Endocannabinoids anandamide and its cannabinoid receptors in liver fibrosis after murine schistosomiasis

This study examined endogenous carmabinoid （ECB）-anandamide （AEA） and its cannabinoid receptors （CBR） in mice liver with the development ofschistosomajaponicum. Mice were infected with schistosoma by means of pasting the cercaria onto their abdomens. Liver fibrosis was pathologically confirmed nine weeks after the infection. High performance liquid chromatography （HPLC） was employed to determine the concentration of AEA in the plasma of mice. Immunofluo-rescence was used to detect the expression of CBR1 and CBR2 in liver tissue. Morphological examination showed typical pathological changes, with worm tubercles of schistosoma deposited in the liver tissue, fibrosis around the worm tubercles and infiltration or soakage of inflammatory cells. Also, CBR1 and CBR2 were present in hepatocytes and hepatic sinusoids of the two groups, but they were obviously enhanced in the schistosoma-infected mice. However, the average optical density of CBR1 in the negative control and fibrosis group was 13.28±7.32 and 30.55±7.78, and CBR2 were 28.13±6.42 and 52.29±4.24 （P〈0.05）. The levels of AEA in the fibrosis group were significantly increased as compared with those of the control group. The concentrations of AEA were （0.37±0.07） and （5.67±1.34） ng/mL （P〈0.05）. It is concluded that the expression of endocannabinoids AEA and its cannabinoid receptor CBR were significantly increased in schistosoma-infected mice. Endogenous endocannabinoids may be involved in the development of schistosoma-induced liver fibrosis.     

大麻Ⅰ型受体抑制剂研究进展

临床试验表明,大麻Ⅰ型受体(CB₁)抑制剂利莫那班(rimonabant)在治疗肥胖和戒烟方面具有良好效果^［1］,CB₁受体抑制剂还具有治疗药物成瘾、认知和记忆紊乱、神经错乱等疾病的潜力。CB₁受体抑制剂与诸多疾病的相关性大大推进了新的CB₁受体抑制剂的发展。本文主要对各种CB₁受体抑制剂的结构及活性研究的最新进展进行综述。     

大麻素受体2在尖锐湿疣和子宫颈癌中的表达及意义

目的观察与分析大麻素受体2(CB2)在尖锐湿疣和子宫颈癌中的表达及意义。方法采集尖锐湿疣、宫颈上皮内瘤变及子宫颈癌患者标本,以免疫组织化学法及实时定量聚合酶链反应(RT-PCR)法检测CB2在组织中的表达情况。结果免疫组织化学法检测显示,CB2在尖锐湿疣、子宫颈上皮内瘤变、子宫颈癌组织中均有表达;累积光密度值分析显示,CB2在尖锐湿疣全子宫切除术后阴道残端出血组织中表达量最低(25 361.33±15 462.71),在子宫颈癌组织中表达量最高(69 863.66±14 203.88),子宫颈上皮内瘤变组织中则居中,但随子宫颈上皮内瘤变分级程度不断增高而表达量增加,子宫颈上皮内瘤变低分级为63 571.98±13 417.21,高分级为65 719.27±13 651.09,差异有统计学意义(P<0.05);CB2 mRNA在尖锐湿疣组织中表达量最低,与内参β-actin mRNA比值为1.35±0.31,在子宫颈癌组织中表达量最高,与β-actin mRNA比值为7.49±0.98,子宫颈上皮内瘤变组织中表达居中,呈现随子宫颈上皮内瘤变分级程度增高而增加的趋势,其在低分级组织中为3.54±0.42,高分级组织中为5.56±0.38,差异均具有统计学意义(P<0.05)。结论 CB2可能参与了子宫颈癌的发生发展过程。     

晚期糖基化终末产物受体真核表达载体的构建与表达

目的 构建带HA标签的晚期糖基化终末产物受体真核细胞表达载体.方法 采用PCR方法从人cDNA文库中扩增RAGE基因编码区,使用常规酶切、连接方法将其重组至pcDNA3真核表达载体中,对阳性克隆进行酶切、PCR和测序鉴定.以RAGE/pcDNA3重组质粒为模板,运用突变方法在RAGE氨基末端信号肽后插入HA序列.利用Western blotting在HEK 293细胞中对经过测序鉴定的HA-RAGE\pcDNA3重组质粒的表达进行了检测.结果 RAGE/pcDNA3重组质粒经酶切、PCR和测序鉴定正确无误,HA-RAGE\pcDNA3重组质粒可在HEK 293细胞中表达.结论 成功构建了带HA标签的RAGE真核细胞表达载体,该载体能在真核细胞中表达,为进一步研究RAGE在细胞信号转导途径中的作用提供了一个重要的工具.     

