STAg和霍乱毒素不同程序滴鼻免疫小鼠诱导抗弓形虫作用

目的观察弓形虫可溶性速殖子抗原（soluble tachyzoite antigen，STAg）和霍乱毒素（cholera toxin，CT）佐剂不同程序滴鼻免疫小鼠诱导的抗弓形虫感染能力，确定STAg和CT滴鼻免疫的最佳程序。方法BALB／c小鼠随机分为3组：1次、2次和3次免疫组，用20μgSTAg＋1μgCT／只分别滴鼻免疫1次，2次或3次，前2次间隔2周，末次间隔1周。末次免疫后第14天，用4×10^4个速殖子／只灌胃攻击所有小鼠，观察小鼠健康及死亡情况，攻击后第30天处死，ELISA法检测血清IgG和粪便IgA，计数肝、脑组织内弓形虫速殖子，分离并计数派伊尔结（Peyer＇s patches，PP）和脾淋巴细胞数。结果2次和3次免疫组小鼠存活率明显高于1次免疫组（P〈0．05），肝、脑组织内虫荷显著低于1次免疫组（P〈0．001），血清IgG和粪便IgA高于1次免疫组，PP和脾淋巴细胞数无显著性变化。结论STAg和CT佐剂滴鼻免疫2次或3次能有效诱导小鼠抗弓形虫感染。     

STAg联合ESA鼻内免疫小鼠对弓形虫垂直传播的阻断作用

观察弓形虫可溶性速殖子抗原（Soluble tachyzoite antigen,STAg）与排泄-分泌抗原（Excreted/secreted antigens,ESA）单独或联合鼻内免疫小鼠对弓形虫垂直传播的阻断作用。分别用PBS 20μL和STAg 20μg、ESA 20μg及联合抗原（STAg 10μg＋ESA 10μg）鼻内免疫BALB/c处女鼠2次,间隔2周。末次免疫后第13天处女鼠与雄鼠以2∶1同居。妊娠第8天用弓形虫速殖子（8000个/只）灌胃攻击所有孕鼠。妊娠第18天处死,计算活胎率,并测定孕鼠肝、胎盘和胎鼠脑组织弓形虫抗原和孕鼠脾组织内虫荷,同时测定孕鼠小肠冲洗液SIgA、血清IgG水平。结果表明,ESA组和联合抗原组活胎率显著高于PBS组,STAg组、ESA组和联合抗原组胎盘及胚胎感染率均低于PBS组,联合抗原组最低。孕鼠在弓形虫速殖子攻击后,PBS组明显出现竖毛、倦怠、腹部塌陷等异常表现,感染率为100%,死亡率为22.22%,而STAg组、ESA组和联合抗原组有轻微症状,感染率分别为85.71%、57.14%、57.14%,死亡率分别为16.67%、0%、0%。STAg组、ESA组和联合抗原组脾组织内虫荷均显著低于PBS组,减虫率分别为72.19%、72.29%、78.45%,ESA组和联合抗原组小肠冲洗液特异性SIgA均显著高于PBS组,联合抗原组最高,血清特异性IgG抗体水平差异不显著。由此可见,ESA单独或与STAg联合免疫可诱导孕鼠小肠液高水平SIgA,显著降低脾组织虫荷,显著提高胚胎存活率,表现出明显的垂直传播阻断的作用。     

