煤焦沥青烟提取物致BEAS-2B恶性转化细胞中心体及其调控蛋白的变化

目的 分析煤焦沥青烟提取物诱导人支气管上皮细胞BEAS-2B恶变过程中细胞内中心体及其调控蛋白的变化,探讨中心体在煤焦沥青烟提取物致肺癌中的作用及机制.方法 用中温煤焦沥青烟提取物作为诱导剂,建立永生化人支气管上皮细胞BEAS-2B的恶性转化模型,作为煤焦沥青烟提取物染毒组(煤焦沥青组),设溶剂对照组和正常对照组平行传代培养,用细胞爬片间接免疫荧光法检测中心体改变,用实时定量反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)法检测相关基因的mRNA表达;细胞爬片免疫组化半定量法检测相关蛋白表达.结果 煤焦沥青组第20代细胞中心体总异常率为6.56％±1.01％,明显高于正常对照组(3.40％±0.86％)和溶剂对照组(3.14％±0.59％),差异有统计学意义(P＜0.05).与正常对照组(4.34％±1.04％)和溶剂对照组(4.33％±1.20％)比较,煤焦沥青组第30代细胞中心体总异常比例(22.39％±9.5％)明显增大,差异有统计学意义(P＜0.05).煤焦沥青组第20、30代细胞的P53、P21基因和蛋白表达明显降低,Cyclin E基因和蛋白表达明显升高,与正常对照组相和溶剂对照组比较,差异均有统计学意义(P＜0.05).结论 在煤焦沥青烟提取物诱导BEAS-2B细胞恶性转化过程中,中心体异常出现在细胞恶性改变前.中心体异常可能是通过P53/P2 1/CyclinE通路异常而引起.     

煤焦沥青烟提取物对BEAS-2B细胞Nrf2-Keap1/ARE通路的影响

[目的]研究煤焦沥青烟提取物对BEAS-2B细胞Nrf2、Keap1、NQO1 mRNA和Nrf2蛋白表达的影响,以期探讨对抗煤焦沥青致细胞氧化损伤的分子靶标和通路。[方法]GC-MS检测煤焦沥青烟提取物的主要成分;采用细胞急性毒性实验,根据文献以及以往的实验将煤焦沥青烟提取物分为0.00、1.25、2.50、5.00、10.00 mg/L五个染毒组,以BEAS-2B细胞为染毒对象进行实验;MTT法检测染毒BEAS-2B细胞生长增殖情况;RT-PCR检测Nrf2、Keap1、NQO1 mRNA的表达量;Western blot测定Nrf2蛋白的表达量。[结果]煤焦沥青烟提取物主要成分中86.02%为多环芳烃类化合物;浓度为1.25 mg/L时促进BEAS-2B细胞增殖,2.5～10 mg/L抑制细胞增殖;染毒组Nrf2 mRNA及蛋白表达量低于对照组,而Keap1 mRNA表达量高于对照组,差别均有统计学意义（P〈0.05）;在1.25～5.00 mg/L浓度范围内,随着染毒浓度的增加,Nrf2 mRNA和蛋白表达呈递增趋势,而染毒浓度为10.00 mg/L时,Nrf2 mRNA和蛋白的表达量均有所减少（P〈0.05）;NQO1 mRNA在2.5～5.00 mg/L浓度范围内随染毒浓度的增加表达水平逐渐升高。[结论]煤焦沥青烟提取物刺激BEAS-2B细胞后,可能通过Nrf2-Keap1/ARE通路来调节细胞抗氧化应激能力。     

个旧矿粉诱导的肺癌细胞中分化抗原9的表达及基因突变分析

目的探讨分化抗原9（CD9）在个旧矿粉诱导永生化人支气管上皮细胞（BEAS-2B）恶性转化为肺癌细胞过程中的异常表达和基因突变。方法以BEAS-2B为对照组（20瓶），以个旧矿粉体外诱导BEAS-2B所产生的恶性转化细胞为实验组（20瓶）。采用免疫细胞化学技术检测CD9蛋白在BEAS-2B和恶性转化细胞中的表达。采用逆转录一聚合酶链反应（RT—PCR）技术检测CD9mRNA在BEA-2B和恶性转化细胞中的表达；并对其RT-PCR产物进行DNA序列测定。结果CD9蛋白在BEAS-2B中的表达率（100％，20／20）与其在恶性转化细胞中的表达率（35％，7／20）差异有统计学意义（P〈0．01）。CD9mRNA在BEAS-2B中的表达强度（0．91±0．09）明显高于其在恶性转化细胞中的表达强度（0．34±0．14），差异有统计学意义（P〈0．01）。DNA序列测定显示，在BEAS-B的恶性转化细胞中CD9基因存在2处点突变，在第231位置发生G—T转换；在第119位置发生T→A转换，而且这2处的替代引起的错译突变均导致了编码氨基酸的改变，第40位氨基酸由谷胺酰胺（Gin，Q）变为组氨酸（His，H）；第3位氨基酸由缬氨酸（Va1，V）变为天冬氨酸（Asp，D）。结论CD9的表达缺失或下调以及基因突变在个旧矿粉诱导BEAS．2B恶性转化为肺癌细胞的过程中可能发挥重要作用。     

