健骨颗粒含药血清培养成骨细胞整合素/黏着斑激酶信号通路相关因子的 表达**☆

背景：目前有关成骨细胞整合素的功能状态及整合素信号转导调控的研究较少。健骨颗粒对成骨细胞整合素表达水平及信号转导通路调控的作用未被阐明。 目的：观察健骨颗粒含药血清对成骨细胞黏附的影响，揭示健骨颗粒对成骨细胞整合素表达水平及信号转导通路的调控作用。 方法：健康雄性3月龄SD大鼠用于制备健骨颗粒含药血清，选取最佳剂量的含药血清干预第3代大鼠成骨细胞，ELISA法检测培养液中纤连蛋白、Ⅰ型胶原、玻连蛋白的水平，Western blot法检测成骨细胞黏着斑激酶的磷酸化情况，实时荧光定量PCR法检测成骨细胞纤连蛋白、Ⅰ型胶原、玻连蛋白、黏着斑激酶mRNA的表达。 结果与结论：浓度为20%的健骨颗粒含药血清能明显增强体外培养成骨细胞的增殖活力。随着含药血清干预时间的延长，成骨细胞表达及分泌的纤连蛋白、Ⅰ型胶原、玻连蛋白、黏着斑激酶mRNA及蛋白水平逐渐上升，黏着斑激酶的磷酸化水平也逐渐增高(P < 0.05)；均明显高于同期的生理盐水血清干预水平(P < 0.05或P < 0.01)。说明健骨颗粒能作用于成骨细胞整合素激活的粘着斑激酶转导通路各相关因子，使成骨细胞进入“分泌增加→黏附增加→功能增强、分裂增殖→分泌增加”的良性循环，对成骨细胞的成骨效应起正性调节作用。 关键词：健骨颗粒；成骨细胞；整合素；粘着斑激酶；骨质疏松症     

恒定磁场中大鼠成骨细胞的增殖和功能活性

背景：磁场对成骨细胞生物学的影响存在一定的分歧。 目的：探讨不同强度恒定磁场作用不同时间后成骨细胞增殖和功能活性的改变。 方法：用体外培养的SD大鼠成骨细胞第3~5代分别在0,5,22,86,135 mT恒定磁场下培养,观察8,12,24 h后细胞增殖和凋亡变化及细胞上清液中骨钙素及Ⅰ型前胶原C端前肽的表达。 结果与结论：磁场作用8,12 h后,5,22,86,135 mT磁场培养的细胞增殖指数均高于对照组(P < 0.05),作用24 h时,仅5 mT组高于对照组(P < 0.05)。而0,5,22,86,135 mT恒定磁场下培养8,12,24 h的凋亡百分数差异无显著性意义。磁场作用8 h后,22,86,135 mT组骨钙素分泌量均高于对照组(P < 0.05);作用24 h后,135 mT组骨钙素分泌量则明显低于对照组(P < 0.05);而磁场作用8,12 h后,22,86 mT组Ⅰ型前胶原C端前肽分泌量明显高于对照组(P < 0.05),作用24 h后,135 mT组Ⅰ型前胶原C端前肽分泌量则明显低于对照组(P < 0.05)。表明低强度磁场、短时间作用可促进成骨细胞的增殖及成骨物质的分泌,而高强度磁场或磁场暴露时间过长则抑制成骨细胞增殖及成骨物质的分泌。     

骨髓脂肪细胞向成骨细胞的转分化

背景：骨髓脂肪细胞、成骨细胞共同来源于骨髓基质细胞,二者存在基因同源性,在一定的条件下可以相互转分化。 目的：观察骨髓细胞源性脂肪细胞在成骨诱导分化培养条件下转分化为成骨细胞的活性,探索股骨头坏死细胞水平治疗的新途径。 方法：将前脂肪细胞3T3-L1分别进行成骨诱导培养和成脂诱导培养。培养后不同时间点观察细胞形态的变化;并于诱导培养后5,21 d分别进行实时定量-聚合酶链反应检测成骨、成脂分化过程中,细胞中Runt相关基因转录因子2、氧化物增殖体激活物受体γ2、骨钙素和Ⅰ型胶原mRNA表达。并于成骨、成脂培养21 d后采用Wertern-blot法检测相关蛋白的表达。培养细胞爬片,分别进行碱性磷酸酶、钙结节茜素红、油红O染色,观察3T3-L1成骨转分化情况以及成骨细胞活性表达。 结果与结论：3T3-L1在成骨诱导培养5 d后,细胞由圆形逐渐演变成纺锤形和梭形;实时定量-聚合酶链反应检测结果与对照组相比,氧化物增殖体激活物受体γ2 mRNA表达减弱,而Runt相关基因转录因子2、骨钙素和Ⅰ型胶原mRNA表达微量增强。至21 d时,这种表达改变更加明显;Western-blot显示,Runt相关基因转录因子2、骨钙素和Ⅰ型胶原蛋白量增加,而氧化物增殖体激活物受体γ2微量甚至无表达;碱性磷酸酶染色阳性表达较多,茜素红钙结节染色可见多个散在分布的钙结节;油红O染色微量脂滴。提示小鼠骨髓基质细胞源性前脂肪细胞3T3-L1在成骨诱导培养下,可在一定程度上转分化为有生物活性的成骨细胞;小鼠骨髓基质细胞的脂肪细胞和成骨细胞二者之间存在着可塑性。     

