人UbcH10及其siRNA真核表达载体的构建与表达

目的：构建以人泛素结合酶UbcH10基因为基础的真核表达质粒pcDNA3.1（UbcH10）及其siRNA表达载体pGPU6/GFP/Neo（siRNA-UbcH10）,并在结肠癌细胞LOVO中表达与鉴定。方法：提取组织总RNA,通过RT-PCR扩增出UbcH10基因,克隆到真核表达载体pcDNA3.1的多克隆位点中,构建UbcH10的真核表达载体。通过siRNA设计软件选取UbcH10基因的siRNA片段合成构建表达载体pGPU6/GFP/Neo（siRNA-UbcH10）。然后采用脂质体转染法将其分别转染LOVO细胞,用RT-PCR在RNA水平和Western Blot在蛋白水平检测其在真核细胞中的表达。结果：测序结果显示克隆UbcH10基因片段序列完全正确;重组质粒转染LO-VO细胞后,检测到pcDNA3.1（UbcH10）转染组UbcH10表达增强,而pGPU6/GFP/Neo（siRNA-UbcH10）转染组UbcH10表达减弱。结论：成功构建真核表达质粒pcDNA3.1（UbcH10）及其siRNA表达载体pGPU6/GFP/Neo（siRNA-UbcH10）,并在真核细胞中能有效表达,为今后进一步研究UbcH10的功能和作用机制奠定了基础。     

UbcH10在肝癌中的表达及其与预后的关系

目的 探讨UbcH10在肝癌中的临床病理特征及预后意义。方法 采用RT-PCR技术对我院2017年9月~12月收治的30例不同分化程度肝癌患者肿瘤组织中的UbcH10表达进行检测,通过Kaplan-Meier和 Cox回归评估UbcH10表达与患者存活率的相关性。结果 低分化肝癌组织中UbcH10 mRNA表达EI评分为（0.82±0.32）分,高于高分化癌组织的（0.33±0.06）分,差异有统计学意义（P＜0.05）;不同组织学分化程度和淋巴结转移患者的UbcH10表达比较,差异有统计学意义（P＜0.05）;高UbcH10表达和低UbcH10表达的肝癌患者的存活时间不同,差异有统计学意义（P＜0.05）。结论 UbcH10可能在肿瘤发展中起积极作用,可作为肝癌患者预后不良的独立预测因子。     

人RUVBL2真核表达载体的构建及其在HeLa细胞中的表达

目的:构建带有绿色荧光蛋白的RUVBL2真核表达载体pEGFP-N1-RUVBL2,并鉴定其在HeLa细胞中的表达。方法:以pGADT7-RUVBL2质粒为模板,PCR扩增RUVBL2基因,首先克隆至T载体中,进一步亚克隆至p-EGFP-N1,并对重组表达载体进行酶切及测序鉴定。采用脂质体转染法将重组质粒瞬时转染HeLa细胞系,应用荧光显微镜观察绿色荧光融合蛋白的表达,并用Western blot法检测RUVBL2-GFP融合蛋白的表达。结果:经限制性酶切鉴定及测序分析证实pEGFP-N1-RUVBL2载体序列正确;荧光显微镜下可见转染的HeLa细胞中有绿色荧光蛋白的表达,Western blot法证实转染细胞中能表达RUVBL2-GFP融合蛋白。结论:pEGFP-N1-RU-VBL2表达载体构建成功,并在HeLa细胞内成功表达。     

