV感染及其相关慢性肝病中，X蛋白的表达可能与肝细胞凋亡，炎症活性相关。     

HBV X基因对肝癌细胞生物学行为的影响

目的:构建可表达HBV X基因的重组腺病毒,观察HBV X基因对肝细胞生物学行为的影响。方法:构建可表达HBV X基因的重组腺病毒Ad-X及空病毒Ad0;重组腺病毒感染HepG2细胞,应用MTT、平板克隆形成试验、流式细胞术、TUNEL等方法观察HBV X基因对肝细胞生物学行为的影响。结果:与HepG2组和Ad0组相比,Ad-X组细胞生长速度较快,其克隆形成率高于对照组,流式细胞分析显示Ad-X感染可加快HepG2细胞G1→S期细胞周期进程;Ad-X组细胞凋亡指数低于HepG2组及Ad0组,Ad-X感染HepG2细胞后可诱导c-myc mRNA的表达。结论:Ad-X可促进HepG2细胞的增殖并抑制其凋亡。     

肝细胞癌中BTG2基因的表达及其对肝细胞癌细胞增殖和凋亡影响的研究

目的　研究肝细胞癌中BTG2基因的表达以及BTG2基因对肝细胞癌HepG2细胞增殖和凋亡的影响。　方法　　荧光定量PCR测定47例肝细胞癌组织中BTG2基因的表达情况。构建表达载体pcDNA-BTG2,转染HepG2细胞。转染后,蛋白质印迹法检测转染后BTG2蛋白的表达,MTT法测定细胞生长抑制率,双标流式细胞法检测细胞凋亡率。　结果　　与癌旁组织相比,BTG2 mRNA在肝细胞癌组织中表达明显下调（P<0.01）。且BTG2的表达与肝细胞癌的分级相关,随着分化程度的升高呈逐渐增加的趋势,但与肝细胞癌的分期及淋巴结转移、远处转移无关。转染表达载体pcDNA-BTG2能够显著上调HepG2细胞中BTG2蛋白的表达,同时,细胞生长抑制率及凋亡率明显增加（P<0.01）。　结论　　在肝细胞癌中BTG2基因表达下调,其表达上调能够抑制肝癌细胞增殖并促进凋亡。     

HBV X基因转染L02细胞及其蛋白产物对CⅡTA和HLA-DR表达的影响

目的探讨脂质体和电穿孔法在HBV X基因转染L02细胞中的差别及X基因蛋白产物对CⅡTA和HLA-DR表达的影响。方法构建HBV X基因重组表达质粒,通过电穿孔和脂质体法转染人正常肝细胞L02细胞,以绿色荧光蛋白(enhance green fluorescent protein,EGFP)表达水平评价转染效率,流式细胞技术检测L02细胞HBV X蛋白的表达水平。RT-PCR、流式细胞技术及western-blot分析L02细胞、转染空载体以及转染HBV X基因重组表达质粒的L02细胞CⅡTA和HLA-DR的表达差别。结果采用阳离子脂质体Lipofectamine 2000的转染效率为(6.4±3.5)%,显著低于电穿孔法(41.46±5.8)%,P<0.01。脂质体法转染的L02细胞HBV X蛋白表达水平为(5.1±3.9)%,显著低于电穿孔方法(37.5±4.1)%表达,P<0.01。转染了HBV X基因重组表达质粒的L02细胞检测到CⅡTA和HLA-DR mRNA和蛋白表达,而L02细胞本身及转染空载体的L02细胞未检测到CⅡTA和HLA-DR的表达。结论 HBV X基因真核表达载体pHBx-IRES2-EGFP通过电穿孔法转染L02细胞较脂质体法有明显较高的转染效率和更高的目的基因的表达,HBV X基因诱导了L02细胞中CⅡTA和HLA-DR的表达。     