降钙素基因相关肽诱导脂肪干细胞向成骨细胞的分化

背景：已证实降钙素基因相关肽可促进成骨细胞的增殖与分化，并加速骨折的愈合、促进异位骨化的形成，但其是否具有促使脂肪干细胞向成骨细胞定向分化的作用作者未查到相关报道。 目的：探讨降钙素基因相关肽在体外定向诱导脂肪干细胞向成骨细胞增殖分化的可行性。 设计、时间及地点：细胞学体外观察，基因及蛋白质学检测，于2006-10/2007-08在武汉大学医学院中心实验室和三峡大学医学院病理实验室完成。 材料：清洁级4月龄健康新西兰大耳白兔2只。 方法：密度梯度离心+贴壁法体外分离培养兔脂肪干细胞，传至第3代分为2组：对照组加入含10 mmol/Lβ-甘油磷酸钠、50 mg/L抗坏血酸、1×10-8 mol/L地塞米松、体积分数为0.15的胎牛血清的RPMI 1640骨诱导培养基，实验组在此基础上加入1 μg/L降钙素基因相关肽进行诱导培养。 主要观察指标：细胞形态学变化，免疫组织化学染色测定细胞碱性磷酸酶活性，四环素标记法检测矿化结节的形成，RT-PCR和Western blot法检测成骨细胞标志性蛋白I型胶原、骨钙素的表达。 结果：实验组脂肪干细胞经成骨诱导培养后，形态规则、多角型细胞增多，细胞倍增时间明显短于对照组。随诱导时间的延长，实验组细胞碱性磷酸酶活性呈增加趋势，诱导7，10，14 d细胞碱性磷酸酶活性均显著高于对照组(t=13.26，P < 0.01)。诱导21 d与对照组比较，实验组形成的金黄色圆形矿化结节数量增多，结节增大。诱导7 d，14 d实验组I型胶原及骨钙素mRNA、蛋白水平的表达均强于对照组。 结论：在体外降钙素基因相关肽能诱导并促进兔脂肪干细胞向成骨细胞方向分化。     

富血小板血浆诱导犬骨髓间充质干细胞的体外成骨*

背景：富血小板血浆中含有大量骨再生所需的生长因子,且各生长因子的比例是机体自身形成的,具有良好的协同作用。 目的：探讨富血小板血浆体外诱导犬骨髓间充质干细胞成骨的效果。 设计、时间及地点：细胞学体外观察,于2007-06/2008-02在中南大学湘雅医院中心实验室完成。 材料：健康12月龄雄性比格犬,由中南大学湘雅医学院实验动物部提供。 方法：收集第3代犬骨髓间充质干细胞,分为4组：对照组加入标准培养基;成骨诱导培养基组向培养板孔内加入含胎牛血清、地塞米松、β-甘油磷酸钠、维生素C的高糖DMEM培养基;富血小板血浆组根据预实验结果,向培养板内加入含体积分数为6.25%富血小板血浆的低糖DMEM培养基;联合组向培养板内加入含地塞米松、β-甘油磷酸钠、维生素C、体积分数为6.25%富血小板血浆的高糖DMEM培养基。 主要观察指标：细胞内碱性磷酸酶活性,免疫细胞化学染色检测Ⅰ型胶原的表达,改进Von Kossa染色标记钙结节形成情况,RT-PCR检测诱导后骨钙素mRNA的表达。 结果：各组碱性磷酸酶活性均随诱导时间的延长而逐渐增高,联合组升高幅度最为明显(P < 0.05)。诱导7,14 d后,成骨诱导培养基组、联合组Ⅰ型胶原均呈阳性表达,富血小板血浆组、对照组Ⅰ型胶原始终呈阴性表达。诱导14 d后,成骨诱导培养基组、联合组可见卵圆形钙结节。诱导7,14 d后,对照组与富血小板血浆组之间骨钙素mRNA表达水平无明显差异(P > 0.05),此2组骨钙素mRNA表达水平均明显低于成骨诱导培养基组、联合组(P < 0.05);成骨诱导培养基组骨钙素mRNA表达水平明显低于联合组(P < 0.05)。 结论：经成骨条件培养基诱导培养的骨髓基质干细胞,富血小板血浆能在体外显著诱导其成骨指标的表达。     

