脊髓运动神经元轴突抑制前后E3B1基因的表达变化及意义

目的 检测E3B1基因在脊髓运动神经元(SMN)轴突生长抑制前后的表达变化及意义.方法 应用逆转录.聚合酶链反应(RT-PCR)和Western blot检测SMN轴突生长抑制前后E3B1mRNA和蛋白表达的变化,应用免疫细胞化学检测培养SMN Ⅲ型β-微管蛋白的表达.结果 与正常培养的SMN比较,与轴突抑制物共培养的SMN Ⅲ型β-微管蛋白表达明显降低(P《0.01),E3B1mRNA和蛋白的表达均显著升高(P《0.01).结论 E381基因的过度表达可能是SMN轴突生长抑制的重要因素.     

TDZD-8对新生大鼠背根节神经元轴突再生影响的体外实验研究

目的:探讨葡萄糖原合成酶-3β(glycogen synthase kinase 3B,GSK-3β)的抑制剂TDZD-8对新生大鼠背根节(dorsal root ganglion,DRG)神经元轴突生长和延长的影响.方法:取新生(<5d)SD大鼠胸腰段背根节进行原代培养、提纯和鉴定.用WD法制成健康成年雌性SD大鼠T9平面完全性截瘫的脊髓损伤动物模型.造模7d后取T8～T10节段脊髓制作脊髓提取液.将不同浓度TDZD-8与成年大鼠脊髓提取液和新生大鼠DRG神经元分组培养:A组,DRG神经元+磷酸缓冲液(phosphate-bufered saline,PBS);B组,DRG神经元+正常脊髓提取液;C组,DRG神经元+假手术脊髓提取液:D组,DRG神经元+全瘫脊髓提取液;E组,DRG神经元+全瘫脊髓提取液+不同浓度TDZD-8.培养2d后观察并比较各组新生大鼠DRG神经元轴突平均长度和微管(Tubulin 8Ⅲ)荧光表达强度.结果:A组、B组和C组之间平均神经轴突长度及轴突远端Tubulin βⅢ表达强度比较,无统计学意义,D组明显减小,与A、B和C组分别比较,有统计学意义(P<0.01).0.5～3μM TDZD-8处理组平均轴突长度及Tubulin βⅢ荧光表达强度均明显高于A、B、C组,与D组比较,更为显著,差异均具有统计学意义(P<0.01).5～25μM TDZD-8处理组平均轴突长度与A、B、C组分别比较,明显缩短且有统计学意义(P<0.01),与D组比较无统计学差异(P>0.05);轴突远端Tuburn βⅢ表达比A、B、C、D组及0.5～3μM TDZD-8处理组明显增强,有统计学意义(P<0.01).结论:完全瘫痪脊髓提取液明显抑制DRG神经元轴突生长,轴突回缩.低浓度TDZD-8能促进轴突生长.形成多个轴突或轴突分支,而高浓度TDZD-8明显抑制轴突生长,导致轴突回缩.     

RNAi基因沉默MCP-1在颈动脉粥样硬化形成中的影响

目的 探讨MCP-1小干扰RNA(siRNA)转染兔颈动脉粥样硬化模型对局部MCP-1及动脉粥样硬化的影响.方法 用大白兔建立颈动脉粥样硬化模型,模型分为3组:RNAi组12只,AS模型组8只,空质粒组8只.观察3组血管壁中泡沫细胞浸润及内膜/中膜厚度(I:M)比值及局部MCP-1表达情况.结果 MCP-1 siRNA转染后,发现RNAi组的I:M(1.46±0.23)较AS模型组(5.55±0.30)和空质粒组(5.27±0.31)显著降低(P<0.01);MCP-1 si RNA表达载体转染使局部MCP-1表达降低;RNAi组的m RNA表达水平较AS模型组和空质粒组下降.结论 MCP-1 siRNA转染抑制了局部MCP-1表达,延缓了动脉粥样硬化的发展,减轻了病变程度.     

