脂毒性与胰岛微血管内皮细胞损伤的研究进展

 摘要 胰岛是高度血管化的微器官,胰岛微血管内皮细胞作为胰岛微循环系统最主要的组成成分,与胰岛内分泌功能关系密切,直接参与糖尿病胰岛功能衰竭的发生发展过程,是糖尿病防治的新靶点。近年来,脂毒性在2型糖尿病中的作用日益引起人们的重视,其可通过促进氧化应激、影响血管舒缩功能、诱导细胞凋亡等多种途径直接损伤胰岛微循环内皮细胞,影响胰岛细胞功能。本文就胰岛微血管内皮细胞在胰岛功能中的重要作用、脂毒性对胰岛微血管内皮细胞的影响及其分子机制进行综述,为糖尿病的基础与临床研究提供新的视角和靶点。     

REG3α gene promotes insulin secretion by pancreatic endothelial cells

目的 探讨小鼠胰岛再生衍生因子3α( REG3α)对胰岛β细胞功能代偿作用.方法 建立小鼠部分(90％)胰腺切除模型,分别于术前、术后12和24h检测血糖,术后48 h收集小鼠剩余胰腺组织,经全基因组芯片分析、q-PCR验证REG3α表达;然后构建REG3α过表达质粒,转染MS1细胞系,48 h后ELISA检测细胞上清培养液胰岛素分泌量的变化,并通过q-PCR检测转染后MS1中PDX1、INSULIN2 mRNA表达水平.结果 小鼠部分胰腺切除后REG3α发生高表达.转染REG3α过表达质粒组胰岛素分泌量显著高于未转染组(转染REG3α组879±2 ng/L,未转染组686±5 ng/L,P＜0.01);转染REG3α过表达质粒组胰岛素分泌量显著高于转染空载体pcDNA3.1组(转染REG3α组879±2 ng/L,转染空载体组671±5 ng/L,P＜0.01).转染REG3α过表达质粒后MS1中的PDX1、INSULIN2mRNA表达水平明显高于未转染组及转染空载体pcDNA3.1组(P＜0.01).结论 REG3α促进内皮细胞表达和分泌胰岛素可能具有对胰岛β细胞功能代偿作用.     

钨酸钠促进新生猪胰岛细胞体外增殖、分化及分泌功能

 摘要：目的　观察钨酸钠在体外对新生猪胰岛细胞增殖及功能活性的影响。方法　分离和纯化新生猪胰岛细胞后,与钨酸钠共育,隔天进行细胞计数、MTT试验,取最佳浓度300μmol/L钨酸钠与细胞共同培养3天,收集细胞进行葡萄糖刺激试验,并分别用Western blot、 RT-PCR方法检测细胞内胰岛素蛋白(INSULIN)、细胞增殖核抗原（PCNA）和PDX-1 mRNA、GLUT-2 mRNA的表达。 结果300μmol/L钨酸钠处理后胰岛细胞增殖活性及葡萄糖刺激试验中胰岛素分泌明显高于对照组（P < 0. 05）,钨酸钠干预组PCNA蛋白（1.17±0.13 vs 2.24±0.19,P < 0. 05）、INSULIN（0.37±0.08 vs1.62±0.17,P < 0. 01）较对照对照组明显增高,PDX-1（0.11±0.03 vs0.34±0.05,P < 0. 01）、GLUT-2（0.13±0.02 vs 1.06±0.10,P < 0. 01）基因的 mRNA表达明显上调。 结论　低浓度（300μmol/L）钨酸钠具有促进新生猪胰岛细胞增殖分化、增强胰岛细胞功能、促进胰岛素分泌的作用     

EBV感染胃癌细胞系NU-GC-3增强BCL-2基因的表达

近年来Epstein-Barr病毒(EBV)感染与胃癌的关系受到关注[1].目前,对EBV相关胃癌的研究主要在临床病理方面[2],而EBV感染后胃上皮细胞变化的分子机制尚不明确,用EBV感染体外培养的胃腺癌细胞系NU-GC-3,同时用EBV Ⅰ型潜伏感染基因构建的表达载体分别转染NU-GC-3,对其感染或转染细胞中BCL-2表达进行研究,从而探讨BCL-2基因在EBV致胃癌发生发展中的作用.     