P53、P21^WAF/CIP1和Cyclin D1基因蛋白在沥青烟暴露小鼠肺组织中的表达

[目的]探讨沥青烟对小鼠肺组织形态及基因蛋白P53、P21^WAF/CIP1和Cyclin D1表达的影响。[方法]建立沥青烟亚急性染毒小鼠模型，将120只昆明种健康小鼠随机分为3组，即1个对照组和2个染毒组，染毒组进行不同浓度（55、165mg,／m^3）和不同时间（30、60d）染毒，光镜下观察肺组织形态改变，采用免疫组化S-P法，对P53、P21、Cyclin D1染色，观察P53、P21和Cyclin D1基因蛋白表达。[结果]不同浓度、不同时间染毒小鼠肺组织形态有不同程度改变，高浓度染毒组出现不典型增生。小鼠肺组织P53基因蛋白表现为低浓度染毒30d组，未见阳性表达；高浓度染毒60d组呈强阳性表达（P〈0．01）。P21^WAF/CIP1基因蛋白表达低浓度染毒30d呈阳性表达；高浓度染毒60d组表达明显下调（P〈0．01）。Cyclin D1基因蛋白表达同P53基因蛋白表达。[结论]随着染毒浓度和染毒时间的增加，肺组织增生逐渐明显，P53和Cyclin D1基因蛋白的表达呈上升趋势，P21^WAF/CIP1呈下降趋势。     

锰诱导PC12细胞凋亡与P53、MDM2蛋白表达

目的 探讨锰对嗜铬细胞瘤细胞(PC12 cells)凋亡的诱导作用及与抑癌基因P53、原癌基因MDM2蛋白表达的关系.方法 以PC12细胞作为多巴胺能神经元的模型细胞,取对数生长期的PC12细胞,用含200,400,800μmol/L MnCI2的培养液分别染毒培养24,36,48 h.四甲基偶氮噻唑蓝(MTT)法检测细胞的生长情况,流式细胞仪(FMC)和原位缺口末端标记法(TUNEL)检测细胞凋亡状况;用免疫细胞化学法检测细胞P53、MDM2蛋白表达强度.结果 氯化锰可呈时间和剂量依赖性抑制PC12细胞的增殖和诱导细胞凋亡,抑制率为11.8%～73.6%,凋亡率为8.72%～53.60%.免疫化学法检测结果显示,随锰浓度的增高,P53蛋白的表达增加(P<0.01),而MDM2蛋白表达下降,差异有统计学意义(P<0.01),且呈剂量依赖关系.结论 锰可诱导PC12细胞凋亡,上调P53基因的表达和下调MDM2基因的表达可能在其诱导PC12细胞凋亡中起着重要的作用.     

云锡矿粉离体诱导永生化大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞RLE-6TN恶性转化

目的 建立本实验云锡矿粉(无氡)诱导永生化大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞RLE-6TN恶性转化模型,观察在诱导过程中不同阶段的细胞形态、超微结构和某些相关蛋白改变.方法 高、低2个剂量(200和50 mg/L)矿粉对RLE-6TN细胞进行72 h染毒,隔代染毒至第10代,常规传代直至软琼脂克隆形成实验阳性;通过透射电镜、流式细胞术、免疫印迹技术及免疫细胞化学观察实验细胞的改变.结果 染毒24 h细胞内见大量矿粉,板层小体变性减少,出现细胞凋亡;第25代高剂量组及第30代高低剂量组的细胞均可在软琼脂上形成细胞集落,空白对照组克隆形成实验阴性(P<0.01);第30代高剂量组细胞增殖指数(PI)高于空白对照组;高剂量组转化细胞p53(+)、MDM2(+)、FHIT(-);空白对照组p53(-)、MDM2(+)、FHIT(+).结论 云锡矿粉可引起离体培养的RLE-6TN细胞发生恶性转化.p53阳性表达及FHIT失表达可作为RLE-6TN细胞转化的参考指标.     