靶向Pik3cb RNA干扰对大鼠血管平滑肌细胞增殖的影响

目的探讨靶向磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）p110β亚单位的短发卡RNA质粒（pU6-Pik3cb-shRNA）对大鼠胸主动脉平滑肌细胞（VSMC）增殖的影响。方法构建质粒表达载体pU6-Pik3cb-shRNA-1和pU6-Pik3cb-shRNA-2,经脂质体介导转染大鼠VSMC,分7组：A组：VSMC细胞;B组：转染质粒pU6-Pik3cb-shRNA-1;C组：转染质粒pU6-Pik3cb-shRNA-2;D组：转染质粒pU6-Pik3cb-shRNA-1和pU6-Pik3cb-shRNA-2各半量;E组：转染阴性对照无序质粒HK;F组：转染阴性对照空质粒;G组：阳性对照渥曼青霉素,应用荧光定量PCR检测VSMC中Pik3cb mRNA的表达, Western blot检测VSMC中PI3K下游蛋白Akt和mTOR表达的变化;CCK-8法检测pU6-Pik3cb-shRNA对大鼠VSMC增殖的影响;免疫荧光法检测各组细胞中PCNA的表达。结果48 h时B组、C组、D组中Pik3cb mRNA表达分别降低了75．5％、53．6％和65．8％,与对照组相比较,差异有统计学意义（P〈0．05）。B组、C组、D组中PI3K下游分子磷酸化Akt和mTOR表达均下调,CCK-8结果显示pU6-Pik3cb-shRNA抑制VSMC的生长,免疫荧光结果显示B组、C组、D组中PCNA的表达明显下调。结论pU6-Pik3cb-shRNA能够有效下调Pik3cb mRNA和PI3K下游效应分子磷酸化Akt和mTOR的表达,抑制VSMC增殖。     

RNA干扰对膀胱癌T24细胞血管内皮生长因子C表达的影响

目的 观察RNA干扰(RNAi)抑制膀胱癌T24细胞中血管内皮生长因子C(VEGF-C)表达和提高化疗敏感性.方法 根据转染效率最高时pEGFPN1质粒与脂质体的比例,转染T24细胞,实验分为3组,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测VEGF-C mRNA的表达,流式细胞仪分析细胞凋亡率.结果 转染后24 h,即有mRNA表达水平的下降,Quantity one半定量:24 h 0.57±0.17,48 h 0.42±0.11,72 h0.33±0.09.VEGF-C抑制后,吉西他滨诱导的凋亡率明显升高,转染组为(41.38±1.54)%,明显高于未转染组(22.87±1.40)%与脂质体组(23.47±1.58)%(P<0.05).结论 RNAi可高效稳定抑制膀胱癌T24细胞中VEGF-C的表达,明显提高吉西他滨诱导膀胱癌T24细胞凋亡的药物敏感性.     

RNAi载体抑制survivin基因在胰腺癌PANC-1细胞中的表达

目的:观察survivin特异性RNAi载体对胰腺癌PANC-1细胞中survivin mRNA和蛋白的表达的抑制作用。方法:将U6启动子驱动的survivin特异性RNAi质粒载体和阴性对照质粒分别转染PANC-1细胞,用RT-PCR和Western blot分别检测survivin mRNA和蛋白的表达。结果:转染survivin特异性RNAi载体24 h和48 h后,PANC-1细胞survivin mRNA表达抑制率分别为(52.67±3.51)%和(75.33±3.06)%,蛋白表达抑制率分别为(58.00±3.61)%和(76.67±4.73)%;与阴性对照组比较,差异均有统计学意义(均P<0.05)。结论:以U6为启动子的survivin的RNAi载体,能有效地抑制胰腺癌细胞株PANC-1中survivin的表达。     

