多因子正交试验对中药青蒿丛生芽诱导条件的筛选

中药青蒿，即黄花蒿Artemisia annua L.又名臭蒿、臭青蒿，为菊科蒿属一年生草本植物。从青蒿中提取的青蒿素及其衍生物是继喹啉类和吖啶类之后的一类新的抗疟药物［1］，如今临床上还用蒿甲醚、青蒿琥酯预防和治疗血吸虫病，据近几年报道，二氢青蒿素、蒿甲醚用于治疗与艾滋病相关的弓形虫病已取得了很好的临床效果［2］。最近也发现青蒿类药物具有抗肿瘤的作用，免疫调节作用，抗心律失常以及预防和治疗矽肺的作用等［3］。但由于青蒿为异花授粉植物，群体内单株之间性状差异显著，花特别细小，自交不亲和，自交纯化难度大，青蒿素含量高的优良种质的繁育与保存相当困难。通过组织培养获得高青蒿素含量的中药青蒿无性系，使母株的优良性状可以完整地遗传下去，是快速稳定青蒿优异性状、缩短青蒿育种年限的有效途径。关于青蒿组织离体培养虽有报道，但愈伤组织分化率较低，杨耀文等［4］的研究中每块愈伤不定芽仅5个左右，且存在随愈伤组织继代次数的增加不定芽分化能力降低的缺点；耿飒等［5］研究认为激素和基本培养基对青蒿丛生芽的发生有显著影响，但对于各种成分的影响大小未进行研究，并且在其研究中没有考虑暗处理对丛生芽分化的影响。本研究以野生青蒿幼叶为外殖体，采用正交试验设计方法，对影响青蒿丛生芽发生的因素进行比较研究，筛选一步诱导青蒿丛生芽的最佳条件，为青蒿优良品种的大量微体快繁奠定基础。     

不同碳源对草珊瑚丛生芽诱导增殖的影响

目的探讨适宜草珊瑚丛生芽诱导增殖的碳源培养基。方法用蔗糖、白糖、葡萄糖、果糖等四种糖为碳源作对比试验。结果以蔗糖、白糖为佳,质量浓度20g/L为宜。结论以MS为基本培养基,在植物激素水平恒定基础上,碳源的种类和质量浓度是影响草珊瑚丛生芽诱导和增殖的主要因素。     

TDZ和NAA对老鸦瓣不定芽诱导和丛生芽增殖的影响

以老鸦瓣鳞茎芯芽和子茎（芽茎顶端膨大形成的子鳞茎）为外植体,探索噻苯隆（TDZ）和α-萘乙酸（NAA）诱导老鸦瓣外植体直接成芽的方法,建立老鸦瓣器官途径丛生芽组培体系。研究结果表明,芯芽和子茎在MS+ TDZ 2.0 mg·L^-1+NAA 2.0 mg·L^-1和MS+TDZ 2.0 mg·L^-1+NAA 4.0 mg·L^-1培养基中可直接诱导不定芽,芽诱导率分别为72.92%,79.22%;利用子茎不定芽在MS+TDZ 0.2 mg·L^-1+ NAA 0.2 mg·L^-1培养基中可进行丛生芽增殖,增殖系数2.23,形成的芽体健壮,叶色嫩绿;增殖后的丛生芽在含有IBA 1.0 mg·L^-1的MS培养基中即可生根,生根率52.6%,平均3~5条根。利用老鸦瓣芯芽和子茎,筛选出了老鸦瓣芯芽和子茎直接诱导不定芽及丛生芽增殖和生根的最适培养基,建立了器官途径丛生芽组培体系。     

半夏丛生芽诱导及快速繁殖

目的:以叶片、叶柄为外植体,建立半夏的快速繁殖体系.方法:用半夏块茎诱导的丛生芽叶片、叶柄作外植体.结果:叶片、叶柄可以不经过愈伤组织而直接再生成植株,培养基MS 6-BA 2.0 mg/L NAA 0.1 mg/L对外植体叶的分化诱导效果最好,MS 6-BA 2.0 mg/L NAA 0.25 mg/L则适于叶柄,生根培养基以1/2MS KT 1.0 mg/L NAA 2.0 mg/L效果较好.结论:通过对半夏块茎诱导的叶片和叶柄形成的丛生芽可以提高半夏繁殖系数.     