大鼠骨髓间充质干细胞与成骨细胞共育环境下Ⅰ型胶原的表达

背景：骨髓间充质干细胞在不同条件下可以分别分化为成骨细胞、软骨细胞、成肌细胞、脂肪细胞、神经胶质细胞、血管内皮细胞等。 目的：与成骨细胞共培养的条件下，观察大鼠骨髓间充质干细胞Ⅰ型胶原的表达。 设计、时间及地点：细胞学体外观察，于2007-01/08在广州中医药大学附属骨伤科医院细胞室完成。 材料：3月龄SPF级SD大鼠6只用于骨髓间充质干细胞的分离与扩增，1 d龄以内清洁级SD乳鼠10只用于成骨细胞的分离与扩增。 方法：贴壁法分离骨髓间充质干细胞，扩增后以流式细胞仪检测其均一性及细胞表型。采用酶消化法分离培养成骨细胞，以磷酸酶染色观察细胞分泌情况。利用Transwell培养板将成骨细胞和骨髓间充质干细胞在培养液以及其中的大分子蛋白可以相互交流而细胞间不相互接触的培养板内培养，以采用普通培养板单独培养的骨髓间充质干细胞为对照。 主要观察指标：观察骨髓间充质干细胞的形态学变化及矿化能力，20 d后半定量RT-PCR方法检测骨髓间充质干细胞Ⅰ型胶原的表达，茜素红染色后显微镜下计数钙化结节。 结果：流式细胞仪检测结果显示细胞均一性较好，2代细胞均一性在90%以上，CD34、CD45表达为阴性，CD44表达阳性。成骨细胞原代培养20 d时出现不透光的钙化结节，生长期细胞分裂相多见，细胞突起相互连接，汇合时呈铺路石状。茜素红染色矿化结节呈现酒红色，骨碱性磷酸酶染色可见胞质内出现黑色颗粒或块状沉淀。共培养的骨髓间充质干细胞形成的钙化结节数高于对照组(P < 0.05)；与成骨细胞共培养的骨髓间充质干细胞Ⅰ型胶原表达量明显高于对照组(P < 0.01)。 结论：与成骨细胞共培养的骨髓间充质干细胞Ⅰ型胶原的表达量高，成骨能力强。     

丹酚酸B缓释羟基磷灰石颗粒与成骨细胞的活性

摘要 背景：前期实验制备了羟基磷灰石颗粒堆积型多孔支架，可通过调节羟基磷灰石颗粒的尺寸及微观空隙结构更好地构建修复超临界尺寸的生物陶瓷支架。如果再将一些可促骨愈合的药物负载其上，既可控制药物的局部浓度以提高利用率，增加专一性、又可降低不良反应，加快骨愈合。 目的：观察载丹酚酸B缓释羟基磷灰石颗粒对体外培养成骨细胞活性的影响。 方法：分离培养SD大鼠成骨细胞，将羟基磷灰石颗粒、无壳聚糖包裹的丹酚酸B缓释羟基磷灰石颗粒、壳聚糖包裹的丹酚酸B缓释羟基磷灰石颗粒分别与成骨细胞共培养，采用Alamar Blue法检测各组成骨细胞增殖活性；碱性磷酸酶活性检测各组成骨细胞分化情况；免疫细胞化学染色观察各组成骨细胞中Ⅰ型胶原和骨钙素表达。 结果与结论：壳聚糖包裹的丹酚酸B缓释羟基磷灰石颗粒能显著促进SD大鼠成骨细胞的增殖，同时加强碱性磷酸酶表达，其效应持续时间高于羟基磷灰石组、无壳聚糖包裹的丹酚酸B缓释羟基磷灰石组；Ⅰ型胶原和骨钙素表达与羟基磷灰石组无差异。而无壳聚糖包裹的丹酚酸B缓释羟基磷灰石组由于药物的突释对细胞造成毒性，从第2天细胞开始皱缩以致死亡。说明壳聚糖包裹的丹酚酸B缓释羟基磷灰石颗粒在较长时间内具有促进成骨细胞增殖和分化，对成骨细胞的生物学活性无影响，并保持成骨细胞的生物学活性。     