霍乱毒素佐剂联合弓形虫ESA鼻内免疫小鼠抗弓形虫感染作用

目的 观察霍乱毒素（cholera toxin,CT）佐剂和弓形虫排泄-分泌抗原（ESA）鼻内免疫小鼠诱导的抗弓形虫感染作用。方法 6周龄BALB/c小鼠60只,随机分为3组,每组20只。分别用PBS 20μl、ESA 20μg或CT 1.0μg＋ESA 20μg每只滴鼻免疫2次,间隔2周。末次免疫后14 d,用4×104个弓形虫速殖子每只灌胃攻击所有小鼠,观察小鼠健康及死亡情况。速殖子攻击后30 d,计数肝、脑组织内弓形虫速殖子。结果 CT作为佐剂联合弓形虫ESA滴鼻免疫小鼠的健康状况明显好于PBS组和ESA组,存活率（95%）也显著高于PBS组（55%）。与PBS组相比,CT＋ESA组肝和脑组织内速殖子数分别减少了80.19%（P〈0.001）和78.24%（P〈0.005）。CT作为佐剂联合ESA滴鼻免疫小鼠诱导了高水平的黏膜免疫应答和系统免疫应答。结论 CT作为佐剂联合弓形虫ESA滴鼻免疫小鼠诱导的免疫应答可有效抵抗弓形虫速殖子攻击。     

经口感染弓形虫在小鼠组织内的动态分布

目的观察经口感染弓形虫速殖子在小鼠小肠组织、实质器官内的动态分布。方法BALB／c小鼠96只．随机分为8组，0d组用0．5ml PBS／只灌胃，其余组用RH株弓形虫速殖子1×10^4个灌胃感染，感染后2、4、6、8、10、12、14d处死小鼠，每次处死12只，取十二指肠、空肠、回肠、肝脏、脾、肾、肺、心和脑做组织印片，吉-瑞氏染色，镜检。结果感染后2d在十二指肠、空肠、回肠、肺和心，4d在脾，6d在肾和肝脏发现虫体，脑内未发现虫体。十二指肠、空肠、回肠组织内虫体数量呈上升趋势，第6天达高峰后稍有下降。肝内虫体数量呈上升趋势，第6天最多；脾内虫体数量在6d达峰值后保持较高水平；实验期间肾、肺和心内虫体数量保持较低水平。结论弓形虫经口感染小鼠后2d，小肠组织出现大量速殖子；同时肺和心内有少量速殖子；4d在脾、6d在肾和肝脏发现虫体；速殖子在上述组织内增殖，并形成假包囊，脑内未发现虫体。     

弓形虫单克隆抗体的制备及其保护作用观察

应用杂交瘤技术制备弓形虫单克隆抗体（ＭｃＡｂ）。经克隆化获得２Ｂ１０、２Ｂ１１、２Ｇ８、２Ｄ１２；和１Ｄ１ＭｃＡｂ。用ＩＦＡ鉴定筛选，２Ｂ１０、２Ｂ１１为抗弓形虫整虫的ＭｃＡｂ、２Ｇ８、２Ｄ１２和１Ｄ１为抗弓形虫膜抗原的ＭｃＡｂ。用以上五株ＭｃＡｂ进行小鼠保护性试验：１．感染前２４小时、４８小时分别将５株ＭｃＡｂ稀释液注入小鼠腹腔，以１０４弓形虫速殖子进行攻击感染，结果２Ｂ１０、２Ｂ１１，和２Ｇ８对高毒株弓形虫感染鼠有明显的保护作用；２．将弓形虫速殖子与２Ｂ１０、２Ｂ１１和２Ｇ８孵育后再攻击感染能明显延长感染鼠的平均死亡时间（ＭＴＤ）；３．５株ＭｃＡｂ混合液于感染前２４小时注入小鼠体内及与速殖子孵育后也能明显延长感染鼠的ＭＴＤ。     

