小鼠抗内质网相关的干扰素诱导病毒抑制蛋白(viperin)多克隆抗体的制备

目的 以纯化的内质网相关的干扰素诱导病毒抑制蛋白(viperin)免疫小鼠制备其多克隆抗体并鉴定其特异性。方法对BALB/c小鼠颅内注射鸭坦布苏病毒,刺激小鼠脑组织产生viperin,通过反转录PCR从小鼠大脑组织克隆viperin,并将其插入至pGEX-6P-1原核表达载体,转化至大肠杆菌Rosetta。用异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)对重组蛋白诱导表达,对其进行可溶性分析,以氯化钾染色切胶法对大量表达蛋白进行纯化;将纯化的重组viperin蛋白经腹部皮下免疫小鼠制备多克隆抗体,利用间接ELISA测定多抗效价,Western blot法和间接免疫荧光法(IFA)检测BHK-21仓鼠肾成纤维细胞瞬时表达的viperin蛋白鉴定viperin抗体的特异性和敏感性。结果 成功克隆并表达小鼠viperin基因,制备的抗体效价可达1∶25 600,小鼠抗viperin多克隆抗体可特异性识别BHK-21细胞表达的viperin蛋白。结论 成功制备特异性较好的小鼠抗viperin多克隆抗体。     

人源Nodal成熟肽的原核表达及多克隆抗体的制备

目的:表达人Nodal成熟肽,免疫小鼠制备其多克隆抗体。方法:构建原核表达质粒pReceiver-hNodal,转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达His6-hNodal融合蛋白,融合蛋白经Ni-NTA树脂亲和纯化后,回收融合蛋白,免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体。通过间接ELISA、Westernblot和免疫细胞化学染色和间接免疫荧光等方法检测抗体的效价和特异性。结果:在大肠杆菌中高效表达了与预期理论值大小相符的Mr约13 000的人Nodal成熟肽的融合蛋白,通过免疫小鼠制备的多克隆抗体效价高、特异性强。结论:成功制备了抗人Nodal成熟肽多克隆抗体,为进一步深入研究Nodal在肿瘤发生发展过程中的生物学功能奠定了基础。     

人CD1d分子胞外区的原核表达及其多克隆抗体的制备

目的:原核细胞表达人CD1d分子胞外区及制备其多克隆抗体.方法:用RT-PCR法扩增人CD1d分子胞外区基因,将其克隆入原核表达载体pET28中,转化大肠杆菌BL21(DE3),用IPTG诱导重组蛋白的表达,用亲和层析法纯化重组蛋白,以之为免疫原免疫小鼠制备多克隆抗体,并以ELISA、Western blot及免疫组织化学法检测抗体.结果:在原核细胞中高效表达和纯化了人CD1d分子胞外区蛋白,用其免疫小鼠,获得了效价高、特异性较好的多克隆抗体,免疫组织化学检测显示该抗体可识别人小肠组织中的天然CD1d分子.结论:成功制备了人CD1d分子胞外区重组蛋白及鼠抗人CD1d分子胞外区抗体,为进一步建立人CD1d分子的免疫学检测方法及其生物学功能的深入研究奠定了基础.     

小鼠PD-1胞外区基因片段表达、纯化及其多克隆抗体的制备

目的:原核表达并纯化小鼠PD-1膜外区(以下简称mPD-1)蛋白,制备其多克隆抗体。方法:原核表达质粒pGEX-4T-1/mPD-1转化大肠杆菌E.coliBL21(DE3),IPTG诱导重组蛋白的表达。对表达产物进行SDS-PAGE电泳和Western blot检测。利用蛋白质纯化仪纯化蛋白。使用纯化蛋白免疫日本大耳白兔3次后,分离抗血清,ELISA法测定兔多克隆抗体滴度。用其制备的多克隆抗体通过细胞免疫荧光方法(CIF)和FCM检测高表达PD-1全长基因的L929细胞。结果:诱导表达并纯化了GST-mPD-1重组蛋白,得到相对分子质量(Mr)约42000的mPD-1蛋白。纯化蛋白免疫动物后,产生特异的高滴度抗体(ELISA滴度达1∶1562500)。CIF和FCM结果显示抗血清与L929细胞表面PD-1有高度的特异性结合活性。结论:成功获得高纯度的mPD-1重组蛋白,免疫动物后,获得了特异、高效价的抗体,为将mPD-1蛋白及抗体用于PD-1的生物学研究及抗肿瘤治疗的实验研究奠定了基础。     

