携带人Oct4和EGFP基因慢病毒表达载体构建

目的构建携带人Oct4和EGFP基因的慢病毒表达载体pFUOGW。方法SacⅡ线性化pLenti-EF1a-Oct4-IRES-EGFP,回收片段并补平SacⅡ切口,接着BamHⅠ酶切该片段,回收2.565kb片段而获连接用Oct4-IRES-EGFP;EcoRⅠ线性化pFUGW,回收并补平EcoRⅠ切口,然后BamHⅠ酶切该片段,回收9.174kb片段获连接用载体片段,最后使用DNA连接试剂盒（TaKaRa）中的SolutionⅠ将其与连接用Oct4-IRES-EGFP连接,连接产物转化,次日挑选单菌落,提取质粒并行酶切鉴定。所构建载体命名为pFUOGW。获pFUOGW后,按Invitrogen公司推荐的标准程序进行慢病毒包装和确认慢病毒是否成功生产;携带Oct4和EGFP基因的慢病毒感染293FT细胞和鼻咽癌细胞株C666-1、CNE1和6-10B以建立相应病毒感染体系。结果酶切鉴定证实成功构建了pFUOGW,按标准程序生产的携带Oct4和EGFP基因的慢病毒上清高效率感染鼻咽癌细胞株C666-1、CNE1和6-10B。结论成功构建携带人Oct4和EGFP基因的慢病毒表达载体pFUOGW,为相关后续的研究打下良好的基础。     

携带人c-Myc和EGFP基因慢病毒表达载体的构建

目的构建携带人c-Myc和EGFP基因的慢病毒表达载体pFUMGW。方法 XhoI线性化pLenti-EF1a-c-Myc-IRES-EGFP,回收片段并补平XhoI,接着BamHI酶切该片段,回收2722bp片段而获连接用c-Myc-IRES-EGFP;EcoRI线性化pFUGW,回收并补平EcoRI,然后BamHI酶切该片段,回收9174bp片段获连接用载体片段,最后使用DNA连接试剂盒（TaKaRa）中的SolutionI将其与连接用c-Myc-IRES-EGFP连接,连接产物转化,次日挑选单菌落,提取质粒并行酶切鉴定。所构建载体命名为pFUMGW。获pFUMGW后,按Invitrogen公司推荐的标准程序进行慢病毒包装和确认慢病毒是否成功生产;携带c-Myc和EGFP基因的慢病毒感染人胚肾细胞株293、肿瘤细胞株CNE1和C666以建立相应的病毒感染体系。结果酶切证实成功构建了pFUMGW,按标准程序生产的携带c-Myc和EGFP基因的慢病毒上清高效率感染293、CNE1和C666。结论成功构建携带人c-Myc和EGFP基因的慢病毒表达载体pFUMGW,为相关后续研究打下了良好基础。     

携带人Kif4和EGFP基因慢病毒表达载体构建

目的:构建携带人Kruppel-like factor4(Kif4)和增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因的慢病毒表达载体pFUKGW。方法:Xho I线性化pLenti-EF1a-Kif4-IRES-EGFP,回收片段并补平XhoI酶切位点,接着BamH I酶切该片段,回收2.842kb片段而获连接用Kif4-IRES-EGFP;EcoR I线性化pFUGW,回收并补平EcoR I酶切位点,然后BamH I酶切该片段,回收9.174kb片段获连接用载体片段,最后使用DNA连接试剂盒中的Solution I将其与连接用Kif4-IRES-EGFP连接,连接产物转化,次日挑选单菌落,提取质粒并行酶切鉴定。所构建载体命名为pFUKGW。获pFUKGW后,按Invitrogen公司推荐的标准程序进行慢病毒包装和确认慢病毒是否成功生产;将携带Kif4和EGFP基因的慢病毒感染人肿瘤细胞株CNE1、C666和SW620以建立相应病毒感染体系。结果:酶切证实成功构建了pFUKGW,按标准程序生产的携带Kif4和EGFP基因的慢病毒上清高效率感染CNE1、C666和SW620。结论:本实验成功构建携带人Kif4和EGFP基因的慢病毒表达载体pFUKGW,为开展肿瘤细胞重编程研究打下了良好基础。     