黑节草茎段直接诱导丛生芽

介绍利用黑节草茎节外殖体获得丛生苗的方法：黑节草茎节段在１／２ｍｓ＋６－ＢＡ２ｍｇ／Ｌ＋ＮＡＡ０．２ｍｇ／Ｌ的培养基上,先诱导形成愈伤组织,然后出许多绿色小芽。进一步移至１／２ｍｓ＋ＮＡＡ０．５ｍｇ／Ｌ培养基上产生大量的丛生芽。丛生芽培养于１／２ｍｓ＋ＩＢＡ０．５ｍｇ／ｌ＋ＮＡＡ０．５ｍｇ／Ｌ培养基上,可诱导生根形成完整植株。     

流苏石斛丛生芽增殖和生根的研究

目的为了提高流苏石斛的增殖系数。方法以流苏石斛的无菌苗为材料,研究不同浓度的激素、香蕉汁、土豆汁、椰汁对流苏石斛丛生芽增殖的影响,以及激素对流苏石斛丛生芽生根的影响。结果适宜丛生芽增殖的培养基为MS+6-BA2.0 mg/L+NAA 1.2 mg/L+香蕉汁10%,增殖系数达10.769;1/2MS+NAA 0.2 mg/L+IBA 2.0 mg/L+AC 0.1%时生根效果最好,生根率达90.19%,而且根生长健壮,平均生根数为4.778。结论生长素和细胞分裂素进行配合使用,能有效的促进石斛丛生芽的增殖。低浓度激素培养的丛生芽更容易生根。     

影响中药青蒿有效成分的几个因子

本试验论述了不同地区的青蒿(Artemisia annua)种子以及不同播期、不同生态型、不同取样器官对青蒿素含量的影响。     

中药青蒿幼株的化学成分研究

中药青蒿的抗疟有效成分为青蒿素,但青蒿幼株无抗疟作用。经研究青蒿幼株含大量青蒿酸而乏青蒿素,推测青蒿素等倍半萜类化各物系由青蒿酸转化而来。为合理利用青蒿提供了依据。     

八角莲丛生芽分化及试管苗移栽技术研究

目的探讨了八角莲的组织培养和快速繁殖技术。方法以八角莲的叶片作为外植体,接种在不同的培养基上,观察八角莲愈伤组织丛生芽的诱导率。结果以NAA1.0mg/L+6-BA0.2mg/L的激素配比最有利于新芽生根;苔藓+腐殖土的栽培基质中,八角莲试管苗的生长状况最好。结论通过合理筛选激素配比,可促进八角莲愈伤组织产生丛生芽并生根形成幼苗,为快速繁殖八角莲提供依据。     

生物技术在中药青蒿中的应用研究

青蒿素是从中药青蒿中提取的治疗疟疾的最有效药物,但在青蒿中青蒿素的含量很低.作者从以下3个方面概述了生物技术在青蒿中的应用研究:一是通过DNA的分子标记辅助育种.应用于青蒿种质资源的遗传多样性研究,为高青蒿素含量优良品种的快速选育提供分子生物学基础;二是通过基因工程技术提高青蒿素的含量;在青蒿中过表达青蒿素生物合成的关键酶基因;抑制与青蒿素生物合成竞争相同底物的酶基因的表达,直接或间接的提高青蒿素的含量;三是通过合成生物学技术在宿主内生产青蒿素的前体或青蒿素.     