重组碱性成纤维细胞生长因子基因转染对于骨髓源性成骨细胞的

背景：碱性成纤维细胞生长因子对来源于中胚层和神经外胚层的细胞具有明显的促进增殖作用,对骨髓间充质干细胞具有间接的成骨作用。 目的：观察碱性成纤维细胞生长因子基因转染对骨髓源性成骨细胞生物学特性和血管生成的影响,与骨髓间充质干细胞作对比。 设计、时间及地点：对比分析基因转染效果实验,于2007-11-27/2008-12-01在南方医科大学珠江医院中心实验室和动物实验中心完成。 材料：2月龄新西兰大白兔用于骨髓间充质干细胞的分离培养及成骨细胞诱导。5周龄Wistar大鼠用于移植实验。牛pcDNA3-bFGF真核表达质粒由中山大学中山医学院免疫教研室徐霖博士惠赠。 方法：分离兔骨髓间充质干细胞和骨髓源性成骨细胞,采用脂质体介导将牛pcDNA3-bFGF真核表达质粒分别转染体外培养的兔骨髓间充质干细胞和诱导的骨髓源性成骨细胞,G418筛选。稳定转染碱性成纤维细胞生长因子的骨髓源性成骨细胞与磷酸钙胶原材料复合培养,植于Wistar大鼠后腿肌袋内,正常饲养2,4周后取出植入的复合材料,观察血管新生情况。 主要观察指标：碱性成纤维细胞生长因子转染前后骨髓间充质干细胞和骨髓源性成骨细胞生物学特性参数的比较以及骨髓源性成骨细胞转染碱性成纤维细胞生长因子前后新生血管数目的比较。 结果：利用RT-PCR、免疫细胞化学染色分析转染细胞的碱性成纤维细胞生长因子表达情况。从形态、增殖特性和细胞周期、碱性磷酸酶、Ⅰ型胶原等方面分析稳定表达碱性成纤维细胞生长因子的骨髓间充质干细胞和骨髓源性成骨细胞生物学特性。重组牛pcDNA3-bFGF真核表达质粒成功转染目的细胞,经G418筛选稳定表达。转染的细胞有大量目的基因mRNA转录和目的蛋白表达。转染碱性成纤维细胞生长因子基因的骨髓间充质干细胞和骨髓源性成骨细胞生长均加快,细胞周期中增殖期细胞比例明显增加,细胞形态无明显变化。转染与未转染的骨髓源性成骨细胞比较,碱性磷酸酶的分泌量无明显变化(P > 0.05),转染后骨髓间充质干细胞的碱性磷酸酶分泌量小于骨髓源性成骨细胞(P < 0.01)。骨髓源性成骨细胞转染与未转染碱性成纤维细胞生长因子基因组均有Ⅰ型胶原mRNA表达,但是,转染和未转染的骨髓间充质干细胞中均无Ⅰ型胶原基因mRNA转录。转染有外源性碱性成纤维细胞生长因子基因的复合材料部分被增生纤维结缔组织包绕,内有新生血管生成,随着时间的延长而增多。 结论：稳定表达碱性成纤维细胞生长因子的骨髓间充质干细胞和骨髓源性成骨细胞增殖较快,但作为组织工程骨的种子细胞,骨髓源性成骨细胞较骨髓间充质干细胞更理想。外源碱性成纤维细胞生长因子基因转染后稳定表达,对新生血管的形成具有促进作用,可以作为组织工程化人工骨种子细胞转染的目的基因。     

脉冲电刺激对改性纳米羟基磷灰石/聚丙交酯-乙交酯复合材料表面

背景：目前,骨组织工程的研究主要集中在成骨细胞特性研究和骨修复材料研制两大领域,而对细胞与细胞外材料的相互作用,尤其是调节和促进两者间相互作用的相关研究尚未给予足够的重视。 目的：在低聚乳酸接枝纳米羟基磷灰石/聚丙交酯-乙交酯(Hydroxyapatite nanocrystals surface-grafted with L-lactic acid oligomer/ Poly(lactide-co-glycolide), op-HA/PLGA)复合材料上接种成骨细胞,观察脉冲电场刺激对成骨细胞增殖和成骨相关基因表达的影响。 设计、时间及地点：对比观察实验,于2008-05/2009-01在中国科学院长春应用化学研究所高分子物理与化学国家重点实验室完成。 材料：op-HA和PLGA由中科院长春应用化学研究所制备。 方法：实验分为PLGA无电刺激组、op-HA/PLGA无电刺激组、PLGA电刺激组和op-HA/PLGA电刺激组。将op-HA/PLGA和PLGA氯仿溶液分别于盖玻片表面铺成薄膜,并接种兔成骨细胞,体外培养7 d。电刺激组刺激电压为2 V,频率为1 Hz,占空比为20%,每天刺激1 h。 主要观察指标：流式细胞仪检测细胞周期,Real-time PCR检测骨形态发生蛋白2、Ⅰ型胶原蛋白、骨连接蛋白的表达。 结果：脉冲电刺激组op-HA/PLGA上生长的成骨细胞S期细胞百分比明显高于其他组(P < 0.05)。op-HA/PLGA与PLGA比较能上调骨形态发生蛋白2、Ⅰ型胶原蛋白、骨连接蛋白3种基因表达量,并且施加脉冲电刺激组骨形态发生蛋白2、Ⅰ型胶原蛋白、骨连接蛋白3种基因表达量高于未加电刺激组。 结论：op-HA/PLGA复合材料是一种很好的骨修复材料,脉冲电刺激能促进成骨细胞在材料上的增殖能力,提高成骨活性相关基因的表达水平。     