肺癌细胞低氧干预后DLL4的表达及其对内皮细胞迁移的影响

 摘要：目的 探讨氯化钴化学模拟低氧对肺癌细胞DLL4(delta like ligand 4)表达的影响及其与内皮细胞迁移的关系,为寻找抗肿瘤血管新生的潜在靶点提供理论依据。方法 EdU掺入法测定细胞增殖变化;采用免疫荧光细胞染色和western-blot测定DLL4和 HIF-1α（hypoxia induced factor 1α）在A549细胞中的表达;细胞划痕实验检测内皮细胞的迁移变化。结果 低浓度氯化钴（200 μmol/L ）化学模拟低氧干预12小时后,A549细胞增殖没有明显抑制,DLL4和 HIF-1α的表达均明显上调,培养上清液促进细胞划痕实验中内皮细胞的迁移。结论 化学模拟低氧明显上调A549细胞DLL4的表达,其对内皮细胞的迁移趋化作用提示其为抗肿瘤血管新生治疗的潜在靶点。     

Ghrelin对棕榈酸诱导的内皮细胞凋亡的影响及机制

 目的 探讨ghrelin能否抑制棕榈酸诱导的大鼠主动脉内皮细胞凋亡及其与PI3K/Akt通路的关系。 方法 大鼠主动脉内皮细胞在分别在含或不含0.3mM棕榈酸的DMEM培养基中孵育,培养基中加或不加ghrelin及PI3K/Akt的阻断剂LY294002,流式细胞仪Annexin Ⅴ/PI法检测凋亡,分光光度计检测caspase-3活性,Western blot检测总Akt及磷酸化Akt。 结果0.3mM棕榈酸作用24小时增加大鼠主动脉内皮细胞凋亡,Ghrelin抑制棕榈酸诱导的内皮细胞凋亡。棕榈酸干预内皮细胞24小时能显著抑制Akt的磷酸化,加入ghrelin可引起Akt的活化。Ghrelin引起的Akt的活化能够显著地被PI3K/Akt阻断剂LY294002所阻断,而且LY294002能够阻断ghrelin对棕榈酸诱导的内皮细胞凋亡的保护作用。 结论 Ghrelin能够抑制棕榈酸诱导的大鼠主动脉内皮细胞凋亡,ghrelin的抗凋亡作用至少是部分通过PI3K/Akt通路起作用的。     

siRNA沉默AFP基因对肝癌细胞系 EGHC-9901 增殖的影响

 目的 建立稳定表达AFP-siRNA质粒的肝癌细胞系并探讨对其增殖的影响。方法 构建AFP-siRNA,用脂质体法转染肝癌细胞系,G418筛选4～5周,Western blot 及RT-PCR检测靶基因表达,分组：实验组,转染AFP-siRNA组;阳性对照组,转染空载体组;空白对照组,未处理组。MTT绘制生长曲线,平板克隆实验观察集落形成,流式细胞仪分析细胞周期。结果 成功建立稳定表达AFP-siRNA的肝癌细胞系,实验组表达AFP近乎完全抑制;实验组增殖能力显著低于空载体组;实验组＞75μm集落形成数19±2,低于空载体组62±6;实验组G1期细胞数较空载体组提高20％左右。 结论 成功建立稳定表达AFP-siRNA的肝癌细胞系,抑制AFP表达可使肝癌细胞发生G1期阻滞,明显抑制其增殖及集落形成能力。     