携带人Sox2和EGFP基因慢病毒表达载体构建

目的构建携带人Sox2和EGFP基因的慢病毒表达载体pFUSGW。方法XhoⅠ线性化pLenti-EF1a-Sox2-IRES-EGFP,回收片段并补平XhoⅠ切口,接着BamHⅠ酶切该片段,回收2.356kb片段而获连接用Sox2-IRES-EGFP;EcoRⅠ线性化pFUGW,回收并补平EcoRⅠ切口,然后BamHⅠ酶切该片段,回收9.174kb片段获连接用载体片段,最后使用DNA连接试剂盒（TaKaRa）中的SolutionⅠ将其与连接用Sox2-IRES-EGFP连接,连接产物转化,次日挑选单菌落,提取质粒并行酶切鉴定。所构建载体命名为pFUSGW。获pFUSGW后,按Invitrogen公司推荐的标准程序进行慢病毒包装和确认慢病毒是否成功生产;携带Sox2和EGFP基因的慢病毒感染小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）、人胚肺成纤维细胞（HLFs）和人神经胶质瘤细胞（U87）以建立相应病毒感染体系。结果酶切证实成功构建了pFUSGW,按标准程序生产的携带Sox2和EGFP基因的慢病毒上清高效率感染MEFs、HLFs及U87。结论成功构建携带人Sox2和EGFP基因的慢病毒表达载体pFUSGW,为相关后续的研究打下了良好的基础。     

构建携带人Sox2和EGFP基因慢病毒表达载体

目的为了研究宫颈癌的发病机制,构建携带人Sox2基因和EGFP基因的慢病毒表达载体。方法使用限制性内切酶Sac II酶切p Lenti-EF1a-Sox2-IRES-EGFP质粒,回收线性片段并补平Sac II切口,然后Xba I酶切该线性片段,回收3.432kb目的片段便获连接用Sox2-IRES-EGFP片段;Eco RI线性化p FUGW,然后用BKL试剂盒将酶切产物补平,然后继续用Xba I酶切已线性化的p FUGW(Eco R I酶切位点已补平),获得9.122kb和819bp片段,回收9.122kb目的片段以获得连接用载体片段。最后使用DNA连接试剂盒(Ta Ka Ra)中的Solution I将连接用Sox2一IRES-EGFP(3.432kb)和连接用载体片段(9.122kb)连接,连接产物转化,次日挑选单菌落,提取质粒行酶切鉴定。所构建新载体命名为p FUSGW。获p FUSGW载体后,按Invitrogen公司所推荐的标准程序进行慢病毒包装,然后确认慢病毒是否成功生产;使用携带Sox2和EGFP基因的慢病毒感染293FT细胞和宫颈癌细胞株CC-2、CC-3以建立相应的病毒感染体系。结果经酶切鉴定证实成功构建p FUSGW,按标准程序生产的携带Sox2和EGFP基因的慢病毒上清可高效率感染宫颈癌细胞株CC-2、CC-3。结论成功构建了携带人Sox2和EGFP基因的慢病毒表达载体p FUSGW,为宫颈癌发病机制的相关后续研究奠定良好的基础。     