大麻素2型受体在皮肤鳞状细胞癌的表达

目的探讨大麻素2型受体(CB2受体)在人正常皮肤与皮肤鳞状细胞癌中的表达规律及其意义。方法采用免疫组化、RT-PCR检测人正常皮肤和皮肤鳞状细胞癌组织中CB2受体在蛋白和mRNA不同水平的表达情况。结果CB2受体在人正常皮肤和鳞状细胞癌均有表达;皮肤鳞状细胞癌与正常皮肤表达CB2的强度间的差异有统计学意义(P<0.05)。结论皮肤鳞状细胞癌中CB2受体在蛋白和基因水平表达均升高,皮肤鳞状细胞癌CB2受体表达强度明显大于正常皮肤,提示CB2与皮肤鳞状细胞癌的发生和发展关系密切。     

流行性出血热病毒多肽的免疫印渍分析

对4株不同来源的流行性出血热病毒(EHFV)的抗原进行免疫印渍分析。转印后,与其兔抗血清分别作交叉酶免疫染色,均出现一条共同的深染的区带,其分子量为52.5Kd。用A35单克隆抗体(McAb)或病人血清染色,亦见此区带。述一区带的多肽可能是EHFV引起机体免疫应答的主要抗原成份。     

大麻素Ⅱ型受体在结节病、环状肉芽肿中的组织分布

目的：研究大麻Ⅱ型受体（CB2）在人正常皮肤及结节病、环状肉芽肿的组织分布。方法：用兔抗人CB2受体抗体做免疫组化,检测人皮肤及结节病、环状肉芽肿的组织CB2受体表达分布情况。结果：CB2受体在人皮肤及结节病、环状肉芽肿均有表达分布,且结节病、环状肉芽肿的CB2受体过度表达。结论：大麻素受体CB2的表达与皮肤结节病、环状肉芽肿关系密切。     

大麻素II型受体参与调控低氧微环境下大鼠骨髓间充质干细胞的骨向分化

目的：研究大麻素II型受体（CB2）对低氧微环境调控骨髓间充质干细胞（BMSCs）骨向分化的作用及其调控机制。方法：全骨髓细胞贴壁法分离培养rBMSCs。应用化学低氧剂CoCl2建立低氧模型,实时荧光定量PCR和Western blot检测成骨关键蛋白RUNX2、OCN在基因和蛋白水平的表达,评估骨向分化能力。进一步结合CB2抑制剂AM630探讨CB2在低氧微环境下介导rBMSCs骨向分化中的作用。结果：与对照组比,低氧处理24、48、72、96 h后rBMSCs的RUNX2、OCN mRNA和蛋白表达量显著上升（P＜0.05）;同时低氧处理上调CB2 mRNA和蛋白表达（P＜0.05）。CB2抑制剂AM630下调低氧所促进的RUNX2、OCN的表达（P＜0.05）。结论：CB2参与低氧促进rBMSCs的成骨分化的调控。     

激活大麻素受体1诱导的单核巨噬细胞J774A.1的迁移依赖RNA结合蛋白HuR

目的 研究大麻素受体1(cannabinoid receptor 1, CB1)在单核巨噬细胞迁移中的重要作用以及RNA结合蛋白人抗原R(human antigen R, HuR)参与其中的可能机制。方法 选用单核巨噬细胞系J774A.1,应用琼脂糖凝胶电泳和免疫荧光染色技术鉴定J774A.1中CB1以及HuR的表达;ACEA和AM281分别为CB1的药理学激动剂和拮抗剂,应用Boyden chamber法检测ACEA和AM281对J774A.1迁移活性的影响。HuR的基因干扰用于确定激活CB1诱导的J774A.1迁移功能是否依赖HuR;胞质蛋白的分离用于探究激活CB1是否能引起J774A.1胞质中HuR的富集;RT-qPCR和Western blotting法检测CB1和HuR mRNA和蛋白质的变化情况。结果 该研究证明J774A.1在基因和蛋白质水平上均表达CB1和HuR;激活CB1能够促进J774A.1的迁移(P<0.01)并且能够被其药理学拮抗剂AM281所抑制;激活CB1诱导的J774A.1的迁移依赖HuR;激活CB1促进了J774A.1胞质中HuR的富集进一步影响了CB1的表达,由此HuR参与了激活CB1诱导的J774A.1的迁移。结论 激活CB1能够诱导单核巨噬细胞系J774A.1的迁移,且此过程依赖RNA结合蛋白HuR。     