靶向CXCR1基因的shRNA真核表达质粒的构建及鉴定

目的：构建靶向化学趋化因子受体1（CXCR1）的短发夹小干扰RNA（shRNA）质粒表达载体。方法：针对人CXCR1基因的mRNA序列,按RNA干扰靶位点的设计原则,设计并构建靶向CXCR1基因的3个shRNA质粒表达载体和1个阴性对照质粒表达载体,经酶切和测序确认构建成功后,转染胃癌细胞MKN45,RT-PCR和Western blot检测CXCR1 mRNA和蛋白的表达。结果：经酶切和测序证实,3个靶向CXCR1基因的shRNA真核表达质粒均构建成功;与未转染和转染阴性对照质粒的MKN45细胞比较,转染3种shRNA质粒的MKN45细胞,CXCR1 mRNA和蛋白水平均明显下调（均P<0.05）。结论：靶向CXCR1基因的shRNA真核表达质粒的成功构建,为进一步研究CXCR1在胃癌中的功能和实验性靶向治疗提供了初步的基础。

     

shRNA靶向抑制COX-2基因表达对胃癌细胞SGC-7901增殖的影响

目的 探讨环氧化酶-2(COX-2)短发夹RNA(shRNA)对胃癌细胞SGC-7901的生长和细胞周期的影响.方法 构建COX-2基因的特异性小RNA干扰质粒,构建靶向抑制COX-2基因的重组表达载体pshRNA-COX-2.实验分3组:未转染胃癌细胞组,阴性对照HK组,pshRNA-COX-2转染组.用质脂体lipofectamine~(TM) 2000转染胃癌细胞SGC-7901,RT-PCR和Western blot分别检测COX-2基因mRNA和蛋白表达情况,流式细胞术检测细胞周期,细胞计数检测细胞的生长变化.结果 与阴性对照组相比,pshRNA-COX-2重组表达载体抑制COX-2 mRNA及蛋白表达的抑制率分别为70.1%和43.2%;G_0～G_1期细胞由61.5%上升至70.2%,S期细胞由27.3%下降至21.7%;细胞生长明显减慢.结论 pshRNA-COX-2重组表达载体能显著抑制COX-2的表达,从而抑制胃癌细胞生长.     

RNA干扰靶向抑制胃癌细胞血管内皮生长因子C表达的实验研究

目的 构建针对血管内皮生长因子C（VEGF-C）的RNA干扰质粒表达载体pSIH1-H1-copGFP,并评价其转染胃癌细胞后对VEGF-C表达的抑制作用.方法 设计并合成针对VEGF-C基因mRNA序列的3条短发夹RNA及1条阴性对照序列,克隆到pSIH1-H1-copGFP载体,重组构建RNA干扰质粒,并将其转染胃癌细胞（SGC7901）,采用RT-PCR分析转染后VEGF-C基因的表达情况.结果 重组构建pSIH1-H1-copGFP载体经双酶切及插入片断序列分析,表明其成功插入设计位点,并且序列完全一致.3种siRNA质粒表达载体的转染效率均为60%～70%,对VEGF-C mRNA表达的抑制率分别为35.4%、33.8%和81.5%.结论 RNA干扰质粒表达载体介导对VEGF-C基因的RNA干扰可明显抑制胃癌细胞中VEGF-C的表达,可能成为抑制胃癌淋巴管生成的一种有效手段.     

siRNA诱导EZH2基因增强子的表观沉默及其对人前列腺癌细胞的增殖抑制

目的 通过小分子RNA(siRNA)介导靶基因沉默技术,干扰前列腺癌细胞中果蝇zeste基因增强子的人类同源物的表达,以探讨靶向EZH2基因的RNAi对前列腺癌细胞增殖抑制的效应.方法 设计靶向EZH2基因的RNA干扰(RNAi)载体,构建重组表达质粒并且转染人前列腺癌细胞22RV1.利用MTT比色法检测靶向沉默EZH2表达对于22RVl的增殖抑制的影响:利用qRealtime-PCR鉴定转染组与空白组细胞中EZH2基因mRNA的表达量;提取各组细胞的总蛋白,利用Western Blotting检测EZH2蛋白的表达情况.结果 在转染了靶向EZH2基因siRNA的细胞株中,可以检测到EZH2表达呈明显的下调趋势:而在空白对照组中其表达很稳定.另外,诱导EZH2基因沉默可以抑制该前列腺肿瘤细胞的增殖和生长.上述结果 在各组细胞间旱现明显的统计学差异(P<0.05).结论 siRNA诱导的RNAi可以有效的抑制其靶基因EZH2的表达,同时可以抑制前列腺癌细胞的增殖和生长,是一种潜在的基因治疗新方法 .     