播种期对黄花蒿产量的影响

目的为黄花蒿播种期的确定提供科学依据。方法测定不同播种期的叶片及种子产量,并进行方差分析。结果播种期对叶片产量的影响不显著,但对种子产量的影响极显著。结论以收获叶片为目的时适宜播种期为2月中旬至4月中旬,以收获种子为目的时最佳播种期为2月中旬以前。     

野生黄花蒿种源抚育技术

目的为黄花蒿新品种选育和杂交育种提供依据。方法通过对野生黄花蒿在间苗、补苗、除草、施肥、培土、防治病虫害和除杂去劣等技术环节的研究,提高野生黄花蒿的种子产量。结果平均每hm产黄花蒿种子31.95kg以上。结论本试验可解决黄花蒿品种人工栽培的用种需求。     

湖南雪峰山地区野生黄花蒿挥发油化学成分的研究

用气相色谱质谱联用法对湖南雪峰山地区野生黄花蒿挥发油进行化学成分分析。采用水蒸气蒸馏法从黄花蒿中提取挥发油,用气相色谱质谱法对其化学成分进行鉴定,归一法测定其百分含量。共鉴定出45个成分,占挥发油总成分的90%。从鉴定出的化学成分可知,湖南雪峰山地区野生黄花蒿品种优良,有开发的潜力和价值。     

青蒿叶药材质量标准研究

 目的 制定青蒿叶药材的质量标准,为该药用植物资源的开发利用提供科学依据。方法 采用了显微鉴别法、薄层色谱法、HPLC、水分测定法、灰分测定法及浸出物测定法。结果 根据10个不同产地青蒿叶测定结果,确定青蒿素含量不低于0.1%,东莨菪内酯含量不低于0.1%,含水分不高于11%,总灰分不高于11%,酸不溶性灰分不高于2%,95%乙醇冷浸出物不低于7%。结论 建立了青蒿叶的质量标准。
     

青蒿花药培养研究

目的 以青蒿花药为材料,进行诱导培养,获得了胚性愈伤组织,为青蒿单倍体植株的诱导奠定了基础.方法 青蒿花药在进行不同时间的低温前处理后,置于含不同激素和蔗糖浓度的MS培养基上,再进行不同时间的高温后处理,然后转入25℃黑暗培养,统计愈伤诱导率.结果 青蒿花药培养最适培养基是6-BA 1 mg/L+2,4-D 0.3 mg/L+蔗糖3%或6-BA 1 mg/L+NAA 0.3 mg/L+蔗糖3%,无需低温前处理和高温后处理.结论 可通过青蒿花药培养得到单倍体胚性愈伤组织.     

青蒿鲨烯合酶基因打靶研究

目的通过代谢途径工程调整代谢流向,试图增大转基因青蒿Artemisia annua植株中的青蒿素产量。方法利用青蒿鲨烯合酶(SS)基因、绿色荧光蛋白(GFP)基因和胞嘧啶脱氨酶(CodA)基因构建基因打靶载体,并通过冻融法将载体导入根癌农杆菌Agrobacterium tumefaciens。以叶盘法转化青蒿,采用"分段选择法"筛选转基因再生植株。结果对表达GFP基因后发出绿色荧光的转基因植株,采用PCR及PCR产物杂交法,在1棵转基因植株中检测到外源GFP基因,而未检测到内源SS基因。初步证据显示,在转基因青蒿植株中,突变型SS基因已取代野生型SS基因。结论青蒿鲨烯合酶基因打靶已取得初步成功。     

人RANTES基因在转基因青蒿植株中表达的测定

目的 为了增强青蒿的特异药理活性，探讨人β-趋化因子RANTES基因在青蒿细胞中表达的可能性。方法 将克隆的RANTES基因经Ti质粒衍生的双元表达载体pRPKII导入根癌农杆菌LBA4404菌株，通过叶盘共培养法已获得一批表现卡那霉素抗性的转基因青蒿植株。结果 PCR和Southern印迹杂交分析表明，RANTES基因已导入并整合到青蒿基因组中；RT-PCR、Northern印迹、Western印迹杂交结果证实，RANTES基因已在转基因青蒿植株中成功表达。结论 首次报道了RANTES基因在转基因青蒿植株中的表达，为基因工程改造青蒿打下了良好的基础。     