胶质细胞源性神经营养因子在链霉菌的分泌表达

目的：构建胶质细胞源性神经营养因子（GDNF）表达质粒，实现GDNF在链霉菌的分泌表达。方法：从人基因组中克隆GDNF成熟肽编码基因，与链霉菌酪蛋白酶melC1启动子和信号肽DNA序列融合。melC1信号肽DNA与GDNF融合后地翻译框呆的漂移，且GDNF的转录受控于melC1启动子。融合基因与链霉菌载体pIJ702连接并转化Slividans TK24原生质体。结果：经抗性筛选及限制性酶切分析获得重组质粒pIJMC。携带pIJMG的链霉菌培养上清存在约15000的特异性表达带，与GDNF成熟肽的分子质量吻合。结论：GDNF在MelC1信号肽指导下可以在链霉菌分泌表达。     

mTLR2基因在CHO细胞中的表达

目的在CHO细胞中表达小鼠TLR2(mTLR2)。方法将目的基因克隆到真核表达载体pcDNA3.1中,并将其转染到CHO细胞,用G418筛选阳性克隆。采用PCR方法,检测外源基因的整合。采用Westernblot、免疫组织化学对转染细胞的mTLR2表达进行鉴定。结果成功构建了pcDNA-mTLR2重组质粒。将其转染到CHO细胞,经G418筛选获得阳性细胞克隆。阳性细胞克隆经PCR检测表明TLR2基因得到稳定整合。Westernblot分析显示在分子量约95000处可见清晰的阳性反应条带。免疫组织化学检测显示转染细胞表达mTLR2。结论获得了表达mTLR2的细胞株,为进一步进行相关研究奠定了基础。     

非酒精性脂肪肝治疗的分子靶点

非酒精性脂肪肝（non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD）的发病率日益增高,迄今为止尚没有确切有效的治疗措施。目前的研究主要针对NAFLD及其代谢障碍的分子机制,包括核转录因子孕烷X受体（pregnane X receptor,PXR）、叉头蛋白O1（forkhead box protein O1,FOXO1）、类法尼醇X受体（farnesoid X receptor,FXR）、过氧化物酶体增殖物激活受体（peroxisome proliferator-activated receptors,PPARs）、甲状腺激素受体（thyroid hormone receptor,THR）、腺苷酸活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase,AMPK）、p53、核因子E2相关因子2（nuclear erythroid 2-related factor 2,Nrf2）、线粒体、大麻素受体和胆汁酸受体等。本文主要就这些分子机制作一综述,探讨这些靶点的潜在治疗价值。     

哺乳动物MHC I类分子α链的信号肽预测及保守性分析

目的 主要组织相容性复合体（major histocompatibility complex,MHC）由一紧密连锁、高度多态的基因座组成,在脊椎动物的移植排斥反应、免疫应答和免疫调控等方面发挥极其重要的作用。MHCⅠ类分子由α链和β微球蛋白以非共价键结合组成,其中α链直接参与抗原肽的呈递,显示极为丰富的多态性。本研究旨在分析哺乳动物MHCⅠ类分子α链的信号肽是否呈现出多态性,并明确其分子生物学特征。方法 利用NCBI网站收集人等8种哺乳动物编码MHCⅠ类分子α链的mRNA序列,采用信号肽在线预测软件SignalP 4.1和LipoP1.0分析α链信号肽存在的概率、长度及信号肽酶切位点;利用Mega4.1软件进行信号肽氨基酸序列比对,分析其保守性。结果 8种哺乳动物MHCⅠ类分子α链N端的前24个氨基酸均为其信号肽区,信号肽酶切位点全部属于信号肽酶Ⅰ型,且信号肽酶切位点的-3、 -1、1、2、3位置上的氨基酸非常保守,是信号肽酶识别的关键位点。氨基酸序列比对分析发现α链信号肽24个氨基酸中有13个位点的氨基酸相同,占信号肽氨基酸总数的54.17%。结论 8种哺乳动物MHCⅠ类分子α链的信号肽具有较强的保守性,这可能与信号肽指导蛋白质分选和蛋白质定位的功能相关。     