阿托伐他汀对高糖高脂环境下人脐静脉内皮细胞与人肾小球系膜细胞相互作用的影响

 目的 探讨高糖高脂环境下人脐静脉内皮细胞与人肾小球系膜细胞间的相互作用及阿托伐他汀对内皮细胞与系膜细胞相互作用的影响。方法人脐静脉内皮细胞与人肾小球系膜细胞共培养和人肾小球系膜细胞单独培养,分为对照组、甘露醇组、高糖高脂组、BN52021组、阿托伐他汀组。ELISA法检测细胞上清液纤维联接蛋白（Fn）、血小板活化因子（PAF）含量,实时荧光定量检测系膜细胞血小板活化因子受体（PAF-R）mRNA表达。结果 (1)高糖高脂条件下,共培养和单培养Fn、PAF升高（P <0.05）;高糖高脂条件下,共培养Fn、PAF较单培养升高（P <0.05）,BN52021和阿托伐他汀可抑制高糖高脂引起的Fn升高（P <0.05）,阿托伐他汀可抑制高糖高脂引起的PAF升高（P <0.05）;（2）高糖高脂可上调系膜细胞PAF-R mRNA表达（P <0.05）,阿托伐他汀可显著抑制PAF-R mRNA表达上调（P<0.05）。结论 (1) 高糖高脂环境下,系膜细胞和内皮细胞存在异常的相互作用。(2)阿托伐他汀可影响高糖高脂环境下内皮细胞与系膜细胞的相互作用。     

胰岛α细胞培养上清液对INS-1细胞胰岛素释放与合成的影响

在培养的INS 1细胞中 ,分别加入不同比例的胰岛α细胞培养上清液 (以下简称上清液 ) ,在不同浓度葡萄糖的刺激下 ,分别孵育不同时间 ,用放射免疫法测定INS 1细胞培养基中的胰岛素含量。在 2 0mmol L葡萄糖浓度下 ,不同刺激时间 ,不同浓度的上清液刺激INS 1细胞分泌的胰岛素显著高于 0 %上清液 (以下简称对照组 ,P <0 0 5或0 0 1 )。在 0、1 85mmol L葡萄糖刺激时 ,不同浓度的上清液对INS 1细胞的胰岛素分泌无明显作用 ,而在 5 6、1 6 7和 5 0mmol L葡萄糖刺激时 ,不同浓度的上清液刺激INS 1细胞分泌的胰岛素显著高于对照组 (P <0 0 5或 0 0 1 )。RT PCR结果显示 ,在 1 6 7mmol L葡萄糖刺激 4、1 2和 2 4h后 ,30 %上清液对INS 1细胞胰岛素mRNA水平均无明显影响。提示胰岛α细胞培养上清液对糖刺激的INS 1细胞的胰岛素分泌有促进作用 ,但不影响胰岛素的生物合成     

原代分离的大鼠胰岛细胞对葡萄糖刺激胰岛素分泌的反应性研究

目的:研究原代分离的大鼠胰岛对葡萄糖刺激的胰岛素分泌反应性。方法:胶原酶原位灌注法分离大鼠胰岛,在含0.5%BSA、5.5或11.1mmol/L葡萄糖的培养基中培养不同时间后,用含0.2%BSA、3.3mmol/L葡萄糖的KRB缓冲液预培养胰岛30min,分别换入含不同浓度葡萄糖KRB缓冲液,培养1h,收集上清,RIA法测定胰岛素浓度。结果:大鼠胰岛过夜培养后,在基础(3.3mmol/L)和高浓度(16.7mmol/L)葡萄糖条件下胰岛素分泌量分别为(12.4±3.2)和(45.2±4.2)μU/ml/10islets/h;5.5mmol/L和11.1mmol/L葡萄糖浓度下培养12h和20h后,胰岛对葡萄糖的反应性均明显高于16.7mmol/L和22.5mmol/L葡萄糖组(P<0.05);体外培养5d后,对高糖的反应性为(4.28±0.67)倍。结论:原代分离的大鼠胰岛可在(1～5)d内保持对葡萄糖的反应性。     