维、汉族乳腺癌中BRCA1、P53及Ki-67蛋白的表达

[目的]研究维吾尔族及汉族乳腺癌患者中BRCA1、P53及Ki-67蛋白的表达及其意义.[方法]选取100例维吾尔族和25例汉族乳腺癌根治标本,对照组为126例维汉族乳腺良性病变(纤维腺病及纤维腺瘤)及乳腺癌旁非癌组织;运用免疫组化Evision二步法检测BRCA1、P53及Ki-67蛋白的表达.[结果](1)在乳腺良性病变及乳腺癌旁非癌组织中,BRCA1蛋白均定位于细胞核内.在乳腺癌组织中,93例完全表达为细胞浆阳性,阳性率为74.4%,32例表达缺失.(2)BRCA1蛋白的表达与组织学分级、患者的年龄、淋巴结转移及民族有明显相关性(P ＜0.05).(3)乳腺癌中P53蛋白和Ki-67的表达呈正相关(P＜0.01);BRCA1蛋白与P53及Ki-67的表达呈负相关(P＜0.01).(4)乳腺癌中P53及Ki-67蛋白的阳性表达率(53.6%;28.92±16.90)明显高于乳腺良性病变(1.59%,5.38±3.43)(P＜0.01).[结论]BRCA1蛋白、P53和Ki-67蛋白阳性表达可能在乳腺良性病变恶性转化及乳腺癌的发生中具有重要作用,有可能成为临床预测预后的重要指标之一.     

云锡矿粉诱导人肺上皮细胞转化和成纤维细胞活化过程中的相互作用

目的 探讨云锡矿粉诱导人肺上皮细胞转化及成纤维细胞活化过程中的相互作用.方法 常规培养永生化人支气管上皮细胞(BEAS-2B)及人胚肺成纤维细胞(WI-38),每6天传代1次;100μg/ml的云锡矿粉隔代诱导BEAS-2B及WI-38至第9代,共诱导5次,自第11代分组共培养至第40代.刀豆凝集素A及锚着独立性生长实验检测细胞恶性转化,流式细胞术检测细胞周期变化,免疫细胞化学法检测成纤维细胞α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)表达.结果 (1)与正常BEAS-2B细胞相比,矿粉诱导的BEAS-2B细胞单独培养至第28代细胞形态开始出现改变;与WI-38细胞共培养后,细胞形态改变提早至第20代;与矿粉诱导的WI-38细胞共培养后,细胞形态改变进一步提早至第16代.矿粉诱导的BEAS-2B细胞培养至第26代时凝集实验出现阳性;与WI-38细胞及矿粉诱导的WI-38细胞共培养后,细胞凝集时间缩短.与WI-38细胞共培养的矿粉诱导BEAS-2B及与矿粉诱导WI-38细胞共培养的矿粉诱导的BEAS-2B细胞分别在第26及第36代锚着独立性生长实验出现阳性,第36代的克隆形成率分别为6.00‰±1.00‰和15.33‰±2.52‰,且差异有统计学意义(P<0.05).矿粉诱导的各组上皮细胞S期细胞所占比例随培养代数增加逐渐升高,细胞发生恶性转化.(2)100 μg/ml矿粉诱导的成纤维细胞培养至第26代出现α-SMA表达;与上皮细胞共培养后,成纤维细胞α-SMA表达增强,且随培养代数的增加,阳性表达细胞数明显增多,着色程度增强.结论 个旧矿粉能诱导支气管上皮细胞恶性转化及成纤维细胞活化;肺上皮细胞是矿粉诱癌的主要靶细胞;肺上皮细胞的转化和成纤维细胞的活化相互影响,相互促进.     

人造矿物纤维诱导人支气管上皮细胞系恶性转化的研究

目的 比较温石棉、难溶性陶瓷纤维(RCF)、玻璃棉(GW)、岩棉(RW)对人支气管上皮细胞BEAS-2B细胞株的细胞毒性与致恶性转化的能力.方法 检测温石棉、RCF、GW、RW对BEAS-2B的细胞毒性;BEAS-2B细胞每10 d染毒24 h,共染毒6次,待细胞出现生长抑制后,用锚着不依赖性生长实验判断细胞恶性转化.结果 温石棉、RCF、GW、RW均对BEAS-2B细胞具有细胞毒性,并呈剂量一反应关系.染毒6次后,温石棉组、RCF组细胞生长速度加快,排列紊乱,失去接触抑制,出现复叠层生长,并可在软琼脂上生长,细胞集落形成率分别为4.6%和7.2%,与阴性对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05);而GW组和RW组细胞集落形成率分别为0.6%和0.4%,与阴性对照组比较,差异无统计学意义(P>0.05).结论 温石棉组、RCF具有使BEAS-2B细胞发生恶性转化的能力,GW、RW染毒60 d未能使BEAS-2B细胞发生恶性转化.     