UbcH10在肝癌组织中的表达及临床意义

目的 探讨UbcH10在肝癌组织中的表达及临床意义。方法 收集2018年2月~10月在本院就诊并行手术切除的肝癌患者肿瘤组织标本30例,并以相应癌旁正常组织（距离肿瘤组织＞5 cm）为参照。采用免疫组化分析肝癌组织和癌旁正常肝组织中的UbcH10蛋白的表达量以及肝癌UbcH10蛋白表达与临床病理特征的关系。结果 有93.33%的肝癌组织中显示UbcH10表达,仅有6.67%的癌旁正常肝组织显示UbcH10表达,肝癌组织中UbcH10表达高于癌旁正常肝组织,差异有统计学意义（P＜0.05）;其中高分化肝癌组织UbcH10表达低于低分化肝癌组织,差异有统计学意义（P＜0.05）。不同年龄、性别患者中UbcH10表达比较,差异无统计学意义（P＞0.05）;不同肿瘤大小、组织学分化程度、淋巴结是否转移患者中UbcH10表达比较,差异有统计学意义（P＜0.05）。结论 UbcH10在肝癌患者肝组织中过度表达,并与肿瘤大小、分化程度及淋巴结转移相关。UbcH10可作为肝癌患者肿瘤治疗的预后标志物和潜在分子靶点。     

过表达泛素偶联酶E2C对293T细胞增殖的影响

目的:构建稳定过表达人类泛素偶联酶E2C(UBE2C)的293T人胚肾细胞株,初步探讨其对293T细胞增殖的影响。方法:采用脂质体法将已成功构建的pcDNA3.1(-)/UBE2C真核表达质粒转入293T人胚肾细胞株中,随后经G418筛选4周,得到阳性克隆细胞株;用Western blot技术检测并鉴定UBE2C基因在293T细胞中的表达情况;用MTT法检测UBE2C对293T细胞增殖的影响。结果:Western blot检测显示,转pcDNA3.1(-)/UBE2C组293T细胞的UBE2C蛋白表达水平明显高于转pcDNA3.1(-)组(P<0.01)。MTT法检测结果显示转pcDNA3.1(-)/UBE2C组293T细胞的增殖速度明显快于转pcDNA3.1(-)组(P<0.01)。结论:成功建立稳定过表达UBE2C的293T细胞株,过表达UBE2C可促进293T细胞的增殖。     

实时荧光定量PCR检测结直肠癌UbcH10基因的表达

目的：通过检测UbcH10 mRNA在结直肠癌中的表达,探讨UbcH10作为结直肠癌诊断标志物的可能性。方法：采用Trizol提取组织总RNA,RT-PCR获得UbcH10 cDNA,实时荧光定量PCR检测45例结直肠癌患者肿瘤组织与相应癌旁正常组织中UbcH10 mRNA的丰度。结果：在所有肿瘤组织样本中UbcH10 mRNA的相对表达量与其自身的癌旁正常组织样本中的相对表达量相比明显升高,平均表达水平是正常组织的10倍以上（0.0802±0.0907vs0.0079±0.0088,P〈0.01）,其中超过20倍的占37.78%（17/45）。结论：UbcH10基因在结直肠癌患者肿瘤组织中过度表达,可作为结直肠癌诊断的潜在肿瘤标志物及结直肠癌基因治疗的新靶点。     

真核表达载体pIRES2-EGFP-PDLIM2的构建及在EJ细胞中的表达

背景：核因子κB在肿瘤生成过程中起重要作用,PDLIM2基因可以介导终止核因子κB的活性,解除核因子κB对肿瘤细胞的凋亡抑制作用。 目的：克隆人PDLIM2全长基因,构建pIRES2-EGFP-PDLIM2真核表达载体。 方法：采用反转录-聚合酶链反应从新鲜膀胱组织总RNA中克隆PDLIM2全长基因,与经Bam HI、Xho Ⅰ相同双酶切的pIRES2-EGFP质粒载体连接,构建重组质粒pIRES2-EGFP-PDLIM2,经酶切及测序鉴定重组质粒中PDLIM2基因的完整性和忠实性。荧光显微镜下观察重组质粒转染的EJ细胞GFP报告基因表达强度,并对转染细胞PDLIM2的表达进行RT-PCR检测。 结果与结论：经酶切和测序证实重组质粒构建正确,并在转染的EJ细胞中获得PDLIM2的高效表达。表明用反转录-聚合酶链反应方法成功从膀胱组织中克隆出PDLIM2全长基因,成功构建pIRES2-EGFP-PDLIM2真核表达载体。     