阴虚动风证帕金森病异动症大鼠大麻素CB1受体变化及复方地黄方的干预作用

目的 探讨阴虚动风证帕金森病(PD)异动症(LID)大鼠纹状体内大麻素CB1受体的表达及复方地黄方的干预作用.方法 采用6-羟基多巴胺(6-OHDA)偏侧损毁黑质制备帕金森病大鼠模型,进一步腹腔注射左旋多巴+苄丝肼(50 mg/kg 左旋多巴和12.5 mg/kg苄丝肼)制备LID大鼠模型,并随机分为LID组、复方地黄方组,另取正常对照组、假手术组大鼠为对照,每组6只.分别在4周、6周进行神经行为学检测后,处死大鼠并取纹状体,应用Western blot法测定各组大鼠纹状体内大麻素CB1受体的表达情况.结果 LID大鼠随造模时间延长,AIM评分呈增加趋势(P<0.05),旋转启动时间呈缩短趋势(P>0.05),旋转持续时间呈增加趋势(P<0.01),剂峰旋转圈数呈减少趋势(P>0.05),复方地黄方可改善上述变化.LID大鼠大麻素CB1受体表达增加,且随造模时间延长呈现减少趋势(P<0.01),而复方地黄方干预后大麻素CB1受体的表达呈现逐渐增加的趋势(P<0.01).结论 LID模型大鼠大麻素CB1受体的含量明显升高,其变化能够较好的反映阴虚动风证的严重程度,复方地黄方干预LID模型大鼠可能是通过激活纹状体内大麻素CB1受体,抑制兴奋性氨基酸(主要是谷氨酸)的释放和诱导细胞发生级联反应来减弱神经元的兴奋性,从而起到减轻L-dopa的兴奋毒性的作用.     

半胱氨酰白三烯受体2多克隆抗体制备及其鉴定

目的:制备半胱氨酰白三烯受体2(CysLT_2)多克隆抗体,并鉴定其免疫学特性及应用.方法:以KLH偶联的CysLT_2受体多肽免疫家兔制备抗体,用间接ELISA法测定抗体效价,以抗原阻断法测定抗体敏感性及特异性;同时,以新制备的抗体进行Western blot和免疫组化,检测CysLT_2受体的组织表达.结果:ELISA测定显示,获得的家兔抗CysLT_2受体抗体的效价大于1/1 047 296,对CysLT_2受体的特异性强,对CysLT_1受体和GPR17基本无交叉反应.Western blot结果显示,CysLT_2受体在大鼠、小鼠肾、脑和肺中有较高的表达,其分子量在40 kD左右.免疫组化结果表明,CysLT_2受体主要表达在大鼠神经元,也表达在部分星形胶质细胞.结论:制备的CysLT_2受体多克隆抗体具有高效价和高特异性,能满足Western blot和免疫组化检测的要求.     

miR-29s通过下调大麻素受体1抑制ACEA促J774A.1细胞迁移的活性

目的 研究miR-29a-3p、miR-29b-3p和miR-29c-3p是否可以影响J774A.1细胞中大麻素受体1（cannabinoid receptor type 1,CB1）的表达以及其迁移功能。方法 RT-qPCR法检测CB1 mRNA表达;Boyden chamber法检测J774A.1细胞迁移能力的变化。结果 本研究证明了在J774A.1细胞里,CB1的激动剂ACEA（Arachidonyl-2'-chloroethylamide）可以上调CB1 mRNA的表达,而分别转染了miR-29a-3p、miR-29b-3p和miR-29c-3p的mimics后可以抑制这一过程;同时对J774A.1细胞转染miR-29a-3p、miR-29b-3p和miR-29c-3p的mimics可以阻碍ACEA诱导的J774A.1细胞的迁移。结论 miR-29s通过下调CB1的表达抑制了ACEA促J774A.1细胞迁移的活性。     