云锡矿粉诱导人肺上皮细胞转化过程中FHIT蛋白和Ki-67抗原的表达及意义

目的 探讨云锡矿粉诱导人肺上皮细胞转化过程中脆性组胺酸三联体(FHIT)蛋白和Ki-67抗原的表达及意义.方法 选用100 μg/ml的云锡矿粉染毒永生化人支气管上皮细胞BEAS-2B(B)及人胚肺成纤维细胞WI-38(W),每次染毒72 h,隔代染毒直至第9代.自第11代起将上述细胞分组共培养.B100表示100μg/ml矿粉诱导的B细胞,W100表示100 μg/ml矿粉诱导的W细胞.分组如下:B组;B(W)组:与W共培养的B细胞;B(W100)组:与W100共培养的B细胞;B100组:100 μg/ml矿粉诱导的B细胞;B100(W)组:与W共培养的B100细胞;B100(W100)组:与W100共培养的B100细胞.应用免疫细胞化学法检测第16、26及36代各组上皮细胞中FHIT蛋白和Ki-67抗原的表达,以Ki-67蛋白阳性细胞数计算细胞增殖指数(PI).结果 BEAS-2B上皮细胞中存在FHIT蛋白表达,各代B组、B(W)及B(W100)组细胞FHIT蛋白表达水平无明显差异.第16代,B100组细胞FHIT蛋白表达水平低于B组细胞,B100(W)组及B100(W100)组FHIT蛋白表达水平较B100组进一步降低.第26代,B100、B100(W)及B100(W100)组细胞FHIT蛋白表达水平进一步降低,而至第36代,经矿粉诱导转化的上皮细胞重现FHIT蛋白的表达,且B100组、B100(W)组、B100(W100)组表达强度呈递增趋势.第16、26及36代未经矿粉诱导的各组肺上皮细胞Ki-67阳性细胞数PI均＜3%.第16代,B100组、B100(W)组及B100(W100)组细胞Ki-67阳性细胞PI分别为4.40%、4.97%和7.87%,第26代时分别增加为7.33%、7.87%和12.66%,第36代时分别进一步提高为12.60%、19.73%和24.80%.与B100、B100(W)组比较,第16、26、36代B100(W100)组阳性细胞PI明显增高,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 FHIT可能是云锡矿粉诱导BEAS-2B上皮细胞转化的一个作用靶点,云锡矿粉诱导可导致BEAS-2B上皮细胞Ki-67阳性细胞数增加,增殖活性增强.     

宫颈上皮内瘤变的HPV感染及P53和MDM2的表达

目的研究宫颈上皮内瘤(CIN)的人类乳头状瘤病毒(HPV)感染、p53蛋白和MDM2蛋白的表达及三者之间的相互关系。方法选取CIN 47例、正常宫颈组织54例,分别采用原位杂交技术检测HPV6/11、HPV16/18感染,用免疫组织化学技术(SP法)检测P53蛋白和MDM2蛋白。结果HPV6/11感染率在CIN组和对照组分别为46.8%(22/47)、20.4%(11/54),HPV18感染分别为70.2%(33/47)、16.7(9/54)。CIN组的HPV6/11、HPV16/18的感染率均显著高于对照组(均P<0.01)。CIN组和对照组的p53阳性率分别为2.27%(13/47)、3.7%(2/54)。CIN组和对照组的MDM2阳性率分别为14.9%(7/47)、7.4%(4/54)。CIN组的p53阳性率显著高于对照组(P<0.05),MDM2阳性率CIN组和对照组之间无统计学差异(P>0.05)。在本实验中,p53、MDM2之间的阳性率均无统计学相关(P>0.05)。p53、MDM2蛋白阳性表达和HPV6/11、HPV16/18感染之间无统计学相关(均P>0.05)。结论CIN与HPV感染关系密切;p53可能参与小部分CIN的发生发展,而MDM2可能在CIN的发生发展中不起重要作用。     