重组BCG联合抗痨药物对小鼠结核病治疗作用的实验研究

目的：探讨携带编码人天然颗粒溶素（Granulysin，GLS）和小鼠IL-12基因的重组BCG与抗痨药物对结核分枝杆菌感染的协同治疗效果。方法：将结核分枝杆菌H37Rv感染的BALB／c小鼠40只随机分成4组。感染4周后分别用生理盐水、重组卡介苗（BCG）、INH＋PZA和重组BCG联合INH＋PZA治疗，于第一次治疗后3个月，处死小鼠，检测器官荷菌量、脾淋巴细胞IFN-γ和TNF-α的分泌水平、血清IL-12和IFN-7．肺、脾组织中GLS表达，同时观察小鼠肺、脾组织病理改变情况。结果：重组BCG联合INH＋PZA治疗组肺、脾组织荷菌量（10gCFU／g）比重组BCG和INH＋PZA治疗组显著降低；重组BCG和INH＋PZA治疗组肺、脾组织荷菌量比生理盐水组显著降低。重组BCG组经PPD刺激后IFN-γ和TNF-α分泌水平明显高于其它组。重组BCG联合INH＋PZA治疗组和重组BCG组血清IL-12和IFN-γ水平明显高于生理盐水组。重组BCG组用免疫组化检测到小鼠肺及脾组织中GLS的表达。重组BCG和INH＋PZA组病变轻且局限，生理盐水组肺组织病理改变以渗出为主，病变广泛。重组BCG联合INH＋PZA治疗组肺组织病变最轻。结论：GLS／IL-12重组BCG对小鼠结核病有一定免疫治疗作用；重组BCG联合临床常用的抗痨药可增强抗结核病的疗效。     

免疫组织化学ABC法观察扁桃酸对小鼠急性弓形虫病肝脏病变的作用

目的用免疫组织化学ABC法观察扁桃酸治疗小鼠急性弓形虫病肝脏的病变，探讨扁桃酸对病变肝脏的保护作用。方法扁桃酸200mg／kg，2次／d，口服和静脉注射治疗弓形虫感染小鼠，同时设立乙胺嘧啶及扁桃酸药物对照组，治疗不同时间后取肝脏组织，常规制作病理切片，免疫组织化学ABC法常规染色。结果阳性对照组可见大量肝细胞坏死区，其内可见形态典型的弓形虫速殖子，扁桃酸治疗组仅见少量散在的黄染肝细胞，乙胺嘧啶对照组小鼠肝组织内也仅见少量散在的黄染肝细胞，但肝细胞受到明显的毒性损害。因而扁桃酸能有效地抑制弓形虫速殖子入侵肝细胞，减轻弓形虫速殖子对肝细胞的破坏程度，且扁桃酸对肝细胞的毒副作用极少。结论扁桃酸对弓形虫感染小鼠的肝脏有明显的保护作用。     

IL-12和CpG疫苗佐剂体内对特异性CD4+T细胞免疫应答的影响

目的：观察IL-12和CpG作为疫苗佐剂在体内促进抗原特异性CD4^＋T细胞的分化和IFN-γ的产生异同.方法：自CD4^＋T细胞受体转基因（TCR-Tg）小鼠脾和淋巴结分离CD4^＋T细胞,体外利用CFSE进行标记,然后被动输给相同基因的正常小鼠.经OVA、OVA＋IL-12或OVA＋CpG免疫后,观察抗原特异性CD4^＋T细胞的组织分布,IFN-γ的表达以及与细胞分裂之间的关系.结果：未经OVA抗原免疫的小鼠,抗原特异性CD4^＋T细胞未见有增殖反应.当经OVA抗原免疫后,可见脾和肺组织中细胞增殖;IFN-γ＋细胞在脾脏、淋巴结和肺组织表达的阳性率很低,其范围为0.93%～2.17%.当经OVA＋IL-12免疫后,IL-12促进IFN-γ的表达,阳性率为4.53%～26.79%;而经OVA＋CpG免疫后,CpG只促进淋巴结中IFN-γ的表达（3.84%）.IFN-γ表达的细胞主要为分裂3～5次的细胞.结论：IL-12和CpG作为疫苗佐剂均可促进IFN-γ产生,促进细胞免疫应答.     