HIV-1蛋白酶基因的克隆、蛋白表达及抗体制备

目的为了研究HIV-1蛋白酶的生物学活性,制备HIV-1 PR蛋白及其特异性抗体。方法用PCR方法扩增编码PR的基因序列,将其克隆到原核表达载体pET28a(+)中,并表达HIV-1 PR蛋白,用His抗体为一抗做Western blot鉴定目的蛋白。以纯化的目的蛋白为抗原免疫日本大耳白兔,制备多克隆抗体。通过酶联免疫吸附实验(ELISA),免疫细胞化学法检测抗体滴度及其特异性。结果原核表达载体pET28 a(+)-PR成功构建,并可在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达,得到的PR蛋白经SDS-PAGE和Western blot鉴定正确。用纯化蛋白免疫家兔,制备的多克隆抗体具有较强免疫特异性。结论得到纯化的HIV-1PR蛋白,制备的多克隆抗体能够检测自然状态下病毒蛋白PR,为进一步研究HIV-1奠定了实验基础。     

PPM1A蛋白的表达纯化及鼠多克隆抗体制备研究

目的 表达、纯化PPM1A-His融合蛋白及制备鼠多克隆抗体.方法 将pBEX1-PPM1A-His原核表达质粒在大肠杆菌BL21(DE3)pLysS内进行诱导表达,用纯化的PPM1A-His融合蛋白免疫Balb/c小鼠制备多克隆抗体,并用ELISA、免疫组化和免疫荧光检测抗体的灵敏度和特异性.结果 成功表达并纯化了PPM1A-His融合蛋白,纯化后纯度可达90%;ELISA法测定抗体效价为1:100 000;免疫组化和免疫荧光结果显示所制备的抗体可特异性检测肝和肝癌细胞的PPM1A.结论 获得的PPM1A鼠多克隆抗体有较高的效价和特异性,为PPM1A在肝癌的相关研究打下了基础.     

小鼠PDL-1胞外区基因表达、纯化及其多克隆抗体的制备

目的:原核表达并纯化小鼠PDL-1膜外区(以下简称mPDL-1)蛋白,制备其多克隆抗体。方法:原核表达质粒pET28a(+)/mPDL-1转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3),IPTG诱导重组蛋白的表达。对表达产物进行SDS-PAGE电泳和Western blot检测。利用切胶回收的方法纯化蛋白。使用纯化蛋白免疫日本大耳白兔3次后,分离抗血清,ELISA法测定兔多克隆抗体滴度。用其制备的多克隆抗体通过细胞免疫荧光方法(CIF)和流式细胞术(FCM)检测表达PDL-1基因的B16细胞。结果:诱导性表达并纯化了mPDL-1重组蛋白,得到相对分子质量(Mr)约30000的mPDL-1蛋白。纯化蛋白免疫动物后,产生特异的高滴度抗体(ELISA滴度达1∶1562500)。CIF和FCM结果显示抗血清与肿瘤细胞表面PDL-1有高度的特异性结合活性。结论:成功获得高纯度的mPDL-1重组蛋白,免疫动物后,获得了特异、高效价的抗体,为将mPD-L1蛋白及抗体用于PDL-1的生物学研究及抗肿瘤治疗的实验研究奠定了基础。     

肿瘤抑素抗血管活性相关肽的表达及活性研究

目的利用大肠杆菌表达系统表达肿瘤抑素抗血管活性相关肽-21肽,检测其生物学活性。方法人工合成21肽基因序列(肿瘤抑素75～95位氨基酸),克隆到表达载体pTYB2上,转化大肠杆菌BL-21(DE_3),酶切和测序鉴定后,用IPTG诱导表达融合蛋白。经几丁质亲和层析柱纯化21肽。通过MTT实验,细胞生长曲线测定,小鼠肝癌转移瘤模型的大体抑瘤实验及组织病理学切片研究其活性。结果获得的可溶性21肽对人脐静脉内皮细胞的生长具有抑制作用。小鼠肝癌转移瘤模型的大体抑瘤实验抑瘤率达42.86%。组织病理学切片结果可见H22小鼠肝癌细胞死亡,血管数量减少。结论经初步检测获得具有抗血管活性的21肽,为进一步研究肿瘤抑素的作用机制和肿瘤的临床治疗奠定了基础。     