携人PTHLH基因慢病毒表达载体的构建

目的构建携带人甲状旁腺相关激素（PTHLH）基因的慢病毒表达载体pGC-FU/PTHLH。方法酶切载体pGC-FU,根据人PTHLH基因合成特定引物,扩增目的基因片段,将其克隆到pGC-FU质粒（含EGFP基因）上,菌落PCR鉴定及测序分析重组载体,使用Lipofectamine 2000诱导转染pGC-FU、pHelper1.0和pHelper2.0载体三质粒进入293T细胞包装慢病毒,并用带PTHLH的慢病毒感染293T细胞和鼻咽癌CEN1细胞确认慢病毒包装是否成功。结果菌液PCR产物琼脂糖凝胶电泳鉴定显示,与理论预计值阳性转化子735bp,阴性转化子198bp基本相吻合;PCR鉴定阳性的克隆进行测序和比对分析,结果完全匹配,进一步鉴定载体构建成功。分别将质粒包装系统共转染293T细胞,包装产生空白对照慢病毒（pGC-FU）和过表达PTHLH的慢病毒（pGC-FU/PTHLH）;或用携带PTHLH和EGFP基因的病毒上清感染CNE1细胞,48h后,倒置荧光显微镜下观察293T和CNE1细胞,均可见绿色荧光,转染成功。结论成功构建携人PTHLH基因慢病毒表达载体,为进一步研究PTHLH基因在鼻咽癌转移中的作用及鼻咽癌发病分子机制奠定了基础。     

KIAA1199基因重组慢病毒载体的构建及在人胃肿瘤细胞MKN28中的表达

目的构建KIAA1199基因过表达的重组慢病毒载体,感染人胃癌细胞MKN28并使KIAA1199基因有效表达。方法将慢病毒载体GV367和KIAA1199基因序列用Age I和Nhe I双酶切、连接、筛选及测序获得重组慢病毒质粒GV367-KIAA1199。将测序正确的GV367-KIAA1199重组载体和辅助质粒Help1.0和Help2.0用Lipofectamine2000共转染293T细胞,得到重组慢病毒载体LV-KIAA1199。予荧光稀释法和药物筛选法测定重组慢病毒的感染滴度。以携带空白基因片段的慢病毒载体LV-NC为病毒对照组。将LV-KIAA1199和LV-NC以相同的病毒感染复数(MOI)分别感染人胃癌细胞株MKN28;荧光显微镜观察EGFP在细胞中的表达;实时定量PCR检测KIAA1199的m RNA在细胞中的表达水平。结果重组慢病毒载体LV-KIAA1199构建成功,LV-KIAA1199感染胃癌细胞后,荧光显微镜下可见细胞中呈现绿色荧光;KIAA1199的m RNA的表达均显著高于对照病毒组。结论重组慢病毒载体LV-KIAA1199可携带KIAA1199基因在人胃癌细胞株MKN28中进行有效过表达。     

携带Oct4、Klf4、Sox2、c-myc和EGFP基因小鼠肿瘤细胞株的建立

目的构建稳定携带Oct4、Klf4、Sox2、c-myc（以下简称为OKSM）和增强型绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein,EGFP）基因的小鼠肿瘤细胞株。方法将载体pLentG-KOSM用NotI、XbaI线性化,并进行聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）,以鉴定其结构。按Invitrogen公司推荐的标准程序进行慢病毒包装和确认慢病毒是否成功生产;携带OKSM和EGFP基因的慢病毒感染小鼠肝癌细胞（Hep1-6）、小鼠乳腺癌细胞（4T1）和小鼠肺癌细胞（LLC）,以建立相应病毒感染体系。结果 pLentG-KOSM确实含有OKSM4种基因,按标准程序生产的携带OKSM和EGFP基因的慢病毒上清高效率感染Hep1-6、4T1及LLC,成功建立稳定携带OKSM和EGFP基因的小鼠肿瘤细胞株。结论成功构建携带OKSM和EGFP基因的Hep1-6、4T1、LLC细胞株,为相关的后续研究打下了良好基础。     

