Exogenous EGFP labeling affects tumor cells biological behavior

目的 探讨常用的可视化细胞标记技术-外源EGFP表达对肿瘤细胞生物学行为的影响.方法 选择不同的携带EGFP的载体,利用脂质体转染或慢病毒感染技术,在不同肿瘤细胞系中表达外源EGFP,筛选稳定表达外源EGFP的细胞系,MTT法检测细胞体外增殖能力;细胞分析计数仪(CasyTT型)检测细胞大小;Transwell体外迁移实验检测细胞体外侵袭能力.结果 成功建立了稳定表达外源EGFP的人结肠癌细胞系HCT116-GFP、HCT116-EGFP、COLO320DM-EGFP和小鼠树突状细胞肉瘤细胞系DG6-EGFP.HCT116-EGFP细胞、COLO320DM-EGFP细胞和DG6-EGFP细胞的体外增殖能力明显降低;HCT116-EGFP细胞体积增大:平均直径分别为(14.53±0.07) μm( HCT116)和(18.28±0.16) μm (HCT116-EGFP) (P＜0.01);HCT116-EGFP细胞的体外侵袭能力明显降低(P＜0.01).结论 外源EGFP可视化标记细胞后,可能会影响肿瘤细胞的生物特性,利用这些模型进行科研时,需注意对相关指标的影响.     

胃癌中DNAJA1的表达及其对胃癌细胞生物学行为的影响

目的 探讨DNAJ热休克蛋白40家族成员A1(DNAJA1)在胃癌中的表达、临床病理特征及其对胃癌细胞生物学行为的影响。方法 采用免疫组化PV两步法检测160例胃癌石蜡组织中DNAJA1的表达;应用Western blot及RT-PCR检测胃癌细胞中DNAJA1表达水平;运用MTT、Transwell侵袭实验检测DNAJA1对胃癌细胞增殖和侵袭能力的影响。结果 DNAJA1在胃癌组织中高表达率为69.37%,高于癌旁正常胃组织(44.37%,P<0.001)。临床病理特征分析发现,DNAJA1高表达与淋巴结转移(P=0.019)、p53状态(P=0.003)、HER-2状态(P=0.001)、浸润深度(P=0.035)及WHO分型(P=0.008)相关。体外实验证实,过表达DNAJA1促进胃癌细胞增殖和侵袭(MTT MOCK组：0.45±0.02,DNAJA1组：0.74±0,P<0.05;Transwell MOCK组：48.00±7.54,DNAJA1组：144.33±9.50,P<0.01);干扰DNAJA1抑制胃癌细胞增殖和侵袭(MTT NC组：0.92±0....     

醛固酮对新生大鼠心肌成纤维细胞PTEN表达的影响

目的研究醛固酮(Ald)诱导的心肌成纤维细胞(CFs)增殖中PTENmRNA、蛋白表达及螺内酯(Spi)对其表达的影响,从而探讨Ald对心肌成纤维细胞PTEN表达的影响。方法用体外培养新生SD大鼠的CFs,以Ald诱导其增殖和胶原合成,并加入Spi干预,用RT-PCR和Western Blot分别测定PTENmRNA和蛋白表达。结果与对照组相比,Ald组的CFs增殖和羟脯氨酸含量明显增加(P<0.05),并呈浓度依赖性降低PTENmRNA和蛋白表达(P<0.05);与Ald组相比,Ald+Spi组的CFs增殖和羟脯氨酸含量明显减少(P<0.05),同时其PTENmRNA、蛋白表达均明显升高(P<0.05)。结论醛固酮可通过盐皮质激素受体(MR)介导的基因组通路降低PTEN表达发挥其致心肌纤维化作用。     

microRNA与肿瘤细胞周期的关系及其研究方法进展

 研究发现,某些miRNAs与细胞周期调控有关,它们可以通过靶向E2F、Cdks、cyclins、CKI等促进或阻滞细胞周期的关键调节因子,进而调控细胞周期,并且这种由miRNAs介导的细胞周期调控方式与恶性肿瘤的发生发展密切相关。本综述主要介绍miRNA与肿瘤细胞周期的关系及其研究策略。     