血管内皮细胞生长因子在肥胖乳腺癌患者乳腺癌组织中的表达及临床意义

 摘要：　目的 探讨肥胖乳腺癌患者乳腺癌组织中血管内皮细胞生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）的表达及临床意义。方法 采集45例肥胖乳腺癌患者,37例正常体重乳腺癌患者,用RT-PCR和免疫组织化学检测肥胖组和正常体重组乳腺癌组织VEGF的mRNA和蛋白表达。结果 肥胖组乳腺癌组织VEGF的mRNA和蛋白表达均高于正常体重组 (P<0.05),并且VEGF mRNA和蛋白表达之间呈正相关(r=0.785,P<0.05);VEGF在肥胖乳腺癌组织中的表达与组织学分级、5年复发转移有关,与患者年龄无关。结论 VEGF在肥胖乳腺癌患者中具有高表达趋势,提示VEGF可能在肥胖相关性乳腺癌的发生、演变及预后中起重要作用。     

维持性血液透析患者血清诱导人脐静脉内皮细胞凋亡

  目的 研究血液透析患者血清诱导人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells, HUVECs)的凋亡,并初步探讨其机制。方法 取透析患者血清（实验组）及健康志愿者血清（对照组）培养HUVECs 30和40 h,倒置显微镜下观察形成血管样结构的内皮细胞的凋亡,MTT法检测内皮细胞增殖,TUNEL法检测内皮细胞凋亡,比色法检测内皮细胞内活性氧产生,Westernblot法检测内皮细胞内caspase-3表达。结果 内皮细胞培养40h后,实验组形成血管样结构的内皮细胞出现凋亡（P＜0.05）,内皮细胞ROS产生增加（P＜0.05）,以及内皮细胞caspase-3表达量为（0.83±0.03）,显著高于对照组（0.57±0.02）（P＜0.05）。结论 血液透析患者血清可以诱导形成血管样结构的内皮细胞凋亡,其机制可能与内皮细胞内caspase-3表达增加以及ROS产生增多有关。     

胰腺衍生因子（PANDER）在糖尿病小鼠胰腺中的表达变化

 目的 探讨PANDER蛋白在1型和2型糖尿病小鼠胰岛中的表达变化及其与胰岛素抵抗和高血糖的相关性。方法 以STZ诱导和自发性Akita 1型糖尿病小鼠及2型糖尿病db/db小鼠为动物模型,用实时定量PCR,免疫组化和Western Blot的方法检测胰腺中PANDER mRNA和蛋白指标。结果 相较于正常C57BL/6小鼠,STZ诱导和Akita 1型糖尿病小鼠胰腺组织中PANDER mRNA（STZ：1.00±0.17 vs. 0.25±0.06,P<0.01;Akita：1.00±0.19 vs.0.17±0.04,P<0.001）和蛋白（免疫组化灰度扫描STZ：1.00±0.18 vs. 0.16±0.11）水平均明显降低;相较于db/m小鼠,db/db小鼠胰腺组织中PANDER mRNA（1.00±0.05 vs. 2.13±0.46,P<0.05）和蛋白（1.00±0.28 vs. 3.58±0.36,P<0.01）水平均明显升高;罗格列酮灌胃db/db小鼠一个月后,胰岛肥大、胰岛素抵抗及高血糖症状得以缓解,同时胰腺中PANDER mRNA（1.00±0.13 vs. 0.28±0.06,P<0.01）和蛋白水平明显降低。结论 1型糖尿病小鼠胰腺组织中PANDER表达显著减少;2型糖尿病小鼠胰腺组织中PANDER明显升高。     

转染NDRG2基因抑制乳腺癌细胞增殖

 目的：观察NDRG2对于乳腺癌细胞系增殖的影响。方法: 用重组NDRG2腺病毒转染低表达NDRG2的人乳腺癌细胞系Bcap37,用Western blot检测NDRG2的表达;用MTT、流式细胞仪检测细胞增殖能力。结果: NDRG2表达对Bcap37细胞生长具有抑制作用; Bcap37 细胞病毒转染组出现G1期阻滞(G1期捕获),与未转染的Bcap37 细胞（1.0%）和空载体重组腺病毒感染的Bcap37 细胞（2.0%）相比,重组NDRG2腺病毒感染的Bcap37 细胞中凋亡细胞明显增多,感染48 h后达12.0%,感染72 h后达21.5%。结论:在乳腺癌细胞系Bcap37 中,过表达NDRG2可有效抑制细胞增殖并导致细胞周期的阻滞和诱导细胞凋亡。     