Abil在肝细胞癌中的表达及临床意义

目的 研究Abil在肝细胞癌(HCC)组织中的表达情况及其临床意义.方法 采用RT-PCR法检测40例HCC组织及相应癌旁肝组织标本中Abil mRNA的表达情况;免疫组织化学法检测加例HCC组织及相应癌旁肝组织标本中Abil蛋白的表达情况;结合临床病理及随访资料分析Abil表达水平与HCC侵袭转移及预后的关系.结果 Abil mRNA在HCC组织中的表达水平高于相应的癌旁组织(1.32±0.75比0.74±0.52,P<0.05);Abil mRNA在结节性肝癌组织中的表达水平亦明显高于孤立性大肝癌组织(1.72±0.83比1.14±0.57,P<0.05).Abil蛋白主要表达于HCC细胞的胞质内,其表达水平与肿瘤结节数目、是否有包膜、静脉癌栓及Edmondson-Steiner分级密切相关(P<0.05),而与HCC患者的性别、有无肝硬化及肿瘤直径无明显相关性(P>0.05).Abil蛋白高表达组HCC患者的复发转移率明显高于低表达组患者(P<0.05);生存率则明显低于低表达组患者(P<0.02).结论 Abil在HCC组织中的表达水平较癌旁组织高,其表达水平与HCC的结节数目、是否有包膜、静脉癌栓、Edmondson-Steiner分级及临床预后密切相关.     

Combining siRNAs at two different sites in the EGFR to suppress its expression, induce apoptosis, and enhance 5-fluorouracil sensitivity of colon cancer cells

BACKGROUND: The epidermal growth factor receptor (EGFR) has played an important role in the growth and apoptosis of colon cancer. The RNA interference (RNAi) technique can suppress gene expression, but the effects of double combining sites RNAi targeting EGFR have not been well understood. METHODS: pU6-EGFR-shRNA-1 and pU6-EGFR-shRNA-2 expressive vectors were transfected to the LoVo cells. Five groups were selected for the study: Group 1, the control cells; group 2, the negative control plasmid vector HK; group 3, pU6-EGFR-shRNA-1; group 4, pU6-EGFR-shRNA-2; group 5, pU6-EGFR-shRNA-1 and pU6-EGFR-shRNA-2, half for each. The mRNA and protein expression were assessed by Real Time quantitative PCR and Western blot. Apoptosis was determined via flow cytometry. IC(50) and the inhibition ratio of 5-fluorouracil (5-FU) were carried out by CCK-8. RESULTS: In groups 3, 4, and 5, the mRNA expression was decreased by (80.22 +/- 3.42)%, (81.30 +/- 2.83)%, and (90.58 +/- 2.76)%, respectively, and the protein expression was decreased by (74.11 +/- 4.02)%, (73.39 +/- 2.30)%, and (90.39 +/- 3.34)%, respectively. Meanwhile, the cell apoptosis increased by (10.43 +/- 0.49)%, (10.13 +/- 0.39)%, and (14.17 +/- 0.53)%, respectively. The IC(50) of 5-FU and cell inhibition ratio analysis demonstrated that there were significant differences between the following three: group 5, groups 3 and 4, and groups 1 and 2. CONCLUSIONS: Both pU6-EGFR-shRNA-1 and pU6-EGFR-shRNA-2 are capable of suppressing EGFR expression of the LoVo cell and can promote apoptosis and increase the cell toxicity of 5-FU. The double combining sites RNAi technique is significantly better than a single site.     