电离辐射对食管癌细胞系(ECA109和TE13)r-H2AX表达的影响

维持一个完整的基因组对于细胞的稳定性是至关重要的,由电离辐射和类辐射药物产生的DNA双链损伤是最主要的细胞毒损伤,如果不能修复这种损伤就会导致基因组不稳定和肿瘤的形成或其他年龄相关疾病[1].体内外的研究都证明H2AX的修饰在调节各种细胞应答DNA双链断裂中起着中心作用[2-4].Giunta等的实验为rH2AX作为DNA双链断裂的标志提供了证据[5].而食管癌ECA109为高分化鳞状细胞癌,TE13细胞为低分化鳞状细胞癌,他们的生物学特征不同,研究r-H2AX在不同食管癌株系的动力学特点将有助于了解DNA双链断裂——这一细胞内最致命的损伤的特点与食管癌放疗敏感性之间的关系.     

NPM1基因突变表达对THP-1白血病细胞增殖和凋亡的作用探讨

 摘要：目的 探讨核仁磷酸蛋白（NPM1）基因突变对白血病细胞增殖潜能和凋亡发生的影响。方法 将携带NPM1 A型突变（NPM1 mA）的重组质粒载体pEGFPC1-NPM1 mA转染白血病THP-1细胞系,构建稳定表达NPM1 A型突变蛋白的白血病细胞株(THP-1 mA),同时设立未处理组（THP-1）和空载体转染组（THP-1 C1）作为对照。通过MTT试验观察细胞体外增殖能力,流式细胞术分析细胞周期分布及凋亡发生率的改变;采用RT-PCR和Western blot分别检测细胞凋亡相关蛋白（Bax和Bcl-2）mRNA及蛋白表达水平。结果 与未处理组和空载体转染组细胞相比较,携NPM1突变体的THP-1 mA细胞体外增殖能力明显增强,S期细胞比例明显增高,G1期细胞比例显著减低;而NPM1突变体转染后THP-1细胞的凋亡率没有显著变化,同时细胞凋亡相关蛋白Bax, Bcl-2的mRNA和蛋白表达以及Bax/Bcl-2比值亦未见明显改变。结论 NPM1突变基因能够促进白血病细胞的体外增殖能力,而对白血病细胞凋亡无显著影响,这为进一步阐明NPM1突变与AML的关系提供了新的科学依据。     

苹果酸舒尼替尼抑制膀胱癌T24细胞系的体外增殖

 摘要：目的：探讨苹果酸舒尼替尼对人膀胱癌T24细胞系体外增殖的影响。方法：取人膀胱癌T24细胞系悬液, 分别加入浓度为0.625、1.25、2.5、5、10 和 20μmol/L的苹果酸舒尼替尼,分别于24、48、72 h进行处理,用细胞毒抑制实验（MTT法）检测药物对其生长的影响。结果：苹果酸舒尼替尼可浓度依赖性抑制人膀胱癌细胞系T24细胞增殖,当药物浓度>5μmol/L时,苹果酸舒尼替尼与顺铂比较,对T24细胞系具有更强的抑制作用（P<0.05）。这种抑制作用随着药物培育时间延长（24、48、72ｈ）而增强,表现为IC50值显著降低, 但其抑制能力与顺铂比较无显著差别（P>0.05）。结论：苹果酸舒尼替尼可呈浓度和时间依赖地抑制膀胱癌T24细胞系增殖。     