人内皮抑制素在酵母细胞中的表达及其促成纤维细胞有丝分裂活性

利用酵母真核细胞表达系统表达出重组人内皮抑制素 (Endostatin) ,并对其促成纤维细胞有丝分裂活性进行研究。方法 :采用逆转录 PCR技术自人肝组织获得人内皮抑制素的cDNA ,将其克隆入真核表达载体pYEX4T 1,构建含人Endostatin的重组质粒 (pYEXEndo) ;经全自动序列分析仪测序确证后 ,将此重组质粒转化入酵母细胞 (DY15 0 )中进行诱导表达 ,表达产物经SDS PAGE分析及Westernblot鉴定。以MTT掺入法初步检测了重组人内皮抑制素对NIH3T3细胞的促有丝分裂活性。结果 :经CuSO4诱导的含pYEXEndo的酵母细胞表达出重组人GST Endostatin的融合蛋白 ,此蛋白在凝胶上表现为一约 45kD的阳性区带 ,在Westernblot实验中可被GST特异性多克隆抗体识别。重组人GST Endostatin融合蛋白的粗提物在体外能刺激NIH3T3细胞增殖。结论 :人GST Endostatin的融合蛋白在酵母表达系统中高水平表达 ,并具有刺激成纤维细胞生长的生物学活性。     

Syncytin蛋白的原核表达及其多克隆抗体的制备和鉴定

目的克隆人syncytin基因并在大肠杆菌中表达,并用表达后的融合蛋白制备syncytin蛋白多克隆抗体。方法 PCR扩增人syncytin基因编码区的DNA片段,将其克隆入原核表达质粒pET30a(+),转化大肠杆菌BL21,诱导产生syncytin-His融合蛋白。采用割胶回收的方法纯化目的蛋白,免疫新西兰白兔,制备多克隆抗体。通过ELISA、Western-Blot和免疫组织化学等方法来检测抗体的灵敏度和特异性。结果成功表达并纯化了syncytin-His融合蛋白,SDS-PAGE分析表明融合蛋白主要以包涵体形式存在;ELISA法测定抗体效价为1:10 000;Western-Blot和免疫组织化学结果显示所制备的抗体能特异性识别syncytin蛋白。结论成功制备和鉴定了人syncytin多克隆抗体,多克隆抗体特异性强和效价高,为下一步研究Syncytin的生物学功能奠定了基础。     

鼠抗人内皮抑素单克隆抗体的制备与鉴定

目的:制备抗人内皮抑素的单克隆抗体(mAb),为深入研究内皮抑素的作用机制提供一种有用的试剂。方法:以毕赤酵母表达的内皮抑索为免疫原免疫BALB/c小鼠,采用B细胞杂交瘤技术,以间接ELISA法筛选分泌抗人内皮抑素的特异性mAb的杂交瘤细胞株,并诱生腹水。腹水中的mAb采用 Protein A Sepharose CL-4B进行纯化。以标准的抗Ig血清做ELISA,鉴定mAb的Ig类、亚类及型;用免疫印迹法鉴定mAb的特异性。结果:获得1株可分泌抗人内皮抑素mAb的杂交瘤细胞株4E7,该株杂交细胞分泌的mAb属于IgGl(λ型)。腹水mAb的效价为1×10-4-1×10-6,纯化后大于1×10-10。免疫印迹结果显示,mAb 4E7可特异性地与酵母及大肠杆菌表达的内皮抑素起反应,而与bFGF等其他细胞因子不发生交叉反应。结论:分泌抗人内皮抑素mAb杂交瘤细胞株的建立,为进一步研究奠定了基础。     