重组Ad-Cp-CDglyTK双自杀基因腺病毒载体构建及体外抑制鼻咽癌细胞的实验研究

目的：构建含EB病毒Cp启动子的CDglyTK双自杀基因靶向腺病毒载体 Ad-Cp-CDglyTK，探讨Cp启动子能否特异性调控自杀基因在转染鼻咽癌细胞中表达及靶向性治疗鼻咽癌的可行性。方法：采用pDC316穿梭质粒系统，高保真PCR扩增tk、 cd、 Cp等基因序列，采用定向克隆方法构建含Cp启动子的双自杀基因pDC316-CP-CDglyTK重组质粒，经DNA测序、酶切法鉴定所构建质粒，在293细胞中进行重组腺病毒Ad-Cp-CDglyTK包装、扩增、纯化与病毒滴度测定，体外转染鼻咽癌细胞株CNE1与正常鼻咽NP69细胞株，RT-PCR法检测转染细胞中CDglyTK基因的表达，MTT法观察Ad-Cp-CDglyTK/GCV+5-FC系统对CNE1细胞株的体外杀伤作用。结果： 经DNA测序、限制性酶切法分析显示pDC316-Cp-CDglyTK含完整正确的tk、cd、Cp基因序列，在293细胞中包装扩增后病毒滴度为5.6×1012 TCID50/L，体外转染鼻咽癌CNE1细胞株与正常鼻咽NP69细胞株后，采用RT-PCR法从CNE1细胞株总RNA中扩出Cp片段，而NP69细胞株未检测到相应基因mRNA表达，MTT结果显示经前体药物处理转染后CNE1细胞株与NP69细胞株，5-FC+GCV联合用药较单一前体药物对CNE1细胞具有更强的抑制作用（P＜0.05），联合用药对NP69细胞株未见明显杀伤作用。结论： Cp启动子可以特异性调控CDglyTK融合自杀基因在鼻咽癌细胞株(CNE1)中表达，融合自杀基因/前药系统较单一基因对鼻咽癌细胞具有更强的杀伤作用。     

构建携带重组人胰岛素基因慢病毒表达载体及其病毒包装

背景:腺病毒载体作为脂肪组织工程转基因载体,在应用中存在转导细胞免疫排斥及炎症反应等问题。应用慢病毒作为载体转染干细胞尤其是应用含胰岛素基因的慢病毒载体转染干细胞可避免腺病毒载体的诸多问题。目的:实验拟构建含有人重组胰岛素(insulin)与增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)基因慢病毒表达载体pLenti6.3-insulin-IRES-EGFP,并进行病毒颗粒包装。方法:应用聚合酶链反应方法获得目的基因,在目的基因上、下游分别加上BamHⅠ,AscⅠ两个酶切位点,进行T载体克隆,转化入感受态DH5α细胞中,通过筛选获得重组质粒。用限制性内切酶酶切,将目的基因片段和pLenti6.3-IRES-EGFP载体连接,转化入感受态DH5α细胞中,通过筛选获得慢病毒表达载体pLenti6.3-insulin-IRES-EGFP,并进行测序。抽提慢病毒载体,转染293T细胞,包装病毒,测定病毒滴度。结果与结论:通过聚合酶链反应获得长度为347bp带有BamHⅠ和AscⅠ序列的目的基因。pMD18-T载体和慢病毒表达载体pLenti6.3-IRES-EGFP连接,慢病毒表达载体pLenti6.3-insulin-IRES-EGFP构建与预期相匹配,成功包装慢病毒颗粒。     

慢病毒介导的外源基因体外投递系统的建立

目的针对不同哺乳类细胞建立相应的慢病毒体外感染体系，以建立慢病毒介导的外源基因体外投递系统。方法按Invitrogen公司推荐的标准程序进行慢病毒（携带EGFP基因）包装（脂质体介导的瞬时转染）、超速离心浓缩和保存等，随后用病毒上清或浓缩后的病毒感染293FT细胞，24—48h后荧光显微镜下观察是否见绿色荧光以证实慢病毒是否成功生产；将携带EGFP基因的病毒上清或浓缩后的病毒分别加入内含293FF细胞、小鼠ES细胞、小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）或小鼠睾丸生殖细胞的培养板孔内，感染6—12h后，用相应培养基替换感染液，数天后荧光显微镜下观察是否见绿色荧光以证实慢病毒是否成功感染不同哺乳类细胞。结果按标准程序生产的携带EGFP基因慢病毒（病毒上清或浓缩后的病毒）成功高效率感染293FF细胞、MEFs或小鼠睾丸生殖细胞；用浓缩后的病毒（携带EGFP基因）感染小鼠ES细胞，亦可获得EGFP阳性的ES细胞克隆。结论熟练掌握了慢病毒包装、浓缩及鉴定等技术，同时针对不同哺乳类细胞建立了相应的慢病毒介导的外源基因体外传递系统，这些为相关后续研究打下了良好的基础。     