AD7c-NTP与胰岛素受体在小鼠海马CA1区的共存关系

目的观察Alzheimer相关的神经丝蛋白(Alzheimer-associated neuronal thread protein,AD7c-NTP)在正常小鼠海马CA1区的分布及其与胰岛素受体的共存关系。方法应用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白印迹(Western blot)方法观察小鼠脑蛋白提取物中AD7c-NTP的相对分子质量大小和抗体的特异性。应用免疫组织化学方法观察AD7c-NTP在正常小鼠海马CA1区的分布。应用免疫组织化学双重标记技术观察AD7c-NTP与胰岛素受体的共存关系。结果AD7c-NTP免疫反应阳性条带位于相对分子质量约41 000的位置,与文献报道一致;正常小鼠海马CA1区有AD7c-NTP免疫反应阳性细胞分布,细胞膜和细胞质染色并存在AD7c-NTP和胰岛素受体免疫反应双阳性细胞。结论AD7c-NTP在正常小鼠海马CA1区有分布并与胰岛素受体有共存关系,提示AD7c-NTP的功能可能与胰岛素信号通路有关。     

瘦素对大鼠肝细胞瘦素受体蛋白、基因表达及酪氨酸磷酸化的影响

目的观察瘦素对大鼠肝细胞瘦素受体蛋白、基因表达及酪氨酸磷酸化的影响。方法分离、培养新生Sprague-Dawley大鼠肝脏细胞,与瘦素共同孵育12 h、24 h及36 h,提取蛋白后用Western blot法检测瘦素受体的蛋白水平的变化,用RT-PCR法检测大鼠肝细胞瘦素受体的mRNA水平,用免疫共沉淀法检测瘦素受体的酪氨酸磷酸化程度。结果大鼠肝细胞的瘦素受体的蛋白水平在与瘦素共同孵育12 h、24 h和36 h后与对照组相比差异无统计学意义(P>0.05)。大鼠肝细胞瘦素受体的mRNA表达在孵育12 h后与对照组相比差异无统计学意义(P>0.05),孵育24 h及36 h后,与对照组及孵育12 h时相比,mRNA水平明显升高,差异有统计学意义(P<0.05)。经瘦素作用12 h后,对大鼠肝脏细胞瘦素受体酪氨酸磷酸化无显著影响(P>0.05),但孵育24 h及36 h后,大鼠肝脏细胞瘦素受体的酪氨酸磷酸化程度与对照组及瘦素作用12 h后相比均显著升高,差异有统计学意义(P<0.05)。结论瘦素可促进大鼠肝细胞瘦素受体的mRNA表达并增强其酪氨酸磷酸化程度。     

豚鼠视网膜组织M4受体的表达

目的 检测M4受体在豚鼠视网膜组织的表达及分布.方法 4周龄三色豚鼠21只,其中7只动物眼球制备石蜡切片,免疫组织化学染色法检测后极部视网膜组织M4受体表达与分布;其余动物分别提取眼视网膜组织RNA和蛋白质,逆转录聚和酶链反应(RT-PER)、蛋白质免疫印迹(Western blot)法检测M4受体mRNA和蛋白质表达.结果 免疫组织化学染色显示,M4受体分布于豚鼠视网膜RPE细胞层,光感受器细胞层、外核层、内核层,大多数神经节细胞,以及内从状层和内核层交界区;豚鼠视网膜组织表达M4受体mRNA,扩增产物约为221 bp,阴性对照未见扩增产物.免疫印迹显示,豚鼠视网膜组织表达明显的M4受体免疫反应活性,分子量约为38 000.阴性对照组无阳性表达条带.结论 豚鼠视网膜组织有M4受体蛋白表达.     

豚鼠视网膜组织M4受体的表达

目的 检测M4受体在豚鼠视网膜组织的表达及分布.方法 4周龄三色豚鼠21只,其中7只动物眼球制备石蜡切片,免疫组织化学染色法检测后极部视网膜组织M4受体表达与分布;其余动物分别提取眼视网膜组织RNA和蛋白质,逆转录聚和酶链反应(RT-PER)、蛋白质免疫印迹(Western blot)法检测M4受体mRNA和蛋白质表达.结果 免疫组织化学染色显示,M4受体分布于豚鼠视网膜RPE细胞层,光感受器细胞层、外核层、内核层,大多数神经节细胞,以及内从状层和内核层交界区;豚鼠视网膜组织表达M4受体mRNA,扩增产物约为221 bp,阴性对照未见扩增产物.免疫印迹显示,豚鼠视网膜组织表达明显的M4受体免疫反应活性,分子量约为38 000.阴性对照组无阳性表达条带.结论 豚鼠视网膜组织有M4受体蛋白表达.