NF-κB抑制齐PDTC对大肠癌体外血管生成因子表达的影响

 目的 探讨NF-κB抑制剂PDTC对大肠癌Lovo细胞系体外血管生成因子表达的影响。方法 采用NF-κB抑制剂PDTC处理Lovo细胞,以未作处理Lovo细胞作为对照组,以PDTC处理后的Lovo细胞作为实验组。Western blot检测各组细胞NF-κB、p-IκBα、VEGF和b-FGF蛋白表达情况;Transwell细胞迁移实验检测HUVEC迁移能力;收集各组Lovo细胞上清液,分别加入到培养液中培养HUVEC,并采用CCK-8细胞增殖实验检测HUVEC增殖能力。结果 Western blot结果提示实验组NF-κB、p-IκBα、VEGF和b-FGF表达量均明显低于对照组（P<0.05）;Transwell细胞迁移结果显示实验组HUVEC迁移穿过微孔膜的细胞数量较对照组明显减少（P<0.05）,其迁移抑制率为49.2%;CCK-8细胞增殖实验结果显示实验组HUVEC增殖数量较对照组明显减少（P<0.05）,其增殖抑制率为73.2%。结论 在大肠癌细胞中,NF-κB抑制剂PDTC可能通过下调NF-κB的活性而降低其体外血管生成能力。     

PTEN对髓系白血病细胞VEGF及MMP表达的影响简

 目的 探讨在慢性髓系白血病中与张力蛋白同源的10号染色体缺失的磷酸酶基因(PTEN)对血管内皮生长因子(VEGF)及金属基质蛋白酶(MMP)相互影响及其作用机制。方法 1)研究10例慢性髓系白血病慢性期CML-CP、10例急变期CML-BC及10例正常人骨髓单个核细胞内PTEN、VEGF、MMP-2和MMP-9 mRNA表达水平变化。2)将携带有野生型PTEN和绿色荧光蛋白的腺病毒（Ad-PTEN-GFP）及对照载体腺病毒（Ad-GFP）转染人慢性髓系白血病细胞系K562。MTT检测细胞增殖;荧光定量PCR（FQ-PCR）检测PTEN、VEGF、MMP-2和MMP-9 mRNA水平变化,Western blot及明胶酶谱检测PTEN、p-Akt、VEGF、MMP-2和MMP-9蛋白表达。结果 CML-BC患者中PTEN mRNA表达水平低于CML-CP及正常对照组(P<0.05),而VEGF、MMP-2、MMP-9 mRNA在CML-BC患者中均高于CML-CP及正常对照组(P<0.05)。以MOI=200转染K562细胞3d后Ad-PTEN-GFP组K562细胞内VEGF、MMP-2、MMP-9 mRNA表达水平均明显低于Ad-GPF组和未转染组(P<0.05),PTEN与VEGF、MMP-2、MMP-9 mRNA表达水平负相关,转染Ad-PTEN-GFP组与转染Ad-GFP组比较VEGF、MMP-2、MMP-9 mRNA表达水平分别降低4.80、5.88、5.72倍,p-Akt及VEGF、MMP-2、MMP-9蛋白表达水平分别降低26.0、5.23、2.86、4.76倍。结论 PTEN基因可能通过抑制VEGF、MMP-2、MMP-9表达,抑制髓系白血病细胞血管新生及侵袭。     

最新分子细胞生物学方法与技术研究进展

分子细胞生物学是从20世纪60年代迅速发展起来的一门新兴学科,通过对细胞核以及细胞质内的各种超微结构及其功能更为直观的认识,尤其是从分子水平上对其进行深入的探讨,使得分子细胞生物学日臻完善,并且也成为研究生命科学的重要技术.在医学研究领域,体细胞核移植、干细胞定向诱导分化、细胞重编程(特别是诱导性多潜能干细胞技术)的研究为我们制备体外疾病模型、研究疾病发生机制、寻求细胞及组织移植的新材料方面提供了重要的技术支撑.     