CpG ODN佐剂促进HBsAg疫苗诱导小鼠细胞免疫应答的探讨

目的 探讨cpG ODN对重组乙型肝炎表面抗原（HBsAg）诱导小鼠细胞免疫应答的影响。方法HBsAg和HBsAg＋CpG ODN分别肌肉注射免疫Balb／c小鼠后,从淋巴组织（脾和淋巴结）和非淋巴组织（肺）分离淋巴细胞,体外经HBsAg抗原刺激后,利用ELISA检测细胞培养液中IFN-γ的水平,再利用流式细胞仪在单个细胞水平上检测IFN-γ^＋细胞的频率,分析IFN-7^＋细胞亚群。结果对照组和HBsAg免疫组IFN-γ产生的水平很低,当HBsAg加强免疫1～2次后,IFN-γ表达仍然没有明显升高;而CpG ODN＋HBsAg免疫1次或加强免疫后,CpG显著促进HBsAg诱导的IFN-γ产生。进一研究结果表明CpG促进HBsAg诱导淋巴器官和非淋巴器官内CD4^＋和CD8^＋T细胞IFN-γ的表达。结论CpG免疫佐剂不仅能诱导细胞免疫应答同时也诱导体液免疫应答,提示CpG ODN可以用于HBsAg预防和治疗性佐剂。     

弓形虫慢性感染小鼠的系统性细胞免疫应答规律

弓形虫感染可激发宿主产生Th1型免疫反应,因此研究弓形虫疫苗尤其需要关注系统性T细胞免疫应答与保护力的关系。本研究被弓形虫Pru株包囊口服感染BALB／c小鼠,成功建立了弓形虫慢性感染小鼠模型。慢性感染小鼠的脾细胞用弓形虫可溶性抗原刺激后可以产生特异性增殖。进一步分析发现弓形虫特异性CD3＋T、CD4＋T和CD8＋T细胞都可以产生IFN-γ。本研究建立的弓形虫慢性感染小鼠模型可以产生较强的系统性T细胞免疫应答,为弓形虫疫苗研制的效果评价提供重要参考。     

黄芪多糖佐剂对脾脏NK细胞及NKT细胞的作用

目的观察脾脏NK细胞及NKT细胞在黄芪多糖（APS）发挥免疫佐剂功能的作用。方法使用鸡卵白蛋白（OVA）与APS经皮下免疫C57BL/6小鼠3次。末次免疫7～14d,取血清,使用ELISA观察OVA特异性抗体的含量;分离脾脏淋巴细胞,使用流式细胞仪检测NK和NKT细胞的百分比含量;使用PMA和Ionimycin刺激淋巴细胞,使用细胞内细胞因子染色的方法检测IFN-γ和IL-4的分泌情况。结果 APS组小鼠OVA特异性抗体含量明显高于OVA组小鼠（P〈0.05）,但小鼠脾脏内NK和NKT细胞的百分比含量与OVA组和正常小鼠差别不大（P〉0.05）。经PI刺激以后,APS组小鼠脾脏内NK细胞中IL-4＋细胞明显高于OVA组和正常组（P〈0.05）,且IFN-γ＋细胞的比例明显下降（P〈0.05）;虽然经过PI刺激以后,APS组小鼠脾脏内NKT细胞中IL-4＋细胞升高不明显,但是IFN-γ＋细胞的比例明显下降（P〈0.05）。结论 APS可以通过调节NK和NKT细胞的功能来促进体液免疫应答。     

沙眼衣原体主要外膜蛋白核酸疫苗诱导小鼠产生特异性细胞和体液免疫应答

目的构建沙眼衣原体主要外膜蛋白核酸疫苗,并观察其诱导小鼠产生的体液免疫和细胞免疫。方法将核酸疫苗(pcDNA3.1MOMP)或对照空质粒(pcDNA3.1)注射于4～6周龄小鼠后腿股四头肌,每次剂量为100mg。间隔2周加强免疫2次。末次免疫后,ELISA法测定脾淋巴细胞培养上清液中IFNγ及小鼠血清中抗MOMP水平;MTT法测定脾淋巴细胞特异性增殖反应。结果小鼠接种核酸疫苗后,能产生特异性抗体,第3次免疫后抗体最高滴度达1∶1024,培养上清液中IFNγ达(532.0±45.4)pg/mL;实验组小鼠脾淋巴细胞刺激指数为3.94±0.25,其抗原特异性反应明显高于对照组。结论沙眼衣原体主要外膜蛋白核酸疫苗能刺激机体产生特异的细胞免疫和体液免疫。     