RNAi抑制前列腺癌雄激素受体表达的实验研究

目的:利用RNA干扰(RNAi)效应抑制雄激素受体(AR)的表达,观察RNAi在人前列腺癌PC3细胞中的干扰效应,寻找高效率的干扰片断。方法:设计5个针对AR的不同的siRNA(siRNA1、siRNA2、siRNA3、siRNA4和siRNA5)为实验组,构建表达载体并瞬时转染PC3细胞,提取总RNA和总蛋白,分别行荧光定量PCR和Western印迹检测AR mRNA和蛋白的表达,另设一无意义RNA表达载体为阴性对照组,比较实验组与对照组间的差异。结果:各实验组的AR mRNA的表达较对照组均不同程度下降,统计学分析差异有显著性(P(0.05),以siRNA1、siRNA4和siRNA5抑制效率最高,对比其余实验组差异有显著性(P(0.05),AR蛋白检测显示相同结果。结论:RNAi技术可有效地抑制前列腺癌细胞AR的表达,找到了具有较高抑制效率的siRNA并合成了其表达载体,为下一步的体内实验和药物研制奠定了基础。     

双位点小干扰RNA靶向抑制表皮生长因子受体促大肠癌细胞凋亡和5-氟尿嘧啶化疗增效的实验研究

目的观察针对单位点与双位点的RNA干扰技术抑制大肠癌LoVo细胞表皮生长因子受体(EGFR)的表达,诱导细胞凋亡以及对5-氟尿嘧啶(5-FU)敏感性的差异。方法构建质粒表达载体pU6-EGFR-shRNA-1和pU6-EGFR-shRNA-2,脂质体转染人大肠癌LoVo细胞,G418筛选4周,分5组:1组为LoVo细胞,2组为对照质粒载体HK,3组为pU6-EGFR-shRNA-1,4组为pU6-EGFR-shRNA-2,5组为pU6-EGFR-shRNA-1和pU6-EGFR-shRNA-2各半量。实时荧光定量PCR和Westernblot检测mRNA和蛋白的表达,流式细胞仪检测细胞凋亡率,细胞増殖分析试剂CCK-8(CellCountingKit-8)测定5-FU不同浓度和时间对LoVo细胞的抑制率和半数抑制浓度(IC50)。结果正确构建了短发夹状RNA(shRNA)质粒表达载体,成功转染;3、4、5组mRNA表达分别下降了(80·2±3·4)%、(81·3±2·8)%和(90·6±2·8)%,蛋白表达分别下降了(74·1±4·0)%、(73·4±2·3)%和(90·4±3·3)%,凋亡率增加了(10·4±0·5)%、(10·1±0·4)%和(14·2±0·5)%,同时对5-FU的IC50和细胞抑制率作统计学分析,5组,3、4组和1、2组三者之间比较差异有统计学意义,而1组2组间、3组4组间各项比较差异无统计学意义。结论两条shRNA均可有效抑制LoVo细胞EGFR表达,促进细胞凋亡,提高5-FU对癌细胞的杀伤作用,靶向联合位点的RNA干扰技术较单一位点的干扰效果更显著,为大肠癌的基因治疗联合化疗提供了新的思路。     

RNAi对基质金属蛋白酶13在兔骨性关节炎中表达的抑制作用

目的 观察RNA干扰技术(RNAi)是否能有效抑制兔OA模型膝关节软骨中基质金属蛋白酶13(MMP13)的表达.方法 体外化学合成MMP13序列特异性双链RNA与脂质体混合后转染OA模型中软骨细胞,实验分四组,特异性RNAi组:特异性RNAi+Lipofectamine2000,非特异RNAi组:非特异RNAi+Lipofectamine2000,脂质体组:Lipofectamine2000,对照组:无血清DMEM.用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和免疫组织化学法检测软骨细胞中的MMP13的表达.噻唑蓝(MTT)比色法检测各组的软骨细胞生长情况.结果 RT-PCR显示RNAi组较对照组、非特异性组和脂质体组的MMP13基因的PCR扩增条带明显减弱,免疫组织化学法显示RNAi组中MMP13阳性细胞数比对照组明显减少.与对照组比较,非特异性组、RNAi组、脂质体组软骨细胞的存活率显著降低(P<0.05),但在3组间两两差异无统计学意义.结论 使用RNA干扰技术可有效抑制兔OA模型中膝关节软骨细胞MMP13的表达,RNA干扰技术为基因治疗OA提供了新策略.     