Core labeling of adenovirus with EGFP

The study of adenovirus could greatly benefit from diverse methods of virus detection. Recently, it has been demonstrated that carboxy-terminal EGFP fusions of adenovirus core proteins Mu, V, and VII properly localize to the nucleus and display novel function in the cell. Based on these observations, we hypothesized that the core proteins may serve as targets for labeling the adenovirus core with fluorescent proteins. To this end, we constructed various chimeric expression vectors with fusion core genes (Mu-EGFP, V-EGFP, preVII-EGFP, and matVII-EGFP) while maintaining expression of the native proteins. Expression of the fusion core proteins was suboptimal using E1 expression vectors with both conventional CMV and modified (with adenovirus tripartite leader sequence) CMV5 promoters, resulting in non-labeled viral particles. However, robust expression equivalent to the native protein was observed when the fusion genes were placed in the deleted E3 region. The efficient Ad-wt-E3-V-EGFP and Ad-wt-E3-preVII-EGFP expression vectors were labeled allowing visualization of purified virus and tracking of the viral core during early infection. The vectors maintained their viral function, including viral DNA replication, viral DNA encapsidation, cytopathic effect, and thermostability. Core labeling offers a means to track the adenovirus core in vector targeting studies as well as basic adenovirus virology.     

新城疫病毒对肿瘤细胞生物学行为的影响

目的：研究新城疫病毒（NDV）对肿瘤细胞的作用。方法：采用空斑试验观察NDV对鸡胚成纤维细胞（CEF）的作用。通过细胞抑制试验，琼脂糖凝胶电泳，TUNEL染色，细胞骨架染色及细胞唾液酸含量测定等，观察NDV对肿瘤细胞的影响。结果：NDV对CEF，HeLa及Hep-2等肿瘤细胞可产生明显的病变，而对人的羊膜细胞（Wish细胞）无明显影响；对Hela细胞和Hep-2细胞能产生明显的生长抑制作用。但无量效依赖关系。NDV还可导致以凋亡为主的细胞死亡。引起Hela细胞和Hep-2细胞的细胞骨架发生改变，以及去除肿瘤细胞表达唾液酸的作用。结论：NDV能选择性地作用于人肿瘤细胞。抑制肿瘤细胞的生长，导致肿瘤细胞发生凋亡，有望成为一种有效的抗肿瘤生物制剂。     

Assessment of the invasive potential of human gynecological tumor cell lines with the in vitro Boyden chamber assay: influences of the ability of cells to migrate through the filter membrane

The Boyden chamber assay is widely used for in vitro measurement of the invasive capacity of cells. However, results can be affected significantly if certain precautions are not taken. Using the Boyden chamber assay we investigated in vitro the invasive potential of a variety of human gynecological tumor cell lines to degrade and migrate through the artificial basement membrane matrix Matrigel. However, in the absence of this Matrigel layer large differences were observed in the ability of cells to adhere to, migrate through and attach to the lower side of the filter membranes. These differences were influenced by cell density, degree of directional locomotion, and the size of the filter pores. To adjust for these influences (which are not directly correlated to the capacity of cells to traverse the Matrigel layer), invasion results were corrected for the ability of cells to migrate through the filter membrane. In addition, the invasion of MDA-MB-231 cells was used as an internal standard to compensate for variations in the Matrigel layer between different experiments. Overall, in our experimental set up, the five human breast cancer cell lines were the most invasive (mean invasion ± SEM relative to MDA-MB-231 invasion: 104.7 ± 6.1%), the five human ovarian cancer cell lines the least invasive (60.2 ± 2.2%) and the six human endometrial cancer cell lines showed an intermediate capacity (79.1 ± 3.5%). In conclusion, the Boyden chamber assay can be used reliably for studying the invasive potential of cells in vitro, if the ability of the cells to migrate through the filter is taken into account, and a reference cell line is included to enable comparison of the data obtained from independently performed experiments on different cell lines.     