肝癌相关抗原HAb18G真核表达载体的构建及表达

目的 在真核细胞中高效表达肝癌相关抗原ＨＡｂ１８Ｇ。方法 构建含有肝癌相关抗原Ｈｂ１８Ｇ基因的真核表达载体,并经限制性酶切及部分序列分析证明插入是否正确。用阳离子脂质体介导转染ＣＯＳ－７细胞和ＣＨＯ细胞,并分别进行瞬时及稳定表达;通过间接免疫荧光染色和流式细胞仪检测蛋白的表达情况。结果 成功地构建了真核表达载体ｐｃＤＮＡ－３／ＨＡｂ１８Ｇ,并经限制性酶切及部分序列分析证明基因插入正确。间接免疫荧光     

preS2反义RNA肝癌特异性表达载体的构建及相关特性研究

目的 构建针对preS2基因的肝癌特异性反义RNA表达载体，并对其特异性和有效性进行研究。方法 PCR扩增preS2(3203—340)基因，克隆至含甲胎蛋白启动子的EB病毒表达载体pEBAF，构建反义RNA表达载体pEBAF-as—preS2。脂质体转染肝癌细胞和ECV304细胞，3d后Northern blot检测preS2 mRNA的表达，ELISA检测HBV抗原，荧光定量PCR检测HBV DNA。结果序列分析表明，pEBAF-as-preS2构建成功，Northern blot证实反义RNA仅在AFP阳性的肝癌细胞中表达，pEBAF-as-preS2转染3d后，可显著抑制HepG2．2．15细胞HBV复制和抗原表达，对HBsAg、HBeAg表达的抑制率分别为33．4％和41．5％；对HBV复制抑制率为86％。结论 反义RNA表达载体pEBAF-as-preS2仅在肝癌细胞中特异表达、并可有效抑制HBV，有良好的开发应用前景。     

pcDNA3.1-Smac真核表达载体的构建及表达

目的:构建人的smac基因真核表达载体pcDNA3.1-Smac,并在肺腺癌A549细胞中表达.方法:采用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术从人睾丸组织中扩增到smac基因,构建重组真核表达载体pcDNA3.1-Smac.酶切及测序鉴定重组质粒正确后,脂质体介导转染至肺腺癌A549细胞中.采用RT-PCR、Western blot法检测外源基因smac的表达,MTT法检测细胞生长抑制率.结果:PCR扩增片段与预期片段大小相符,插入片段测序结果与GenBank公布的一致,表明人smac基因克隆及真核表达载体peDNA3.1-Smac构建成功.在mRNA水平和蛋白水平,转染后的细胞中外源基因smac表达均明显增加.转染smac质粒72 h后,细胞的生长抑制率较转染空质粒组显著增加.结论:成功构建重组真核表达载体peDNA3.1-Smac,并在肺癌A549细胞中进行了表达;验证了转染后对肺癌细胞生长有抑制作用.     

人α-防御素-1(α-HNP-1)基因真核表达载体的构建及在大鼠骨髓间充质干细胞中的转染表达

目的构建人α-防御素-1(α-HNP-1)基因的真核表达载体,并且转染大鼠骨髓间充质干细胞。方法提取人外周血粒细胞中的总RNA,反转录为cDNA作为模板,采用PCR的方法扩增得到人α-防御素-1(α-HNP-1)的基因片断。将扩增产物连接入pGEM-T载体,转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,蓝白筛选,对PCR及酶切鉴定含有目的片断的克隆进行测序。经测序证实无误后,将获得的pGEM-T-HNP-1重组质粒上的α-HNP-1基因亚克隆到真核表达载体pcDNA3.1(-)上,构建HNP-1的真核表达载体pcDNA3.1-HNP-1。将真核表达载体pcDNA3.1-HNP-1用脂质体法转染原代大鼠骨髓间充质干细胞,用免疫组化法检测α-HNP-1的表达。结果获得预期大小为303bp的RT-PCR产物;经PCR、酶切鉴定和DNA测序分析证实重组质粒载体pcDNA3.1-HNP-1构建正确;免疫组化法显示转染细胞呈阳性反应。结论成功构建HNP-1基因的真核表达载体,并且在大鼠骨髓间充质干细胞中能成功表达。     