表面标志物Cripto-1表达对食管癌干细胞生长的作用机制研究

目的:探讨表面标志物Cripto-1(CR-1)的表达对食管癌干细胞生长的作用机制.方法:自食管癌Eca109细胞中分选Eca109干细胞,提取正常食管上皮细胞HEEC和Eca109细胞、Eca109干细胞总蛋白,采用Western-blot法检测CR-1表达水平;构建CR-1基因沉默载体CNE2/CR-1 -及过表达载体CNE1/CR-1 +,利用脂质体转染法将CNE2/CR-1 -和CNE1/CR-1 +分别转染进Eca109干细胞中,并设对照组,采用RT-PCR法检测CR-1表达;MTT法检测对照组、CNE2/CR-1 -组、CNE1/CR-1 +组Eca109干细胞增殖情况;流式细胞仪检测各组Eca109干细胞凋亡情况;Western-blot法检测各组细胞Akt、p-Akt蛋白表达情况.结果:Eca109细胞及Eca109干细胞中CR-1表达均明显高于HEEC(P<0.01).RT-PCR结果显示,CNE2/CR-1 -组CR-1表达水平明显低于对照组,CNE1/CR-1 +组明显高于对照组(P<0.01).MTT结果显示,CNE2/CR-1 -组细胞增殖明显低于对照组,CNE1/CR-1 +组明显高于对照组(P<0.01).流式细胞仪检测显示,CNE2/CR-1 -组细胞凋亡率明显高于对照组, CNE1/CR-1 +组细胞凋亡率明显低于对照组(P<0.01).Western-blot结果显示,CNE2/CR-1 -组p-Akt蛋白表达明显低于对照组,CNE1/CR-1 +组p-Akt蛋白表达明显高于对照组(P<0.01);而Akt蛋白表达未出现明显变化(P>0.05).结论:CR-1作为潜在的食管癌干细胞标记物,可能通过PI3K/Akt信号通路调控食管癌干细胞的增殖与凋亡.     

PEG-PEI／Fe3O4纳米磁流体-TK对肝癌细胞HepG2凋亡的影响

目的:探讨PEG-PEI/Fe3O4纳米磁流体-TK对肝癌细胞HepG2凋亡的影响.方法:构建重组质粒PEGFP-AFP-TK并通过纳米磁流体分别转染入AFP表达阳性的肝癌细胞HepG2及AFP表达阴性的肝癌细胞SMMC7721.转染12 h后,于荧光显微镜下动态观察;48 h后,RT-PCR和Western blot分析HepG2细胞巾HSV-TK基因的表达情况,用MTT法检测HepG2细胞的存活,用流式细胞分析HepG2细胞的凋亡.结果:纳米磁流体能将重组质粒PEGFP-AFP-TK转入HepG2细胞,并且其转染效率高于脂质体;RT-PCR及Western blot证明转染的HepG2细胞有HSV-TK基因的表达;MTT及流式细胞分析说明HSV-TK基因发挥杀伤细胞作用.结论:纳米磁流体能将重组质粒PEGFP-AFP-TK转染HepG2细胞并获得表达,PEG-PEI/Fe3O4纳米磁流体-TK可显著抑制HepG2细胞增殖,可望成为肝癌基因治疗的新型生物制剂之一.     

乙型肝炎病毒X基因在HepG2肝癌细胞的转染及对Fas/FasL表达的影响

目的探讨乙型肝炎病毒(HBV)X基因在HepG2肝癌细胞中的转染及对Fas/FasL表达的影响.方法用分子克隆方法构建HBV X真核表达载体pcDNA3-X,用脂质体转染方法瞬时转染HepG2细胞,以转染空载体pcDNA3的HepG2细胞及未转染质粒的HepG2为对照,抽提RNA,进行RT-PCR,检测HBV X基因的表达.以β-actin为内参,用半定量RT-PCR法检测三组细胞凋亡相关基因Fas/FasL mRNA相对表达量的变化.结果重组真核表达载体经RT-PCR及DNA测序均检测出HBV X特异性片段,pcDNA3-X转染HepG2细胞后,RT-PCR扩增出HBV X片段,空质粒组及正常对照组均未扩增出相应片段.转染HBx的细胞Fas与FasL mRNA相对表达量较转染空质粒组和未转染质粒组明显增高,差别有统计学意义(P＜0.05).结论成功构建HBV X真核表达载体pcDNA3-X,转染入HepG2肝癌细胞,并在该细胞中表达.HBx在肝癌细胞中的表达能上调Fas和FasL基因的表达.     