质粒介导shRNA对心肌细胞kir2.1 蛋白表达和搏动频率的影响

目的构建抑制大鼠心肌细胞k ir2.1基因的真核表达质粒pEGFP 6-k ir2.1,观察对大鼠心肌细胞k ir2.1信使RNA(mRNA)、蛋白表达情况及搏动频率的影响。方法选择5个针对大鼠心肌细胞k ir2.1基因的RNA干扰(RNA in terference)位点,设计合成5对相应的寡核苷酸链,形成双链后依次将其连入带有U 6启动子的载体,得到含5个目的基因的重组质粒pEGFP 6-k ir2.1。转染大鼠心肌细胞,并将其分为3组:实验组、阴性质粒对照组和空白对照组。转染后72h,用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和蛋白印迹法(W estern-b lotting)检测k ir2.1mRNA和蛋白表达情况,并观察细胞搏动频率。结果转染后72h,实验组心肌细胞k ir2.1 mRNA和蛋白表达明显低于两对照组(P<0.01),两对照组间比较差别无统计学意义;实验组搏动频率增加,并显著高于两对照组(P<0.01),两对照组之间搏动频率差别无统计学意义。结论真核表达质粒pEGFP 6-k ir2.1能明显抑制大鼠k ir2.1基因的表达,提高大鼠心肌细胞的自律性。     

RNA干扰技术靶向SMYD3基因治疗肝癌的实验研究

目的 构建针对人SET-和MYND-结构域含有蛋白3（SMYD3）编码基因的短发夹状RNA（shRNA）干扰质粒,并研究其对肝癌细胞的作用。方法 应用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）方法检测SMYD3mRNA在肝癌细胞系HepG2、Hep3B、SMMC7721的表达。构建重组SMYD3shRNA表达质粒Pgenesil-1-s,并采用介导转染法导入HepG2细胞,蛋白免疫印迹法（Western blot）检测阻抑效应,噻唑蓝比色法（MTT）检测细胞生长增殖抑制率,流式细胞术检测细胞凋亡率。建立人肝癌细胞HepG2皮下移植瘤裸鼠模型,注射Pgenesil-1-s,动态观察肿瘤体积并于2周后处死裸鼠称取瘤重。结果肝癌细胞株HepG2、Hep3B、SMMC7721的SMYD3mRNA表达水平显著高于正常肝细胞株L-02;Pgenesil-1-s转染HepG2细胞后,SMYD3蛋白表达明显下调,而且细胞凋亡率显著增加,细胞生长明显受抑;经重组质粒治疗14d后,裸鼠皮下移植瘤生长缓慢,相较于对照组瘤体明显缩小、瘤重明显减轻（P〈0．01）。结论 肝癌细胞高表达SMYD3,shRNA干扰特异性抑制SMYD3表达,可以促进肝癌细胞凋亡并抑制裸鼠移植瘤的生长。     