Salusin-a基因真核表达载体的构建及在HEK293细胞中的表达

目的:研究增强型绿色荧光蛋白真核表达载体Salusin-a(pEG-FP-Salusin-a)的构建及在人胚胎肾细胞系293细胞(HEK293)中的表达。方法:提取人单核细胞系THP-1细胞Salusin-a的mRNA,逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)扩增Salusin-a基因,克隆入pEGFP-N3载体,双酶切、菌落PCR及测序鉴定pEGFP-Salusin-a质粒。用脂质体转染pEGFP-Salusin-a入HEK293细胞,分为转染细胞组、质粒对照组和空白对照组,检测分析各组荧光蛋白和Salusin-a基因的表达。结果:成功构建pEGFP-Salusin-a质粒,并转染HEK293,细胞转染效率86%,转染细胞组和质粒对照组绿色荧光蛋白的表达明显高于空白对照组(P0.05);转染细胞组Salusin-amRNA的表达明显高于质粒对照组和空白对照组(P0.05)。结论:重组pEGFP-Salusin-a质粒能转染HEK293细胞并表达Salusin-a,为Salusin-a基因功能的进一步研究提供了实验基础。     

人隔蛋白7的真核表达载体的构建及表达

目的构建人隔蛋白7(SEPT7,hCDC10/SEPT7)的表达载体并对U251人脑恶性胶质瘤细胞系进行转染且检测其表达。方法RT-PCR方法扩增SEPT7cDNA片段,并将扩增的片段插入pCDNA3真核表达载体,构建成含SEPT7cDNA的重组载体pCDNA3/SEPT7,以脂质体介导该质粒转染人脑恶性胶质瘤细胞系U251,应用RT-PCR和免疫荧光染色鉴定转染细胞中hCDC10/SEPT7的表达。用流式细胞术对转染前后的U251细胞进行细胞周期分析。结果成功构建含SEPT7cDNA的重组载体pCDNA3/SEPT7,并使其稳定转染U251细胞,在转染的细胞中,证实有SEPT7mRNA表达上调。细胞周期检测结果G0/G1期细胞增多,SPF降低。结论成功构建SEPT7表达载体,并在人脑恶性胶质瘤细胞系获得表达,延迟细胞周期进展。     

GILZ真核表达载体的构建及其表达定位

目的:克隆、构建HA标签的糖皮质激素诱导亮氨酸拉链蛋白GILZ表达载体,观察其在细胞中表达与定位,为研究GILZ在脂肪细胞分化中的作用提供工具。 方法：采用逆转录PCR（RT-PCR）法从C3H10T1/2细胞中扩增带有HA标签的GILZ cDNA编码区,并将其重组于真核表达载体pcDNA3中。经酶切、序列鉴定分析后,将该重组质粒通过Lipofectamine 2000脂质体和CaCl2方法,分别转染C3H10T1/2和293T细胞,用HA抗体免疫荧光和免疫印迹法检测GILZ在细胞内的表达、分布及分子量大小。 结果：HA-GILZ表达载体经酶切鉴定和测序分析确认构建成功,并在C3H10T1/2和293T细胞中获得了高效表达。在荧光显微镜下,GILZ主要表达于细胞质内,分子量约20 kD。 结论：成功构建HA-GILZ基因表达载体并表达于C3H10T1/2细胞质中,为GILZ的功能研究奠定了基础。     