腺病毒介导人转化生长因子β2基因转染诱导骨髓间充质干细胞向软骨细胞的定向分化

背景：前人的工作已证实转化生长因子β1能促进骨髓间充质细胞的增殖,诱导其向软骨细胞分化。 目的：进一步验证人转化生长因子β2(human transforming growth factor-β2,hTGFβ2)基因转染诱导骨髓间充质干细胞向成骨细胞定向分化作用。 方法：取清洁级3周龄雄性Lewis大鼠16只,用于分离培养骨髓间充质干细胞。通过腺病毒重组载体Ad-hTGFβ2将外源性hTGFβ2基因转染到体外培养的第2代大鼠骨髓间充质干细胞中,48 h后采用免疫组织化学染色、RT-PCR和Western blotting的方法检测转染细胞中目的基因与软骨特异性蛋白——Ⅱ型胶原和蛋白多糖表达的情况。 结果与结论：从成体大鼠骨髓组织中培养出骨髓间充质干细胞,体外培养呈成纤维细胞样,能大量稳定增殖传代。Ad-hTGFβ2转染骨髓间充质干细胞获得稳定表达,免疫组织化学染色和Western blotting检测到基因转染细胞中Ⅱ型胶原蛋白的合成表达,RT-PCR检测到Ⅱ型胶原和蛋白多糖aggrecan mRNA的表达。结果提示,从骨髓组织中可获得具有多分化潜能的间充质干细胞,并能在体外稳定增殖传代;Ad-hTGFβ2成功转染骨髓间充质干细胞,诱导其向软骨细胞分化。     

转染血管内皮生长因子基因的人成骨细胞增殖及其生物学功能

背景：传统的自体或异体骨移植治疗骨缺损都存在难以克服的缺点,基因治疗可能是一种新途径。 目的：观察转染外源性血管内皮生长因子基因的人成骨细胞体外生物学特性。 设计、时间及地点：对比观察，细胞学实验，实验于2005-05/2006-05在辽宁医学院科学实验中心完成。 材料：人髂骨骨块取自需髂骨植骨的颈椎病患者的植骨块修洁剩余部分的骨质，患者知情同意。质粒pCDI/VEGF121为北京大学人类疾病治疗中心马大龙教授惠赠；感受态大肠杆菌DH5a为辽宁医学院刘丹平教授惠赠。 方法：体外分离和培养人成骨细胞。实验分为血管内皮生长因子基因转染组与对照组。利用阳离子脂质体将pCDI-VEGF121真核表达质粒导入体外培养的人成骨细胞。 主要观察指标：传代后1，3，5，7 d观察血管内皮生长因子在人成骨细胞内的表达，及其对人成骨细胞增殖活力和细胞分泌骨钙素和碱性磷酸酶能力的影响。 结果：pCDI-VEGF121真核表达质粒转染人成骨细胞后第3，7天，以反转录聚合酶链反应方法检测到其中有血管内皮生长因子mRNA表达。转染组的细胞数在第1，3，5，7天均高于对照组(P < 0.05或P < 0.01)。培养3 d时转染组成骨细胞的碱性磷酸酶阳性率大于对照组(P < 0.01)；转染组的骨钙素含量高于对照组(P < 0.05或< 0.01)。 结论：血管内皮生长因子基因转染可以促进体外培养人成骨细胞的增殖能力和相应的生物学功能。     