Nitric oxide induced by tumor cells activates tumor cell adhesion to endothelial cells and permeability of the endothelium in vitro

Human fibrosarcoma HT1080 cell surface phenotype analysis revealed the expression of "cluster of differentiation 15" (CD15) antigen and to a lesser extent, of "very late antigen-4" (VLA-4). Expression of "endothelial-leukocyte adhesion molecule-1" (ELAM-1) was negligible on resting human umbilical vascular endothelial cells (HUVECs), but its expression could be induced by HT1080 conditioned medium. HT1080 cell adhesion to HUVECs was partially dependent on CD15/ELAM-1 adhesion molecules. HT1080 cell adhesion to HUVECs induced the enhancement of nitric oxide (NO) production from HUVECs. Exogenous NO and NO from HUVECs enhanced ELAM-1 expression on HUVECs, HT1080 cell adhesion to HUVECs, permeability of the HUVEC monolayer, and HT1080 cell invasion through the HUVEC monolayer. These enhancements were not induced by NO synthase inhibitor, N^G-nitro-L-arginine methyl ester (L-NAME). These results suggest that NO expression induced by tumor cells via the CD15/ELAM-1 adhesion system may contribute to enhancement of tumor cell adhesion to endothelial cells and hyperpermeability of the endothelium, facilitating tumor cell invasion.     

共表达EGFP和CXCR4的大鼠骨髓间充质干细胞的构建及其迁移能力

目的 构建携带增强绿色荧光蛋白(EGFP)及CXCR4慢病毒载体并实现其在大鼠骨髓间充质干细胞(rMSCs)中的表达,观察转CXCR4基因后对rMSCs迁移能力的影响。方法 RT-PCR扩增大鼠CXCR4编码区片段,将其插入慢病毒载体质粒PNL-IRES2-EGFP,获得的PNL-CXCR4-IRES2-EGFP与包装及包膜质粒用脂质体法共转染293T细胞,包装生产慢病毒。所获慢病毒转染rMSCs后,用RT-PCR、Western blot、细胞免疫荧光组织化学和流式细胞术检测转CXCR4基因rMSCs组、转空载体rMSCs组中CXCR4表达情况。利用Transwell方法检测两组rMSCs在SDF-1作用下的迁移能力。结果 双酶切和测序证实,PNL-CXCR4-IRES2- EGFP构建正确,转CXCR4基因rMSCs组CXCR4表达明显增多,在SDF-1α作用下迁移能力明显增强。结论 成功构建带有EGFP和大鼠CXCR4的慢病毒载体,并获得CXCR4-rMSCs基因工程细胞,为深入研究SDF/CXCR4轴在rMSCs向损伤组织定向迁移中的作用奠定了基础。     

5-氮-2′-脱氧胞苷对结肠癌细胞生物学行为的影响

目的检测去甲基化药物5-氮-2′-脱氧胞苷（5-aza-2′-deoxycytidine,5-aza-dC）对结肠癌细胞株SW620、COLO205和HT29生物学行为的影响,并研究该药物对多个基因表达的影响。方法5-aza-dC处理对各结肠癌细胞生长周期、凋亡、细胞迁移和侵袭能力的影响分别采用流式细胞术、Annexin V/Propidium Iodide法、细胞划痕实验和Transwell小室侵袭实验检测。采用RT-PCR法检测抑癌基因THBS1、TIMP3、RASSF1A和癌基因c-myc、c-fos、bax在5-aza-dC处理前后各结肠癌细胞株中的表达改变情况。结果5-aza-dC处理后,3株结肠癌细胞的生长周期均明显阻滞于G2/M期,细胞凋亡率显著增加（P〈0.05）。划痕实验后72h,对照组结肠癌细胞明显向划痕的中央迁移,而药物处理组结肠癌细胞迁移不明显。5-aza-dC处理后,结肠癌细胞的侵袭能力较未处理组降低（P〈0.05）。5-aza-dC可恢复结肠癌细胞中多个抑癌基因的表达,但是对癌基因的表达没有影响。结论5-aza-dC对结肠癌细胞有阻滞细胞生长周期、促进凋亡及抑制细胞迁移和侵袭能力等作用,该作用可能是通过恢复多个抑癌基因的表达来实现的。     