重组质粒pEGFP-N2/XPD和Pifithrin-α对肝癌细胞增殖及凋亡的影响

目的 探讨人着色性干皮病基因D(xeroderma pigmentosum D,XPD)和P53对肝癌细胞HepG2.2.15增殖凋亡及P21等基因表达的影响.方法 用脂质体转染法将空载质粒pEGFP-N2和重组质粒pEGFP-N2/XPD转染HepG2.2.15,然后给予20 μmol/L的Pifithrin-α(P53抑制剂)孵育24 h.实验分为5组:空白对照组、pEGFP-N2组、pEGFP-N2/XPD组、pEGFP-N2/XPD+Pifithrin-α组和Pifithrin-α组.用荧光显微镜观察绿色荧光蛋白报告基因表达情况;用RT-PCR和Western blot检测XPD、P53、磷酸化P53(phosphorylated P53,p-P53)、P21和乙型肝炎病毒X蛋白(hepatitis B virus X protein,HBx)的表达;用MTT法检测细胞活力;用流式细胞仪检测凋亡率.结果 在荧光显微镜下,可在转染了空载质粒pEGFP-N2和重组质粒pEGFP-N2/XPD的细胞中观察到绿色荧光,即转染成功;RT-PCR和Western blot检测发现,重组质粒pEGFP-N2/XPD的转染使XPD表达增高(P＜0.001);XPD表达升高使P53、p-P53(ser-15)、P21表达增高,同时使得HBx表达降低,而Pifithrin-α能抑制XPD这一作用(P＜0.001).MTT结果显示,XPD表达升高抑制了细胞活力,而Pifithrin-α能抑制XPD减弱细胞活力的作用(P＜0.001).流式细胞仪结果显示,XPD表达增高引起了细胞凋亡率增加,而Pifithrin-α能抑制XPD诱导细胞凋亡的作用(P＜0.001).结论 XPD能通过P53通路抑制肝癌细胞增殖并促进其凋亡,上调P21的表达以及下调HBx的表达.     

转染过氧化氢酶-过氧化物酶基因对H2O2诱导PC12细胞凋亡的保护作用

目的观察转染过氧化氢酶-过氧化物酶(CPX)基因对过氧化氢(H2O2)诱导细胞凋亡的保护作用.方法以CPX基因转染PC12细胞,用遗传霉素(G-418)筛选出含目的基因的单克隆细胞系.以RT-PCR法检测CPX基因mRNA的表达,用免疫细胞化学、酶活性测定技术检测目的蛋白的表达;用H2O2处理细胞,观察其抗凋亡的能力;通过电镜、DNA片段化的测定、MTT比色微量分析及流式细胞凋亡率分析观察转基因后对H2O2诱导细胞凋亡的保护作用.结果用H2O2处理细胞,未转染CPX基因的PC12细胞出现凋亡的特征性形态学改变,电泳可见断裂的DNA片段;流式细胞仪检测细胞凋亡率较转染组明显增加;MTT比色微量分析显示细胞活力下降(均P<0.01).而转染CPX基因的PC12细胞以上改变均不明显,形态学接近正常,细胞凋亡的各项指标均明显改善.结论转染CPX基因能保护H2O2所致的神经细胞凋亡.     

辣椒素对肝癌HepG2细胞凋亡的诱导作用

目的:探讨辣椒素对肝癌HepG2细胞生长抑制及凋亡诱导作用的机制。方法:以100、200、400μmol/L浓度辣椒素处理肝癌HepG2细胞后分别培养12、24、48 h,MTT法测定细胞增殖抑制率;TUNEL法检测细胞凋亡;Western Blotting检测凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax、Bad的表达。结果:随着作用浓度及时间增加,经辣椒素处理的肝癌HepG2细胞增殖活性明显降低(P<0.01);抑制率均显著增加,呈浓度和时间依赖性(P<0.01);HepG2细胞凋亡率也随辣椒素浓度增加而上升;凋亡相关蛋白Bcl-2表达下降,Bax、Bad表达上升(P<0.05)。结论:辣椒素对肝癌HepG2细胞具有增殖抑制和诱导凋亡作用,其机制可能与调节凋亡相关蛋白有关。     

乙型肝炎病毒对肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体诱导凋亡的影响及其机制

目的：研究乙型肝炎病毒（HBV）转染后,细胞对肿瘤坏死因子（TNF）相关的凋亡诱导配体（TRAIL）诱导 的凋亡的敏感度变化及作用机制。通过人肝癌细胞HepG2及转染了HPV全基因组的HepG2.2.15细胞对TRAIL诱导凋亡的敏感度研究,探讨HBV感染对细胞凋亡的影响及其机制。方法：流式细胞仪检测TRAIL诱导的凋亡反应和细胞表面TRAIL蛋白的表达,酶联免疫吸附试验检测细胞培养上清液中分泌型TRAIL蛋白质的表达,半定量逆转录聚合酶链反应检测TRAIL受体和其转导通路中凋亡拮抗分子FLIP的表达。结果：HepG2和HepG2．2．15对TRAIL诱导的凋亡率分别为51．60％和9．12％。与HepG2相比,HepG2．2．15细胞表面TRAIL蛋白质及其受体的表达都有不同程度的下调,而抵抗细胞凋亡的分子－FLI的表达却显著上调（P＜0．01）,两细胞系上清中分泌型TRAIL的表达量差异无显著意义（P＞0．05）。结论：HBV转染可以抵抗TRAIL诱导的细胞凋亡,可以下调细胞表面TRAIL蛋白质及其受体的表达,但使FLIP的表达显著上调。这能从一定程度上解释HBV感染逃逸机体免疫监视,持续存活,导致相应病理变化的机制。     