人成骨细胞增殖和分化与生长激素释放肽☆

背景：有研究表明生长激素释放肽对体外培养大鼠成骨细胞增殖有促进作用,但对人成骨细胞增殖和分化是否有影响却少有报道。 目的：探讨生长激素释放肽对人成骨细胞增殖和分化的影响。 方法：取正常成人髂前上棘松质骨,分离出成骨细胞并进行体外培养,应用RT-PCR法检测生长激素促分泌素受体的表达;3H-掺入法检测成骨细胞增殖;Westernblot检测与成骨细胞分化相关的Runx2蛋白表达;α-磷酸奈酚法和放射免疫法观察生长激素释放肽对人成骨细胞分化的影响。 结果与结论：人成骨细胞可表达生长激素促分泌素受体mRNA和生长激素促分泌素受体蛋白。生长激素释放肽促进人成骨细胞增殖(P < 0.05或P < 0.01),且呈剂量依赖性,而且可增加碱性磷酸酶的活性并促进骨钙素的分泌(P < 0.05或P < 0.01),但对人成骨细胞中Runx2蛋白的表达无影响。结果提示,生长激素释放肽能促进人成骨细胞增殖和分化。 关键词：生长激素释放肽;人成骨细胞;细胞增殖;细胞分化;组织构建     

羊水来源胎儿间充质干细胞向成骨细胞的诱导分化

背景：羊水细胞已广泛应用于与基因突变有关疾病的产前诊断，但目前关于羊水来源胎儿间充质干细胞的分离培养、细胞表面特征鉴定、细胞分化及其应用前景的文献并不多见。 目的：体外诱导孕中期羊水来源的胎儿间质干细胞向成骨细胞方向分化。 设计、时间及地点：细胞学体外观察，于2005-08/2006-05在新华医院实验中心完成。 材料：10例羊水标本取自孕18~22周行产前诊断或流产的孕妇，取前均征得孕妇本人同意。 方法：采用机械手段挑取孕中期羊水细胞培养体系中的胎儿间充质干细胞集落，体外培养扩增。取第3代胎儿间充质干细胞，以100 nmol/L地塞米松、10 mmol/L β-甘油磷酸和50 mg/L维生素C持续诱导14 d。 主要观察指标：免疫组化染色检测碱性磷酸酶和Ⅰ型胶原的表达，Western Blot蛋白印记法检测Ⅰ型胶原蛋白的表达，Von Kossa染色法检测钙结节形成能力，激光共聚焦显微镜检测细胞骨架蛋白形成。 结果：分离出的胎儿间充质干细胞为CD44和HLA-ABC阳性，CD34、CD45、HLA-DR阴性，符合间充质干细胞特点。成骨诱导14 d后，细胞碱性磷酸酶染色阳性率达91%，Ⅰ型胶原阳性率达87%；表达Ⅰ型胶原蛋白；随诱导时间的延长钙结节逐渐增多、增大；镜下可见细胞胞质中的微丝呈绿色荧光，细胞周围的微丝形成致密的周围束。 结论：羊水来源的胎儿间充质干细胞可以分化为成骨细胞，且与典型的成骨细胞具有相似的形态学和生物学特征。     

骨髓基质干细胞成骨分化过程中Wnt、骨形态发生蛋白2信号通路相关因子与辛伐他汀的作用*

背景：辛伐他汀可促进体外培养的人或鼠骨髓基质干细胞向成骨细胞分化,但作用机制尚不清楚。 目的：观察辛伐他汀对大鼠骨髓基质干细胞向成骨细胞分化过程中Wnt与骨形态发生蛋白2信号途径中相关因子表达的影响。 方法：取6周龄雌性SD大鼠双侧股骨、胫骨全骨髓进行体外成骨细胞诱导培养。实验分为对照组及SIM组。SIM组加入浓度为10-7 mol/L辛伐他汀,对照组加入等量无水乙醇和PBS。培养14 d,行碱性磷酸酶染色,28 d时,行von Kossa染色观察细胞外基质矿化情况;培养14,21 d,免疫荧光细胞化学染色观察成骨细胞中β-catenin,Smad1/5,Cbfa1的表达及分布。 结果与结论：大鼠骨髓基质干细胞经体外诱导后可分化为具有碱性磷酸酶活性和矿化细胞外基质能力的成熟成骨细胞。辛伐他汀可显著上调骨髓基质干细胞成骨分化过程中碱性磷酸酶的表达。同时,与对照组比较,SIM组β-catenin,Smad1/5,Cbfa1表达明显增多(P < 0.05),且呈现明显的核内聚集趋势。说明辛伐他汀促进骨髓基质干细胞向成骨细胞分化的作用可能与调控Wnt与骨形态发生蛋白2信号通路中相关因子的表达及细胞内分布有关。     