人类白细胞抗原-G5慢病毒表达载体构建与病毒包装

目的:构建人类白细胞抗原G5(HLA-G5)的表达载体,并进行慢病毒包装,为进一步研究HLA-G5功能提供基础工具。方法:人工合成HLA-G5全长序列经测序正确后,定向接入真核表达载体pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP,转化入大肠杆菌,酶切鉴定并测序正确后进行慢病毒包装和滴度测定。结果:经琼脂糖凝胶电泳鉴定、PCR鉴定及测序,HLA-G5表达质粒质量合格,序列比对与设计序列符合率100%,HLA-G5慢病毒滴度测定为7.06×108。结论:成功地构建了HLA-G5表达载体并完成了慢病毒包装,为今后的研究工作提供了基础工具。     

动脉内皮细胞中TIE2启动CREG真核表达质粒pTIE2-CREG-EGFP-N1的表达

背景：血管内皮发生的分子机制是细胞及基因替代治疗的首要前提。 目的：构建一种通过血管内皮细胞特异蛋白TIE2启动子来启动表达的E1A激活基因阻遏子(cellular repressor of E1A-stimulated genes, CREG)和增强绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescence protein, EGFP)融合的真核表达质粒。 方法：根据GenBank中公布的TIE2基因的启动子序列,人工合成TIE2启动子DNA序列,经AseⅠ和NheⅠ双酶切后,亚克隆入表达质粒pEGFP-N1中构建pTIE2-EGFP-N1。同时,用BamHⅠ和EcoRⅠ 双酶切pcDNA3.1 myc-His/hCREG质粒得到CREG基因,亚克隆入质粒pTIE2-EGFP-N1中构建pTIE2-CREG-EGFP-N1,酶切鉴定。应用脂质体法将该质粒转染至体外培养的小鼠动脉内皮细胞,荧光显微镜下观察EGFP的表达;Western blot检测CREG蛋白的表达。 结果与结论：经酶切鉴定证实实验构建的pTIE2-CREG-EGFP-N1质粒正确;体外转染48 h,荧光显微镜下可见EGFP的表达,Western blot检测到CREG蛋白的表达。说明实验成功构建了pTIE2-CREG-EGFP-N1重组质粒,其可携带目的基因在小鼠动脉内皮细胞中有效表达。     

构建内皮脂肪酶慢病毒表达载体及在HepG2细胞中的表达

背景：内皮脂肪酶主要由血管内皮细胞分泌并作用于血管内皮,内皮脂肪酶可能在动脉粥样硬化等疾病的发生发展中起重要作用,但目前机制尚不明确。 目的：构建内皮脂肪酶慢病毒表达载体,产毒感染HepG2细胞,评价重组载体提高内皮脂肪酶表达的效果。 方法：RT-PCR调取大鼠内皮脂肪酶基因,SpeⅠ、Eco RⅠ双酶切后,将内皮脂肪酶基因插入慢病毒载体PRRL.sin.CMV.eGFP中构建内皮脂肪酶过表达慢病毒表达载体PRRL.sin.CMV.EL-eGFP;使用PRRL.sin.CMV.EL-eGFP质粒及病毒包装系统于293FT细胞中包装产毒,用于感染HepG2细胞,RT-PCR及Western blot检测感染后HepG2细胞内皮脂肪酶mRNA及蛋白的表达。 结果与结论：酶切及测序鉴定证实内皮脂肪酶基因成功插入PRRL.sin.CMV.EL-eGFP慢病毒表达质粒;转染PRRL.sin.CMV.EL-eGFP慢病毒表达质粒后,HepG2细胞中可见内皮脂肪酶mRNA及蛋白的表达。说明重组PRRL.sin.CMV.EL-eGFP慢病毒可感染HepG2细胞,并使其表达内皮脂肪酶mRNA和蛋白。