荧光探针法研究青蒿多糖及黄酮对DNA的保护作用

 目的 对比研究湖南、北京、重庆等不同产地14种青蒿中多糖和黄酮类化合物对DNA的保护作用。方法 利用溴化乙锭（EB）作为荧光探针,检测14种青蒿中多糖和黄酮类化合物存在下DNA与EB混合液的荧光积分强度。药物分子与DNA相互作用程度可用作用常数D来表示,根据D的大小研究多糖和黄酮含量对DNA保护作用的影响。结果 经测定,水提液中多糖对DNA的作用强弱顺序为：湖南怀化>北京>山西榆社>湖南种子（忻州种植）>山西忻州室内培育蒿>重庆（忻州种植）>河北阜平>山西定襄南庄>重庆>山西忻州卢野>山西盂县>山西阳曲灰蒿;醇提液中黄酮对DNA的作用强弱顺序为：山西忻州卢野>湖南（忻州种植）>山西忻州室内培育蒿>重庆(忻州种植)>山西忻州野生>山西阳曲灰蒿>山西定襄南庄>重庆>河北阜平>北京>山西榆社>山西忻州铁杆蒿>山西盂县>湖南怀化。青蒿多糖、黄酮与DNA的相互作用呈现一定的量效关系。结论 研究表明：14种青蒿提取液均能与探针DNA/EB作用,但作用程度不同;D值越大,药物与DNA作用越强,反之越弱。
     

大肠杆菌CodA基因表达赋予转基因青蒿负选择表型

目的为了验证CodA基因是否适宜作为有效的青蒿基因打靶负选择标记。方法用PCR法扩增大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶基因CodA,经克隆和测序后插入植物基因表达载体pROK,并导入根癌农杆菌LBA4404(pAL4404)中。以共培养法转化青蒿叶盘,在添加25μg/mL卡那霉素(Kan)的N6培养基上选择青蒿转化愈伤组织并再生绿芽。将Kan抗性转基因青蒿芽转植到含有500μg/mL5-氟胞嘧啶(5-FC)和25μg/mLKan的MS培养基上继续培养2周。结果转基因青蒿芽全部死亡,而未转化青蒿芽仍正常生长,表明导入CodA基因的青蒿细胞已赋予其预期的负选择表型。经RT-PCR检测,转基因青蒿芽显示CodA阳性扩增带,而未转化青蒿芽无此特异扩增带。这一结果显示,CodA基因已在青蒿细胞中转录生成相应的mRNA,从而进一步印证了表型检测结果。结论CodA基因可作为有效的青蒿基因打靶负选择标记。     

黄花蒿悬浮培养细胞对二氢青蒿酸的生物转化研究

目的采用黄花蒿悬浮培养细胞研究二氢青蒿酸(Ⅰ)的生物转化。方法向预培养14 d的黄花蒿细胞悬浮培养体系中加入底物二氢青蒿酸,培养2 d后终止转化。通过TLC和HPLC检测转化产物,利用硅胶、Seph-adex LH-20以及ODS柱色谱分离纯化转化产物,并根据理化数据和波谱技术鉴定转化产物的化学结构,最后利用HPLC考察共培养时间对转化率的影响。结果二氢青蒿酸在黄花蒿培养体系中成功地进行了转化并分离得到两个转化产物:3-α-羟基二氢青蒿酸(Ⅱa)和3-β-羟基二氢青蒿酸(Ⅱb)。两个转化产物的最佳共培养时间均为1d,总的摩尔转化率分别为2.6%(Ⅱa)和15.7%(Ⅱb)。结论本研究首次利用黄花蒿培养细胞生物转化二氢青蒿酸,且得到一对区域特异性的羟基化转化产物。