唑来膦酸对大鼠成骨细胞护骨素及肿瘤坏死因子α mRNA表达的影响

背景：唑来膦酸属于第3代双瞵酸盐类药物,在临床上被广泛应用于治疗骨吸收增加类疾病,其对破骨细胞的作用及影响已取得了共识,而对于成骨细胞的影响尚有争议。 目的：观察唑来膦酸对大鼠成骨细胞增殖、分化和护骨素及肿瘤坏死因子α mRNA表达的影响。 方法：体外培养新生24 h内SD大鼠颅盖骨来源的成骨细胞,用10-5~10-9 mol/L唑来膦酸进行干预,分别于干预后第3,5,7天采用MTT法来测吸光度值,以检测唑来膦酸对大鼠成骨细胞增殖的影响;硝基苯基质动力学法和RT-PCR在干预后72 h,测量细胞碱性磷酸酶活性和护骨素及肿瘤坏死因子α mRNA的表达。 结果与结论：较高浓度(10-5 mol/L)的唑来膦酸明显抑制成骨细胞增殖, 10-7~10-9 mol/L唑来膦酸不影响成骨细胞的分化。10-5~10-9 mol/L唑来膦酸能使成骨细胞护骨素mRNA表达增加,肿瘤坏死因子α mRNA表达下降。说明唑来膦酸在低浓度时不影响成骨细胞的增殖及分化,其可通过调节成骨细胞护骨素、肿瘤坏死因子α mRNA的表达,来发挥其抗骨吸收的作用。     

模拟失重状态下成骨细胞胰岛素样生长因子1基因表达与降钙素的干预

背景：航天飞行、长期卧床等低重力负荷状态会引起骨吸收和骨形成的代谢紊乱,导致骨质疏松。有研究显示降钙素有直接促进成骨细胞增殖的作用,并可增加成骨细胞胰岛素样生长因子1 mRNA的表达。 目的：观察降钙素和体外模拟失重状态对成骨细胞功能及胰岛素样生长因子1基因表达的影响。 方法：采用二次酶消化法提取新生SD大鼠颅骨的成骨细胞,凝胶化形成成骨细胞海藻酸钠微包囊后进行实验。实验分为正常重力组、模拟失重组、模拟失重+降钙素(10,40,80 IU/L)组。将细胞置于模拟失重三维回转培养器中培养72 h后,检测成骨细胞的增殖、凋亡及碱性磷酸酶活性;采用RT-PCR 方法检测胰岛素样生长因子1、碱性磷酸酶、骨钙素mRNA的表达。 结果与结论：与正常重力组比较,模拟失重组细胞增殖率及培养基中碱性磷酸酶活性均明显降低(P < 0.01),胰岛素样生长因子1、骨钙素、碱性磷酸酶mRNA表达减少,凋亡增多;与模拟失重组比较,模拟失重+降钙素组细胞增殖率,胰岛素样生长因子1、骨钙素、碱性磷酸酶mRNA表达均有所增加,但无剂量依赖关系。说明降钙素可通过上调胰岛素样生长因子1 mRNA表达改善模拟失重条件下成骨细胞的增殖与分泌功能。     

大鼠胫骨骨折愈合过程中Ⅰ，Ⅱ型胶原蛋白的表达：失神经状态下Western blot方法测定

背景: 近年来大量的实验及临床观察均证实神经因素对骨折愈合有调节和支配作用。Ⅰ型胶原是促成骨细胞分化和增强成骨细胞黏附能力主要因素，是组成骨构架的基质蛋白；而Ⅱ型胶原由软骨细胞产生。 目的：观察失神经状态下骨折愈合过程中Ⅰ，Ⅱ型胶原蛋白表达的变化规律。 设计、时间及地点：随机对照动物实验，于2005-05/12在解放军第二军医大学动物实验室及细胞生物教研究室完成。 材料：选用3月龄健康雄性SD大鼠40只，采用随机数字表法分为2组，单纯胫骨骨折组与脊髓损伤并胫骨骨折组各20只。 方法：单纯胫骨骨折组大鼠于从左胫骨平台前缘插入1根φ0.8 mm克氏针，制成胫骨骨折模型。脊髓损伤并胫骨骨折组在植备上述模型的基础上，横断切除T10 段脊髓约0.3 cm，制成T10脊髓完全性损伤大鼠胫骨骨折模型。 主要观察指标：分别于伤后1，2，4，5周采用Western blot法检测两组大鼠骨折断端骨痂中Ⅰ，Ⅱ型胶原的蛋白表达。 结果：伤后第1周两组大鼠骨折断端骨痂中Ⅰ，Ⅱ型胶原均有表达，脊髓损伤并胫骨骨折组两种胶原的表达程度均高于单纯胫骨骨折组(P < 0.05)；伤后第2周脊髓损伤并胫骨骨折组Ⅱ型胶原的表达量达到峰值，高于单纯胫骨骨折组(P < 0.05)；伤后第4周单纯胫骨骨折组Ⅰ型胶原表达量达峰值，高于脊髓损伤并胫骨骨折组(P < 0.05)，脊髓损伤并胫骨骨折组Ⅱ型胶原仍有高表达；伤后第5周两组Ⅰ，Ⅱ型胶原表达量均下降。 结论：失神经状态下骨折愈合过程中Ⅰ、Ⅱ胶原的分泌规律与正常骨折愈合一致，区别在于各时间点尤其是在峰值点上表达量有明显差异。     