AcAPc2自剪切融合蛋白表达载体pTWIN1-AcAPc2的构建和表达

为表达和获取具有抗凝血功能的犬钩虫抗凝血肽（AcAPc2），采用搭桥PCR方法合成犬钩虫抗凝血肽全长双链cDNA序列，AcAPc2cDNA全序列连入表达载体pTWIN1上构建成具有蛋白自剪切功能的表达载体pTWIN1-AcAPc2，将阳性重组子转入表达型大肠杆菌E．coli ER2566进行表达。表达的融合蛋白AcAPc2-intein2-CBD为可溶性蛋白，且融合蛋白约占菌体总蛋白的30．1％，经蛋白质印迹分析确定表达产物是具有CBD蛋白的特异性融合蛋白。融合蛋白AcAPc2-intein2-CBD经几丁质柱高效亲和纯化，并经β-巯基乙醇诱导的独特的在柱自剪切后，得到目的蛋白AcAPc2，经SDS—PAGE分析在21KD处呈现目的条带，所得的可溶性AcAPc2分子量符合其天然活性的二聚体形式。对AcAPc2表达和纯化工艺上的改进，方便了AcAPc2的获取，AcAPc2氨基酸序列的生物信息学分析初步阐明了AcAPc2的结构和功能的关系，为进一步研究AcAPc2的抗凝血机制及其作为抗凝血药的临床应用奠定了基础。     

SARS-N蛋白真核表达质粒的构建及其免疫原性

目的　选取SARS CoVN蛋白编码基因为研究对象 ,构建真核表达质粒PVAX1/N ,并在体外转染COS 7细胞的基础上免疫Balb/c小鼠 ,测定血清总IgG水平及诱发的细胞免疫反应。方法　用RT PCR方法从感染SARS病毒的VeroE6细胞中扩增得到约 12 6 9bp的片段 ,构建重组真核表达质粒PVAX1/N ,转染COS 7细胞后 ,用细胞免疫化学方法鉴定目的蛋白的表达 ;免疫Balb/c小鼠后 ,用ELISA方法测血清总IgG水平 ,MTS/PES比色法测定脾T淋巴细胞增殖 ,ELISPOT法测定CD8+ T淋巴细胞的活性。结果　构建的重组质粒经酶切及测序鉴定 ,与GenBank中登录的序列完全一致 ;细胞免疫化学鉴定结果显示 :重组质粒可在COS 7细胞中表达有免疫原性的SARS CoVN蛋白 ;免疫小鼠血清中检测到较高滴度的抗体 ;T淋巴细胞增殖及CTL活性均明显优于对照组 (P <0 .0 1)。结论　成功构建真核表达质粒PVAX1/SARS CoVN ,并能诱导免疫小鼠产生特异性的抗SARS抗体及特异性的细胞免疫反应     

IFITM3真核表达载体的构建和细胞内定位研究

目的构建人干扰素诱导的跨膜蛋白3(IFITM3)的真核表达载体并观察其表达产物的细胞内定位,以研究IFITM3的蛋白功能及作用机制。方法提取人外周血淋巴细胞mRNA,行RT-PCR扩增IFITM3编码序列并经琼脂糖凝胶电泳鉴定片段大小,PCR产物及真核表达载体pEGFP-C2经酶切、连接、转化入Top10菌株进行筛选和扩增,重组的pEGFP-C2-IFITM3载体用酶切及DNA测序鉴定其插入序列的正确性,进而转染该重组真核表达载体进入sy5y细胞,倒置荧光共聚焦显微镜观察融合蛋白在细胞内定位。结果琼脂糖凝胶电泳显示经RT-PCR的扩增产物与IFITM3编码区的实际长度相吻合,重组入绿色荧光载体pEGFP-C2的pEGFP-C2-IFITM3经酶切和测序显示实际连入的DNA片段大小、序列及读码框均正确。经真核表达后,重组蛋白定位于细胞膜和在细胞内存在颗粒样聚集。结论成功构建IFITM3的真核表达载体,该载体表达的IFITM3融合蛋白在细胞内定位清晰,为后续的IFITM3功能研究奠定了基础。