IFN-γ上调Th17/IL-17应答介导衣原体呼吸道感染免疫保护

目的 探讨IFN-γ在小鼠沙眼衣原体感染中对Th17/IL-17应答的调节作用.方法 利用沙眼衣原体鼠肺炎株小鼠呼吸道感染模型,用抗鼠IFN-γ单克隆抗体吸入中和肺组织IFN-γ,对照组给予同等剂量的独特型抗体IgG2a,于感染后7 d处死小鼠.免疫酶法检测小鼠肺组织衣原体生长;利用RT-PCR技术检测衣原体感染小鼠肺组织中Th17相关因子IL-17及其上游因子IL-23 mRNA的表达;细胞内细胞因子染色检测衣原体感染小鼠脾脏IL-17-CD4+T细胞的扩增.结果 与对照组相比,IFN-γ抗体中和小鼠有严重的疾病状态,包括明显的体重下降、肺组织更高的衣原体负荷和肺组织更严重的病理损伤;肺组织IL-17和IL-23 mRNA的表达水平显著降低;脾脏IL-17-CD4+T细胞百分率也显著降低.结论 小鼠衣原体感染中,IFN-γ通过上调Th17/IL-17应答起保护作用.

Abstract：

Objective To investigate the regulation of IFN-γ to Th17 response in Chlamydia muridarum (Cm) lung infection in mice. Methods A murine model of pneumonia induced by intranasal inoculation of Cm was used for this study. Anti-mouse IFN-γ McAbs were used to neutralize endogenous IFN-γfollowing Cm lung infection. Control group received the same dose of isotype antibody (IgG2a). Mice were sacrificed at day 7 postinfection. Chlamydial growth in the lung was assessed by immunoenzyme technique.IL-17 and IL-23 mRNA expression in the lung was assayed by RT-PCR and the proliferation of IL-17 + CD4 +T cells in the spleen was assayed by intracellular cytokine staining. Results IFN-γ-neutralized mice exhibited serious disease course, include greater body weight loss, higher organism growth and much more severe pathological changes in the lung compared with control mice. The mRNA expression of IL-17 and IL-23 in the lung and the proliferation of IL-17 + CD4 + T cells in the spleen significantly decreased in the IL-17- neutralized mice. Conclusion IFN-γ was protective in Cm lung infection through up-regulating the antigen specific Th17 responses.     

比较同一复方中用红芪与用黄芪对免疫抑制小鼠淋巴细胞和Th1/Th2型细胞因子的影响

目的比较研究红芪替换玉屏风口服液和复芪止汗颗粒中的黄芪后对免疫抑制小鼠淋巴细胞亚群和Th1/Th2型细胞因子的调节作用。方法通过给小鼠腹腔注射免疫抑制剂环磷酰胺致成免疫功能低下模型,以相同剂量的红芪替换玉屏风口服液和复芪止汗颗粒中的黄芪灌胃进行体内拮抗实验,测定胸腺指数、脾脏指数、淋巴细胞亚群、血清IL-4、IFN-γ的含量。结果含黄芪和含红芪的玉屏风和复芪止汗组均能拮抗被环磷酰胺抑制的小鼠胸腺指数、脾脏指数和CD19+、CD3+、CD4+和CD8+淋巴细胞百分比以及血清IL-4、IFN-γ的含量。其中含红芪的玉屏风组的部分作用优于含黄芪组。结论含黄芪和含红芪的玉屏风和复芪止汗组均能拮抗环磷酰胺诱导的脾脏中T、B淋巴细胞亚群的失衡,恢复T、B淋巴细胞亚群的正常比例,同时含红芪的玉屏风组更能使其向正常比值回归。     