Ⅰ型胶原修饰聚乳酸聚乙醇酸微球支架上骨髓间充质干细胞的黏附和成骨分化

背景：组织工程骨成骨功能终末细胞需要骨髓间充质干细胞在体外加以诱导或在体内以基因转染等技术加以诱导。 目的：研究Ⅰ型胶原修饰的聚乳酸聚乙醇酸微球支架上骨髓间充质干细胞黏附和成骨分化的能力。 方法：制备聚乳酸聚乙醇酸微球支架,分离纯化雌性SD大鼠骨髓间充质干细胞。将培养至第3代骨髓间充质干细胞与未经处理的聚乳酸聚乙醇酸微球及Ⅰ型胶原修饰的聚乳酸聚乙醇酸微球共同培养14 d,观察细胞在不同支架表面的黏附生长。 结果：扫描电镜及FDA-PI染色发现,骨髓间充质干细胞可在聚乳酸聚乙醇酸微球支架上生长,而与未修饰的聚乳酸聚乙醇酸微球相比骨髓间充质干细胞更容易在Ⅰ型胶原修饰的聚乳酸聚乙醇酸微球上黏附增殖。Ⅰ型胶原修饰的聚乳酸聚乙醇酸微球有利于骨髓间充质干细胞的黏附、增殖,并且有一定诱导干细胞成骨分化的能力。     

补肾中药血清对成骨细胞中骨形态发生蛋白2、7活性的影响

背景：课题组拟以骨形态发生蛋白作为研究靶点来认识肾虚骨质疏松症的病理机制。 目的：体外观察补肾中药血清对SD大鼠成骨细胞中骨形态发生蛋白2、7活性的影响。 方法：采用多次胶原酶消化法体外培养获取新生SD大鼠颅盖骨的成骨细胞；随机将28只SD大鼠分为4组，分别灌胃补肾益精壮骨中药、补中益气颗粒剂和骨疏康颗粒，正常组不灌胃。干预8 d后，通过血清药理学方法使用各组大鼠血清培养成骨细胞48 h。 结果与结论：与正常组相比，补肾组和骨疏康组成骨细胞骨形态发生蛋白2、7表达水平明显增加(P < 0.01)，补脾组成骨细胞骨形态发生蛋白2、7表达水平降低(P < 0.01)。结果表明补肾中药对成骨细胞保持自身功能、维持骨密度的作用上发挥重要的作用，成骨细胞中骨形态发生蛋白2、7可能有促进成骨细胞分化、增殖的功能。     

转化生长因子β1对骨髓干细胞分化类髓核细胞的影响**

背景：转化生长因子β1是骨髓间充质干细胞分化为类髓核细胞的首选生长因子,适当浓度能诱导骨髓间充质干细胞的增殖和分化。 目的：观察不同质量浓度转化生长因子β1对大鼠骨髓间充质干细胞体外向类髓核细胞分化的影响,优化骨髓间充质干细胞体外培养条件。 方法：取成年大鼠股骨骨髓,体外培养、纯化。取第3代成年大鼠骨髓间充质干细胞,实验组用加入不同质量浓度转化生长因子β1(0,1,10,20 μg/L)的HG-DMEM无血清培养液诱导3,7,14,21 d;对照组普通状态下用含体积分数为10%胎牛血清的HG-DMEM培养液自然分化。 结果与结论：10 μg/L转化生长因子β1诱导液诱导的骨髓间充质干细胞蛋白聚糖与Ⅱ型胶原蛋白水平明显高于其他实验组和对照组(P < 0.01)。各实验组14 d时蛋白聚糖的表达均较3,7,21 d时高(P < 0.01)。对照组各时间点蛋白聚糖Aggrecan及Ⅱ型胶原表达均呈阴性。提示10 μg/L的转化生长因子β1能提高大鼠骨髓间充质干细胞体外诱导分化类髓核的数量,从而使骨髓间充质干细胞发挥更高的治疗效率。