双链小片段干扰RNA抑制缺氧条件下乳鼠心肌细胞缺氧诱导因子1α表达

目的　构建含缺氧诱导因子 1α(HIF 1α)小片段干扰RNA(siRNA)靶序列的U6启动子表达框结构 ,观察其对缺氧条件下乳鼠心肌细胞HIF 1α表达的影响。　方法　分离培养乳鼠心肌细胞 ,分为常规培养液对照组、RNA干扰 (RNAi)组 (转染无效干扰序列Ⅳ )、RNAi抑制组 (转染有效干扰序列并按下游引物不同分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组 )。设计、合成 3对 (Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ )含HIF 1α编码基因片段(正、反义 )和 1对 (Ⅳ )随机序列 (正、反义 )的PCR下游引物。PCR法构建U6启动子表达框及相应正、反序列表达框 ,同时转染心肌细胞。每组每时相点 5皿细胞。于缺氧 1h后 ,用蛋白免疫印迹法(Western blot)测定其蛋白水平表达 ,免疫组织化学法检验干扰效果。缺氧 6h后采用逆转录 聚合酶链反应 (RT PCR)法检测HIF 1αmRNA的表达。　 结果　筛选出的最佳抑制片段为Ⅱ组序列。缺氧 1h,对照组、RNAi组心肌细胞HIF 1α蛋白水平显著增高 ,Ⅰ、Ⅱ、ⅢRNAi抑制组HIF 1α蛋白水平较对照组明显降低 ,其中Ⅱ组降低最为显著 (P <0.0 1);缺氧 6h,RNAi组心肌细胞HIF 1αmRNA水平较常氧条件下明显增高 (P <0.0 1);RNAi抑制Ⅱ组未见明显增高 (P >0.0 5 )。　 结论　构建的HIF 1αⅡ组表达框能有效地抑制缺氧乳鼠心肌细胞HIF 1α表达     

RNA干扰抑制PC-3细胞survivin基因表达并诱导细胞凋亡的实验研究

目的:研究RNA干扰抑制人前列腺癌PC-3细胞survivin mRNA和蛋白表达并诱导细胞凋亡的效果。方法:设计、构建针对survivin基因的RNAi表达载体,分别以质粒A、B组,阴性序列组和空白对照E组用脂质体法转染PC-3细胞,应用RT-PCR及Western印迹、流式细胞术检测其对survivin mRNA和蛋白表达并诱导细胞凋亡的效果。结果:各组细胞survivin蛋白的表达强度分别为(18.94±0.63)%、(16.35±0.23)%、(46.41±0.76)%、(46.20±1.47)%。各组细胞中survivin mRNA的表达强度分别为(27.94±1.43)%、(24.51±1.37)%、(49.46±0.71)%、(48.49±1.32)%。各组细胞凋亡率分别为(12.80±1.33)%、(16.48±1.00)%、(3.03±0.62)%、(2.96±0.41)%。统计学表明构建的两种阳性表达载体均有效抑制了survivin mRNA和蛋白表达并诱导细胞凋亡。结论:RNAi可有效抑制PC-3细胞survivin mRNA和蛋白表达,并诱导细胞凋亡。     

含人β1转化生长因子短发夹RNA重组腺病毒载体的构建和鉴定

目的 构建含人β1转化生长因子(TGF-β1)短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)的复制缺陷型腺病毒载体.方法 通过聚合酶链式反应(PCR)法将带有TGF-β1 shRNA 序列构建至U6启动子(U6sh TGF-β1)下游,与T载体连接,将质粒转化人大肠杆菌.将U6sh TGF-β1连到穿梭质粒pDC316上,与腺病毒基因组质粒pBHGlox△E1、3Cre共转染293T细胞,得到重组腺病毒载体(rAd TGF-β1).经PCR鉴定正确后,进行扩增、纯化、滴度测定及感染性鉴定.结果 PCR法得到目的 片段U6sh TGF-β1,经测序,序列与设计方案完全一致.rAd TGF-β1具有良好的感染性,腺病毒滴度可达107.3TCID50/ml.双引物PCR法鉴定Ad TGF-β1可扩增出腺病毒E2b区片段及特异性片段U6sh TGFβ1.结论 成功构建了能表达TGF-β1 shRNA 的重组腺病毒载体rAd TGF-β1(A)及对照载体rAdTGF-β1(B),可能为临床应用RNA干涉--新的基因技术防治瘢痕疙瘩提供高效的方法.