大气压冷等离子体对肿瘤细胞增殖和凋亡的影响及其机制

目的:探讨大气压冷等离子体（CAP）对人肿瘤细胞增殖和凋亡的影响。方法:将处于对数生长期的人神经胶质瘤细胞（U87）和宫颈癌细胞（Hela）接种于培养板或培养皿中,待细胞贴壁生长后,将其随机分为正常对照（control）组、氦气（He）组和CAP不同时间处理组,细胞在接受不同时间CAP处理后,采用CCK-8方法检测细胞活力,流式细胞仪检测细胞凋亡情况,蛋白印迹法检测凋亡相关蛋白caspase3和氧化应激相关蛋白Nrf2的表达水平。结果:He处理对U87和Hela细胞的增殖能力和自发凋亡无明显影响,CAP处理后两种肿瘤细胞的细胞活力均显著降低,凋亡水平明显上升,caspase3蛋白和Nrf2蛋白的表达显著增加,CAP处理时间越长,效应越明显。结论:本实验条件下的CAP处理可抑制人肿瘤细胞的增殖,并诱导其凋亡,其机制可能与CAP导致的氧化应激有关。     

检测甲型流感病毒的绿色荧光蛋白报告系统的构建与鉴定

目的 构建pDZ-EGFP的真核表达重组质粒,转染MDCK细胞,建立增强型绿色荧光蛋白稳定转染的报告细胞系,提供更为直观、快速的检测甲型流感病毒的新途径.方法 将PCR扩增的增强型绿色荧光蛋白(EGFP)报告基因插入到pDZ载体中,将获得的pDZ-EGFP重组质粒用lipo-fectamine 2000转染MDCK细胞,通过G418进行选择培养,建立稳定转染的细胞系.传至3代,提取细胞总DNA,用EGFP的特异性引物进行PCR扩增及测序,鉴定细胞报告系统的稳定性;接种标准甲型流感毒株,用荧光显微镜和蛋白免疫印迹法检测EGFP的表达情况验证其应用性;另外,接种临床样本100份,用EGFP细胞报告系统检测的结果与Real-time RT-PCR检测结果进行比较,鉴定细胞报告系统的特异度和灵敏度.结果 稳定细胞系经传至3代,特异性EGFP引物利用PCR扩增到816bp的目的条带,测序结果与扩增的EGFP基因序列100％符合;稳定细胞系接种标准甲型流感毒株,24h后在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的增强表达,72h后用细胞裂解产物与EGFP的特异性抗体反应,获得目的条带;EGFP细胞报告系统检测的100份临床样本与Real-time RT-PCR检测结果相比,其特异度和灵敏度分别为88.52％和89.74％.结论 成功构建了pDZ-EGFP真核表达载体及稳定转染的MDCK细胞系,为甲型流感病毒的细胞培养鉴定及后期的致病机制的研究奠定了基础.     

重组MAGE-A1/EGFP质粒转染人树突状细胞体外诱导MAGE-A1特异性T细胞免疫

目的:应用人重组真核表达载体pMAGE-A1/EGFP转染的树突状细胞(DCs)在体外诱导MAGE-A1特异性T 细胞免疫。方法:构建重组质粒pMAGE-A1/EGFP,体外电转染该质粒入DCs,通过流式细胞仪检测和胞内染色法LDH法比较转染前后DCs在蛋白表达、细胞成熟度和诱导MAGE-A1特异性T细胞免疫能力的差异。结果:成功构建pMAGE-A1/EGFP 真核表达质粒,电穿孔法导入DCs后观察到MAGE-A1与EPFG实现等效表达,分别为8．8％±0．9％和8．47％±0．78％。 pMAGE-A1/EGFP转染的DCs表面CD86、CD40L和CD83表达水平显著升高,提示DCs的成熟度增加;同时表达的MAGE-A1 蛋白可与小鼠来源抗MAGE-A1的单抗发生特异性结合,并在体外诱导MAGE-A1特异性CD4+T细胞克隆扩增,当再次接触 MAGE-A1抗原时大量分泌IFN-γ。结论:pMAGE-A1/EGFP转染的DCs不仅能在体外诱导MAGE-A1特异性T细胞免疫,还可通过流式细胞仪进行快速检测,为临床开展MAGE-A1为基础的免疫治疗奠定了一定基础。