人内皮抑素基因改造、表达、纯化及活性检测

目的克隆诱变的人内皮抑素(human endostatin,hES)氨基端基因,并检测其活性。方法双酶切已诱变的人内皮抑素基因,电泳回收氨基端片段,与质粒pTYB-2重组,转化E．coli BL-21(DE3)。通过鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)实验,MTT实验,HE染色及流式细胞术检测重组小分子人内皮抑素对新生血管生成、细胞增殖和细胞凋亡的影响。结果基因重组小分子内皮抑素对鸡胚尿囊膜新生血管生成具有明显的抑制作用;对脐静脉内皮细胞和肝癌细胞增殖的抑制存在量效关系;作用24h后,观察到细胞凋亡现象;与对照组相比,细胞凋亡数增加。结论成功构建了人内皮抑素氨基端基因工程菌,得到了具有生物活性的氨基端小分子内皮抑素,为便利临床应用奠定了基础。     

重组人内皮抑素腺病毒抗肿瘤实验研究

目的肿瘤生长具有血管依赖性。内皮抑素为胶原X羧基末端裂解片段,是重要的内源性血管抑制因子。实验中利用重组人内皮抑素腺病毒(recombinanthumanendostatinadenorirus,Ad-hEndo)在肿瘤局部给药以探索其抗血管基因治疗的可行性。方法以Ad-hEndo感染体外培养肿瘤细胞,观察重组蛋白表达及其对培养的血管内皮细胞的抑制效应;在裸鼠A549肺癌模型中瘤内注射重组病毒,观察肿瘤抑制效应、剂量依从效应和毒副反应。结果不同感染复数的Ad-hEndo感染肿瘤细胞均表达重组内皮抑素蛋白,并能抑制血管内皮细胞的生长。动物实验中Ad-hEndo治疗组肿瘤体积及肺转移结节数明显低于对照组,且转移数与治疗剂量负相关。结论以腺病毒为载体的肿瘤局部血管基因治疗能抑制肿瘤新生血管形成进而有效抑制肿瘤生长和转移,其效应具有剂量依从性。     

Increased endostatin/collagen XVIII expression correlates with elevated VEGF level and poor prognosis in hepatocellular carcinoma.

Liver is the primary source for collagen XVIII, the precursor of angiogenesis inhibitor, endostatin. However, the role of endostatin/collagen XVIII expression during liver carcinogenesis remains elusive. Therefore, we studied its expression in five hepatoma cell lines and 105 hepatocellular carcinoma specimens. The poorly differentiated hepatoma cell lines exhibited increased endostatin/collagen XVIII levels compared with the well-differentiated ones. In hepatoma tissues, endostatin/collagen XVIII expression was detected in various types of liver cells and was significantly stronger in adjacent nontumor tissues than that in tumors (P<0.001). Endostatin/collagen XVIII expression in nontumor tissues correlated with tumor stages (P=0.014) and expression of vascular endothelial growth factor (P=0.007), but not the stages of hepatic fibrosis (P>0.05). Kaplan-Meier analysis showed that patients with higher endostatin/collagen XVIII expression had significantly shorter overall survival (P=0.011) and disease-free survival (P=0.0034). Moreover, endostatin/collagen XVIII level was an independent prognostic factor for tumor recurrence (P=0.034) by multivariate analysis. In conclusion, increased endostatin/collagen XVIII expression correlated with hepatoma progression and predicted poor prognosis for patients with hepatocellular carcinoma.     

Antigenic and immunogenic properties of gamma-glutamyl-transferase preparations.

Incubation time of human kidney gamma-glutamyl-transferase (GGT) with specific antiserum and precipitate formation caused no effect on inhibition of the enzyme activity. In the obtained precipitate GGT activity was independent of the amount of antiserum and contained 30% of the initial enzyme activity. After reaction of the serum with human liver GGT or with the urine enzyme a precipitate formation and decrease in the enzyme activity was noted. In the serum incubated with GGT isolated from animal kidneys, neither inhibition nor precipitation was observed. The precipitate of bovine kidney GGT with a specific antibody independently of the amount of antibody contained 50% of activity. After treatment of bovine GGT with bromelain four protein fractions giving precipitin lines in crossed-immunoelectrophoresis were observed but only one of them preserved catalytic activity. Immunogenicity of newly obtained immobilized GGT preparations was much lower than that of the native enzyme. A distinct and different influence of antibody on the affinity of native and immobilized GGT preparations to donor and acceptors of gamma-glutamyl group was noted. The immunofluorescent technique was used for GGT localization in some bovine tissue sections.     