PGC1α协同PPARγ调节CIDEC基因在小鼠脂肪细胞系中表达

 目的 鉴定CIDEC的表达能够被PPARγ和PGC1α共激活, 检测其在脂肪代谢中的重要调控作用。方法 构建5’删切和顺式原件突变的启动子,运用HepG2细胞中双荧光报告基因实验检测PPARγ和PGC1α对CIDEC的共激活作用并确定顺式作用原件。运用PPARγ特异激动剂pioglitazone刺激3T3-L1细胞检测CIDEC的mRNA水平。在3T3-L1细胞系中,过表达CIDEC,检测脂肪合成及能量代谢相关基因的mRNA水平。通过腺病毒感染在小鼠肝原代细胞中过表达CIDEC,检测肝脏细胞中脂肪变化。结果 PPARγ和PGC1α能够显著激活CIDEC的启动子。过表达CIDEC后在脂肪细胞中脂类合成相关基因FAS上调3.47±0.17倍（p<0.05）,ACC上调3.95±0.57倍（p<0.05）,在肝原代细胞中CIDEC促进脂滴的生成。结论 CIDEC过表达能够被PPARγ促进并且被PGC1α共激活,在体内起到促进脂肪积累的作用。     

胰岛素对大鼠结肠平滑肌细胞凋亡及MAPK通路的影响

 目的 探讨胰岛素对大鼠结肠平滑肌细胞( SMCs )凋亡及丝裂原活化蛋白激酶( MAPK )信号转导通路的影响。方法 酶解法分离培养SD大鼠结肠SMCs,α-actin免疫鉴定,将大鼠结肠SMCs分为正常组,胰岛素组,胰岛素 +PD98059( ERK抑制剂)组,MTT法检测SMCs增殖,流式细胞术Annexin V-FITC/PI检测SMCs凋亡,Western blot法检测p-ERK、ERK、p-P38MAPK、P38MAPK和p-JNK、JNK表达。结果 胰岛素组较正常组细胞明显增殖,凋亡率降低,p-ERK表达增强,p-ERK/ERK 比值升高( 110.36 ± 9.5 vs 50.92 ± 6.01 ) ( P < 0.01 );p-P38MAPK、P38MAPK、p-JNK、JNK表达无差异。PD98059组较正常组细胞增殖明显下降,凋亡率升高,p-ERK表达减弱,p-ERK/ERK比值降低( 15.69 ± 2.11 vs 50.92±6.01 ) ( P < 0.01 )。结论 胰岛素可能通过激活结肠SMCs的MAPK通路中的ERK途径,促进细胞增殖,抑制凋亡,可能与P38MAPK途径和JNK途径无关。     

大肠癌ART1的表达与VEGF、整合素αVβ3表达及微血管形成的相关性

 目的 探讨大肠癌组织中单ADP核糖基转移酶ART1的表达与VEGF、整合素αVβ3表达的相关性及其对大肠癌组织微血管生成的影响。方法 免疫组化检测大肠癌组织中ART1、VEGF及整合素αVβ3的表达;免疫荧光双标检测ART1/VEGF及ART1/整合素αVβ3的共表达,用Chalkley分析法评估微血管的形成。结果 ART1、VEGF与整合素αVβ3的表达高于对照组(P相似文献   