光动力作用对人肝癌细胞HepG2的影响及其机制探讨

目的 研究血卟啉衍生物光动力作用诱导人肝癌细胞HepG2凋亡及其机制.方法 应用流式细胞仪分析光动力作用后细胞凋亡及免疫组化染色检测凋亡相关蛋白bcl-2蛋白、bax蛋白表达水平.结果 血卟啉衍生物光动力组人肝癌细胞HepG2凋亡率达(25.28±1.52)%,与对照组相比,差异有极显著意义(P＜0.01);并且光动力作用后凋亡相关蛋白bcl-2表达显著高于对照组(P＜0.05).结论 血卟啉衍生物光动力作用具有诱导人肝癌细胞HepG2凋亡的生物学效应,而凋亡调控蛋白bcl-2表达水平的降低可能是血卟啉衍生物光动力作用诱导人肝癌细胞HepG2凋亡的一个重要机制.     

乙型肝炎病毒P22e蛋白对人肝细胞癌细胞株HepG2凋亡的影响

目的 研究乙型肝炎病毒P22e蛋白对人肝细胞癌细胞株HepG2凋亡的影响.方法 利用含HBVP22e基因的重组pEGFP-C2HBVP22e质粒的人肝细胞癌细胞系HepG2,并以Act-D、TNFα诱导该细胞系发生凋亡,使用流式细胞术,检测具有亚G1期DNA含量的细胞比例代表凋亡细胞数;使用激光共聚焦显微镜,观察凋亡细胞核的变化,进一步研究HBVP22e在肝细胞凋亡的生物学功能效应.结果 HepG2EGFP-C2HBVP22e细胞系在发生凋亡的时间上比HepG2细胞系有明显延迟,凋亡的发生率也明显低于HepG2细胞系(P＜0.01).结论 由于外源性基因HBVP22e的引入及表达,对HepG2细胞的凋亡有明显的抑制作用.     

臭氧溶液对HBV体外感染的HepG2细胞的抗病毒作用

目的:建立乙型肝炎病毒(HBV)体外感染人肝癌HepG2细胞的实验模型,并研究臭氧溶液对感染了HBV后的HepG2细胞的抗病毒作用。方法:乙肝阳性血清与HepG2细胞共孵育建立体外感染模型,采用倒置相差显微镜检测细胞形态,MTT法检测细胞成活率,ELISA法检测HBsAg和HBeAg表达水平,HBV荧光定量PCR检测HBV DNA表达量。结果:体外感染了HBV DNA的HepG2细胞能持续稳定分泌HBsAg和HBeAg,并能产生HBV DNA,通过低浓度臭氧溶液作用后,细胞形态无明显差异,细胞成活率无明显影响(P>0.05),HBsAg和HBeAg均转阴(P<0.01),HBV DNA拷贝量亦明显降低(P<0.01)。结论:较低浓度臭氧溶液对感染了HBV的HepG2细胞有明显的抗病毒作用,对细胞并无损伤。     

沉默FASN基因对肝母细胞瘤HepG2细胞的脂质代谢及增殖、迁移和凋亡的影响

目的 研究FASN基因沉默对肝母细胞瘤HepG2细胞脂质代谢及生物学行为的影响。方法 以脂质体包裹siRNA的方法沉默FASN基因,实验分为Control组、NC-siRNA组和FASN-siRNA组,FASN-siRNA组转染75 nmol/L的FASN-siRNA片段,NC-siRNA组转染等剂量的NC-siRNA片段,Control组只加入等体积的转染试剂。通过实时荧光定量PCR和Western blot法检测FASN基因和蛋白水平的相对表达;通过酶联免疫吸附法检测HepG2细胞甘油三酯水平;通过油红O染色法检测细胞内脂滴数目;利用CCK-8实验检测HepG2细胞增殖活性的改变;通过annexinV-FITC/PI双染色法检测HepG2细胞凋亡情况;采用划痕愈合实验及transwell实验检测HepG2细胞迁移能力的改变。结果 FASN-siRNA组的FASN基因表达、蛋白表达低于NC-siRNA组（P<0.001）。油红O染色显示,FASN-siRNA组细胞内脂滴较NC-siRNA组减少（P<0.001）、甘油三酯水平降低（P< 0.01）;CCK-8实验、annexinV-FITC/PI双染实验及划痕愈合实验结果显示,转染48、72、96 h后,FASN-siRNA组HepG2细胞增殖被显著抑制,FASN-siRNA组细胞总凋亡率与NC-siRNA组相比增加、FASN-siRNA组发生迁移的HepG2细胞数量低于NC-siRNA组（P<0.001）。结论 沉默FASN基因可抑制肝母细胞瘤HepG2细胞的增殖及迁移,并诱导HepG2细胞凋亡,该作用可能与FASN基因抑制后HepG2细胞内脂质合成降低有关。     