人类新基因CTRP4的原核表达及多克隆抗体的制备

目的:构建新基因CTRP4的原核表达载体,在大肠杆菌中表达并纯化rhCTRP4-his蛋白,制备和鉴定小鼠抗人CTRP4多克隆抗体,为进一步研究人类新基因CTRP4的生物学功能奠定基础。方法:从pcDNA3.1-myc/his(-)B-hCTRP4重组载体中通过PCR的方法扩增CTRP4基因ORF中不含信号肽的目的基因片段,将得到的片段双酶切定向插入pET-32a中,构建原核表达载体pET-32a-hCTRP4。构建好的质粒在E.coli BL21(DE3)中进行诱导、表达,通过镍亲和层析柱纯化融合蛋白,SDS-PAGE电泳分析蛋白纯度。将pcDNA3.1-myc/his(-)B-hCTRP4重组质粒和纯化好的融合蛋白依次免疫BALB/c小鼠,制备多克隆抗体。并对抗体进行纯化、效价测定以及特异性鉴定。结果:DNA测序证实构建的pET-32a-hCTRP4重组表达载体含有hCTRP4编码序列,其序列比对分析与GenBank中公布序列一致,质粒在E.coli中表达相对分子质量(Mr)为35 000的目的蛋白,SDS-PAGE电泳分析纯度为95%以上。ELISA法检测抗体效价为1∶20 000,Westernblot、免疫荧光细胞化学和免疫组化分析显示抗体能特异性识别重组hCTRP4以及天然状态hCTRP4蛋白。结论:成功构建了hCTRP4蛋白的原核表达载体,并获得较高纯度的融合蛋白,制备了高效价、高特异性的多克隆抗体。     

人胆酸转运蛋白基因的克隆、亚细胞定位及其在肾组织中的表达

目的：克隆人肾与小肠ASBT（顶端Na+/胆汁酸协同转运蛋白）基因并比较2者的序列差别，明确ASBT蛋白在肾小管上皮的亚细胞定位及在人肾组织中的表达情况。方法:从人肾和小肠组织中提取总RNA，然后用带有8肽FLAG标签的PCR引物通过RT-PCR技术扩增ASBT全长cDNA基因并测序，并将其插入真核表达载体中构建ASBT蛋白真核表达载体，然后将其转染到肾小管上皮细胞LLC-PK1中表达并用免疫荧光-激光共聚焦显微镜观察该蛋白的亚细胞定位情况。用免疫组化技术观察ASBT在人肾组织中的表达分布。结果:序列分析结果表明肾小管ASBT基因的序列与小肠ASBT序列完全一致。Western blotting表明ASBT基因在LLC-PK1细胞中得到了正确的表达。共聚焦显微镜分析显示正常ASBT蛋白主要定位于肾小管上皮细胞膜上，与生物信息学的预测结果一致。免疫组化染色表明ASBT蛋白主要表达于人近端肾小管上皮的刷状缘侧，在间质及远端小管没有表达。结论:人肾小管ASBT基因序列与小肠ASBT相同，ASBT蛋白主要表达于近端肾小管上皮细胞管腔侧细胞膜。     

丙型肝炎病毒核蛋白在转基因小鼠中的表达及与Fa…

将中国人丙型肝炎病毒９ＨＣＶ）分离株的５－非编码区和结构基因（５ＵＴＲ＋Ｃ＋Ｅ１＋Ｅ２）区基因插入到ｐｃＤＮＡ３载体构成表达质粒，通过显微注射法将此质粒注射入Ｆ１代杂交鼠（Ｃ５７ＢＬ／６ＸＩＣＲ）受精卵，并植入假孕母鼠输卵管中，经筛选获得整合有目的基因的转基小鼠系。免疫组化研究表明，ＨＣＶ核壳蛋白在转基因小鼠各组织中皆有表达，多呈核型当色，心肌细胞中可见浆型。核壳蛋白在各组织中的表达水平；心〉肺〈