煤焦沥青烟提取物致BEAS-2B恶性转化细胞中姊妹染色单体分离相关蛋白的改变

目的 通过检测姊妹染色体凝集和分离相关蛋白染色体结构维持蛋白(SMC)1、SMC3、分离酶(Separase)和保全素(Securin)在煤焦沥青致BEAS-2B癌变细胞中的变化,探讨其在煤焦沥青接触者肺癌发生中的作用.方法 用中温煤焦沥青烟提取物作为诱导剂,建立永生化人支气管上皮细胞BEAS-2B的恶性转化模型,用实时定量反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测相关基因的mRNA表达水平;细胞爬片免疫组化半定量法检测其蛋白表达改变.以二甲亚砜(DMSO)溶剂组和未染毒的正常传代的BEAS-2B细胞为对照组.结果 与正常对照组和DMSO溶剂对照组比较,煤焦沥青烟提取物诱导转化细胞中,SMC1基因和蛋白表达水平的差异无统计学意义(P＞0.05);煤焦沥青烟诱导组SMC3和Separase的基因和蛋白表达水平明显升高(基因:SMC3:2.54±0.20、Separase:2.42±0.22,蛋白:SMC3:0.27±0.02、Separase:0.25±0.02),Securin的基因和蛋白表达水平明显降低(基因:0.30±0.04,蛋白:0.17±0.01),与其他两组(DMSO溶剂对照组:基因:SMC3:1.13±0.12、Separase:1.00±0.04、Securin:0.90±0.11,蛋白:SMC3:0.10±0.03、Separase:0.18±0.02、Securin:0.22±0.02;正常对照组:基因:SMC3:1.00±0.11、Separase:1.00±0.08、Securin:1.00±0.11,蛋白:SMC3:0.09±0.01、Separase:0.18±0.01、Securin:0.23±0.02)相比,差异均有统计学意义(P＜0.05).结论 在煤焦沥青致支气管上皮细胞恶性转化过程中,姊妹染色单体凝集和分离相关蛋白SMC3和Separase升高,Securin表达水平降低,参与了细胞恶性转化过程.     

苯并（a）芘致人支气管上皮细胞DNA损伤及与组蛋白H2A单泛素化水平的关系

[目的]通过体外细胞培养途径,探讨苯并（a）芘（benzo[a]pyrene,B[a]P）作用下人支气管上皮细胞（16HBE）DNA损伤与组蛋白H2A单泛素化表达水平的关系。[方法]取对数生长期16HBE细胞,采用2μmol/L B[a]P染毒不同时间（0、1、2、4、8、12、24、48h）进行实验,用碱性单细胞凝胶电泳实验检测细胞DNA损伤水平,并以Olive尾矩值（olivetail moments,OTM）评价DNA损伤程度;用Western-blot法检测组蛋白H2A单泛素化水平。[结果]单细胞凝胶电泳结果显示：2μmol/L B[a]P染毒不同时间时,随着染毒时间的延长,各染毒组细胞DNA损伤程度均明显增高,与对照组相比,差异均有统计学意义（P〈0.01）;Western-blot结果显示：2μmol/L B[a]P染毒不同时间时,与对照组相比,组蛋白H2A的单泛素化水平增高,且在染毒2h后,差异有统计学意义（P〈0.01）;回归分析显示,单泛素化H2A的表达水平与DNA损伤程度存在高度相关,决定系数（R2）为0.910,P〈0.01。[结论]B[a]P染毒致16HBE细胞DNA损伤与组蛋白H2A单泛素化水平之间存在密切关系。     

煤焦沥青烟提取物致人支气管上皮细胞BEAS-2B染色体不稳定性研究

目的 建立煤焦沥青烟提取物诱导的人支气管上皮细胞BEAS-2B株的恶化模型;观察不同时期细胞的染色体不稳定性与细胞恶性转化之间的关系.方法用四唑蓝(MTT)法测定煤焦沥青烟提取物的细胞毒性,以煤焦沥青烟提取物诱导并观察BEAS-2B细胞传代转化过程中的形态学改变;软琼脂克隆形成实验检测细胞恶性转化能力,流式细胞术检测细...     

灰霾天气细颗粒物对人支气管上皮细胞凋亡的影响

[目的]探讨灰霾天气细颗粒物（PM2.5）对人支气管上皮细胞（human bronchial epithelial cells,16-HBE）凋亡的影响。[方法]分别以8、16、32、64、128μg/mL浓度的PM2.5作用于16-HBE 24、48、72h,检测PM2.5对16-HBE细胞存活率及凋亡率的影响。[结果]染毒24、48、72h后,64、128μg/mL组细胞存活率均明显低于对照组（P〈0.05）,细胞凋亡率均明显高于对照组（P〈0.05）;72h各浓度组细胞存活率均低于24h相应处理组（P〈0.05）,当染毒浓度大于8μg/mL时,72h各浓度组细胞总凋亡率与24h相比均明显增加（P〈0.05）。[结论]灰霾天气细颗粒物PM2.5对16-HBE具有细胞毒性,能诱导其凋亡,且具有剂量和时间反应关系。