奥沙利铂通过p53信号通路抑制肝癌细胞增殖的机制研究

目的:研究奥沙利铂（L-OHP）对突变型肝癌细胞HuH-7、野生型肝癌细胞HepG2增殖与凋亡的影响,探讨p53信号通路相关蛋白在其中的作用。方法:MTT法检测L-OHP对HuH-7、HepG2细胞增殖的抑制效应;倒置显微镜观察L-OHP作用后2种细胞株形态的变化;流式细胞术检测L-OHP作用后细胞周期分布;Western blot法检测p53信号通路相关蛋白表达变化。结果:L-OHP能抑制HuH-7、HepG2细胞增殖,具有时间浓度依赖性（P<0.01）;L-OHP作用后,可观察到细胞形态发生改变,细胞变圆、脱壁;L-OHP能够诱导HuH-7、HepG2细胞阻滞在细胞周期的S期,S期细胞的比例随L-OHP作用浓度增加而明显增加（P<0.01）;L-OHP可激活p53信号通路,L-OHP改变2种细胞中p21、Bax、Bcl-2、p53、磷酸化p53（p-p53）蛋白表达（P<0.05）,但对HuH-7细胞p-p53的表达无明显影响。结论:L-OHP可通过激活p53信号通路诱导肝癌细胞凋亡,其机制可能与调控p53通路相关蛋白p53、p-p53、p21、Bax、Bcl-2的表达有关。     

溪黄草对肝癌细胞HepG2增殖及凋亡的影响

目的 探讨溪黄草对人肝癌HepG2细胞株增殖和凋亡的影响。方法 MTT法检测溪黄草对肝癌HepG2细胞增殖的抑制作用,流式细胞仪Annexin V/PI 双染法检测对细胞凋亡的影响,ELISA法检测Bcl-2、Bax蛋白表达的情况。结果 不同浓度溪黄草能抑制肝癌细胞HepG2细胞的生长(P＜0.01),并具有浓度和时间依赖性。0.75g/μL的溪黄草作用于HepG2细胞3、6h后,结果表明溪黄草能显著促进细胞凋亡,具有时间依赖性,与阴性对照组比较有统计学差异(P＜0.05)。0.75g/μL溪黄草作用HepG2 细胞6h后,Bcl-2蛋白表达降低,Bax蛋白表达增加,与阴性对照组比较,亦具有统计学差异(P＜0.05)。结论 溪黄草能抑制HepG2细胞的体外增殖,且抑制作用表现出时效关系,其机制可能与促进细胞凋亡、下调Bcl-2蛋白及上调Bax蛋白表达有关。     

HBV x基因真核表达载体的构建及对肝癌细胞恶性表型的影响

目的 构建乙型肝炎病毒x基因真核表达载体并在肝癌细胞中表达,以研究其对肝癌细胞恶性表型的影响。方法 应用PCR、基因克隆等方法构建乙型肝炎病毒x基因真核表达载体pcDNA3.1-HBX,用基因转染的方法将pcDNA3.1-HBX转染入肝癌细胞HCC－9204,筛选稳定表达乙型肝炎病毒X蛋白的肝癌细胞。MTT比色实验、平板集落形成实验检测肝癌细胞恶性表型。结果 成功构建了乙型肝炎病毒x基因真核表达载体pcDNA3.1-HBX并获得了稳定表达乙型肝炎病毒X蛋白的肝癌细胞系HCC－9204细胞克隆,且MTT比色实验、平板克隆形成实验显示稳定表达乙型肝炎病毒X蛋白的肝癌细胞恶性度增高。结论 乙型肝炎病毒X蛋白具有生长因子样作用,可刺激肝癌细胞生长,在肝癌细胞中稳定表达乙型肝炎病毒X蛋白可增加肝癌细胞恶性表型。