吡咯烷二硫代氨基甲酸酯减轻2型糖尿病大鼠胰岛β细胞氧化损伤

 目的 探讨吡咯烷二硫代氨基甲酸酯（PDTC）对2型糖尿病大鼠胰岛β细胞氧化损伤的影响及其机制。方法 用长期高脂饮食加小剂量链脲佐菌素（STZ,27mg/kg体重）建立2型糖尿病大鼠模型。PDTC治疗组大鼠每天腹腔注射PDTC（50mg/kg）1次,1周后取血浆检测血糖。取胰腺组织匀浆测定丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）及谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX）的含量;应用免疫组化和Western blot等检测胰腺组织中诱生型一氧化氮合酶（iNOS）的表达及硝基化酪氨酸（NT）的水平;流式细胞术检测胰岛β细胞凋亡百分率。结果 糖尿病大鼠血糖、MDA水平均显著高于对照组（P﹤0.01）;SOD和GSH-PX水平明显低于对照组（P﹤0.01）;胰岛组织中iNOS表达水平（0.37±0.06）和NT生成量（0.24±0.01）均较对照组（0.11±0.01）和（0.12±0.01）明显增多（P<0.01）。PDTC治疗后血糖明显降低,MDA明显减少（P＜0.01）;而SOD、GSH-PX水平明显升高（P＜0.05,P＜0.01）;胰岛组织中iNOS表达及NT生成均明显减少（P＜0.01）;胰岛β细胞凋亡率明显降低（P＜0.05）。结论 PDTC可以降低血糖,减轻大鼠体内氧化应激反应,减少糖尿病大鼠胰岛β细胞的凋亡。     

α-突触核蛋白与Nurr1相互作用增强致小鼠小胶质细胞系肿瘤坏死因子α表达增多

 目的 在BV2细胞中,探讨?-突触核蛋白( ?-Syn)与Nurr1之间是否存在相互作用及其对肿瘤坏死因子?( TNF-?)分泌的影响。方法 用蛋白质免疫共沉淀（Co-IP）和免疫组织化学染色观察?-Syn和Nurr1之间是否存在相互作用,用免疫组织化学和蛋白印迹观察Nurr1核转位,用酶联免疫技术（Elisa）检测TNF-?的释放量。结果 ?-Syn和Nurr1存在共定位,?-Syn和Nurr1可能存在相互作用。 过表达?-Syn时Nurr1的核转位减少,单独过表达?-syn使得TNF-?分泌增加;而同时过表达Nurr1可以明显抑制TNF-?产生。结论 ?-Syn可能通过与Nurr1相互作用从而减少其核转位,导致TNF-?产生增多,这可能是?-Syn介导胶质细胞活化引起炎症的机制之一。     

胰岛素和葡萄糖对缺氧血管内皮细胞分泌tPA和PAI-1抗原的影响

目的: 观察胰岛素和葡萄糖对缺氧血管内皮细胞分泌组织型纤溶酶原激活物(tPA)及其抑制物-1(PAI-1)的影响。 方法:培养人脐静脉内皮细胞株ECV-304。分组实验:(1)常氧组;(2)在缺氧条件下又分为Ⅰ:缺氧对照组;Ⅱ:低浓度组:胰岛素150 mU/L、葡萄糖5.5 mmol/L;Ⅲ:中浓度组:胰岛素450 mU/L、葡萄糖15 mmol/L;Ⅳ:高浓度组:胰岛素900 mU/L、葡萄糖30 mmol/L;Ⅴ:渗透压对照组:甘露醇24.5 mmol/L。取培养4、8、12 h 3个时点,用ELISA法测定细胞培养上清液tPA、PAI-1抗原。结果:缺氧明显增加tPA和PAI-1抗原分泌,tPA/PAI-1值明显增加(P＜0.01)。胰岛素和葡萄糖能够刺激缺氧内皮细胞分泌tPA和PAI-1抗原,在缺氧8 h以内,tPA/PAI-1比值明显增加(P＜0.05)。随缺氧时间的延长,tPA/PAI-1值逐渐下降。结论:胰岛素和葡萄糖能够刺激内皮细胞分泌tPA和PAI-1抗原,在缺氧8 h以内,tPA/PAI-1值升高,纤溶活性升高,有利于局部自发性纤溶的发生。此作用可能是IGK治疗急性心肌梗死的机制之一。