Ameliorated course of glucose-6-phosphate isomerase (G6PI)-induced arthritis in IFN-γ receptor knockout mice exposes an arthritis-promoting role of IFN-γ

The absence of IFN-γ signaling leads to an increased inflammatory response in many murine models of autoimmune diseases induced by a CFA-assisted immunization schedule. We investigated the role of endogenous IFN-γ in arthritis induced by immunization with glucose-6-phosphate isomerase (G6PI) in CFA in DBA/1 mice. Surprisingly, and in contrast to our previous findings in collagen-induced arthritis (CIA), G6PI-induced arthritis was found to be reduced in IFN-γ receptor-deficient (IFN-γR KO) mice, demonstrating a proinflammatory role for IFN-γ in this model. Milder disease in IFN-γR KO mice was associated with less vigorous innate and adaptive immune responses early (day 9) after immunization: less proliferation of myeloid cells in the spleen, less osteoclast formation, less G6PI-reactive Th cells (as measured by ex vivo stimulation and flow cytometry and by in vivo skin reactivity to G6PI) and lower G6PI-specific immunoglobulin serum levels. Surprisingly, on day 21, despite continued milder disease in IFN-γR KO mice, their Th cell responses were no longer diminished but augmented as compared to wild-type mice, and their numbers of immature myeloid splenocytes were also more increased. These data reveal that IFN-γ signaling is critical for the induction of the early immune responses which trigger G6PI-induced arthritis. The strikingly different clinical consequences of absent IFN-γ signaling in G6PI-induced arthritis compared with the very similarly induced CIA emphasize that the role of a single cytokine in experimentally induced arthritis depends critically on the very nature of the inciting (auto)antigen and in particular on the kinetics of the disease manifestation elicited by the antigen.     

ROLES OF IFN-γ ON STAGE CONVERSION OF AN OBLIGATE INTRACELLULAR PROTOZOAN PARASITE,Toxoplasma Gondii

IFN-γ downregulates the stage conversion of Toxoplasma gondii (T. gondii), from bradyzoites to tachyzoites, and the expression of heat shock protein 70 (HSP70) of T. gondii ( T.g. HSP70) by tachyzoites. T.g. HSP70 has been shown to downregulate NO release from macrophages and also to induce auto-HSP70 antibody formation and IL-10 secretion by VH11-JH1 B-1 cells, resulting in the suppression of host defense responses to T. gondii infection. A novel category of virulent tachyzoite stage of T. gondii expressing T.g. HSP70 (virulent tachyzoite), which indirectly manifests its pathogenicity by downregulating host defense responses, has been proposed.     

免疫复合物型增效乙型肝炎疫苗细胞免疫检测方法的建立

目的 建立免疫复合型增效乙型肝炎疫苗细胞免疫检测方法并与常规乙型肝炎疫苗进行比较。方法增效乙型肝炎疫苗肌内免疫BALB/c小鼠,Elispot方法检测小鼠脾脏淋巴细胞分泌IFN-γ的细胞频数（SFC）,优化实验条件：免疫剂量、检测时间和特异性刺激物及刺激浓度。同时将增效乙型肝炎疫苗与常规乙型肝炎疫苗进行比较。结果5μg免疫组IFN-γ SFC明显高于2μg免疫组,初次免疫后3周IFN-γ SFC开始下降,多肽刺激IFN-γ SFC高于蛋白刺激,多肽浓度为2μg即可充分刺激斑点形成;增效乙肝疫苗免疫组IFN-γ SFC高于常规乙型肝炎疫苗组。结论 初步建立了免疫复合型增效乙型肝炎疫苗细胞免疫检测方法并证明其重复性良好,其细胞免疫水平高于常规乙型肝炎疫苗。