人IgE Cε3-Cε4蛋白的表达、复性、纯化及初步鉴定

目的：获得IgE Fc段的Cε3-Cε4重组蛋白（E34）方法：以RT—PCR技术扩增IgE=Cε3-Cε4（E34）rDNA片段．构建原核表达载体。以其转化大肠杆菌BL-21，诱导表达主要以包涵体形式存在的目的蛋白。经复性、纯化后，用Western blot和ELISA法初步鉴定所获E34蛋白与抗人IgE mAb的结合能力结果：对克隆的E34基因片段测序表明，与已报道的序列相一致。获得的可溶性E34蛋白经SDS—PAGE鉴定显示，其相对分子质量（Mr）同预期的结果相一致。Western blot和ELISA法进一步证实，E34蛋白能够被鼠抗IgE mAb特异性识别。结论：成功地构建了pET28a（＋）-E34表达载体，并获得能被抗IgEmAb特异性识别的可溶性蛋白E34，为下一步的工作打下了基础。     

人IgE分子Fc段受体结合区的表达、纯化及功能鉴定

利用哺乳动物细胞表达、纯化具有生物学功能的人IgE Fc段与受体结合的功能区(Fcε2-4)。以CRL8033细胞株为模板,PCR扩增人IgE Fcε2-4的cDNA并构建到真核表达载体pcDNA3.1(+)中,脂质体转染CHO-K1细胞并以G418加压筛选。利用有限稀释法、Dot-blot及FACS筛选出高表达目的蛋白的稳定细胞株并进行扩增。CHO-K1培养上清经偶联抗IgE抗体(Omalizumab)的亲和层析柱分离纯化后,聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)鉴定纯度,并采用表面等离子共振(SPR)法对该蛋白与其抗体的亲和力进行检测。结果表明,SDS-PAGE显示最终获得了纯度高于95%的人IgE Fcε2-4蛋白,呈二聚体状态,分子量约78kD,SPR检测结果显示,该蛋白与Omalizumab抗体特异性高亲和力结合(kD值约3.8nmol/L)。提示,本实验获得了结构及糖基化修饰正确的人IgE Fcε2-4结构域,为进一步研究其功能及探索新的抗体药物奠定了基础。     

人IgE重链恒定区CH4亚基的克隆、原核表达及纯化

血清中高水平的IgE是哮喘、过敏性鼻炎、慢性荨麻疹等过敏性疾病的标志,而IgE与效应细胞上的IgE高亲和力受体(EcεRI)结合则是这些Ⅰ型变态反应的关键步骤[1].很长时间以来,找到抑制它们结合从而治疗过敏性疾病的方法,一直是过敏性疾病研究的重点.从已有的研究得知,IgE与EcεRI结合的关键部位是其重链恒定区的CH2-CH4,也就是Ige的Fc段,其中3个亚基的作用各有不同[2].本研究利用分子克隆技术,从过敏性个体的外周血淋巴细胞中克隆出中国汉族人IgECH4的cDNA,构建了相应的质粒表达载体,原核表达CH4蛋白,并鉴定其活性,为进一步研究CH4蛋白在lgE与EcεRI结合过程中的作用提供物质基础.     

大鼠重组IgE Fc区CH2-3的原核表达及活性研究

目的 研究大鼠IgE的Fc区CH2-3的生物学活性。方法 构建大鼠IgE的Fc区CH2-3的原核表达质粒pBAD／gⅢA／Ch2-3，并转化入TOP10中，阿拉伯糖诱导表达、周质腔抽提、Ni-NTA金属鳌合柱纯化获得大鼠IgE的Fc区CH2-3，细胞及动物水平检测蛋白质生物学活性。结果 原核系统表达出大鼠IgE的Fc区CH2-3，它能够阻断OVA激发的RBL-2H3的脱颗粒反应，阻断被动皮肤实验。结论 大鼠IgE的Fc区CH2-3能够封闭IgE高亲和力受体，阻断过敏反应。     

人IgE重链恒定区2～4区蛋白的真核表达、纯化及其相互作用分子捕获

目的真核表达、纯化人IgE重链恒定区2～4区(IgECε2-4)蛋白,利用表面等离子体共振技术(SPR)捕获其相互作用蛋白。方法构建3个含不同信号肽序列的IgECε2-4重组真核表达载体,分别瞬时转染HEK293FT悬浮细胞,优化选用表达量最高的重组质粒进行大量瞬转表达,镍柱亲和层析纯化。免疫荧光技术鉴定重组蛋白与KU812细胞表面IgE受体FcεRⅠ的结合,采用SPR技术捕捉人血清中与IgECε2-4相互作用的蛋白。结果含信号肽3(SP3)的重组质粒表达量最高,表达量约为6.2 mg/L;亲和纯化获得高纯度的人IgECε2-4蛋白;免疫荧光技术鉴定显示重组蛋白IgECε2-4可与KU812细胞表面受体结合。通过SPR技术捕获到人血清中39种可能与IgECε2-4结合的蛋白。结论获得纯化的重组蛋白IgECε2-4,IgECε2-4能与KU812细胞表面FcεR1α受体结合,靶标垂钓结果显示IgECε2-4能与人血清中的39种蛋白存在相互作用或有间接结合作用。     

IgE低亲和力受体基因的克隆、表达及初步鉴定

目的利用基因重组的方法建立IgE低亲和力受体（FcεRⅡ）基因的原核表达系统。方法用RT-PCR方法从过敏性疾病病人外周血淋巴细胞扩增FcεRⅡcDNA基因,并将其克隆到原核表达载体pGEX-4T-1上,构建原核表达载体FcεRⅡ-pGEX-4T-1,将重组质粒转化到大肠杆菌Rosetta,诱导表达FcεRⅡ蛋白,通过割胶回收纯化,并用Western blot检测FcεRⅡ的表达。结果测序表明所扩增FcεRⅡcDNA基因,与已报道的序列一致。获得的重组蛋白经Western blot鉴定可以和人IgE特异性结合。结论成功构建了FcεRⅡ-pGEX-4T-1表达载体,获得了能和人IgE特异性结合的重组蛋白,为下一步FcεRⅡ单克隆抗体的制备及应用研究打下了基础。     

真核细胞表达质粒pCMV4增强hCGβ-C3d3DNA疫苗的表达效率和免疫效力

目的：比较以pCMV4和pcDNA3为载体的hCGβ-C3d3DNA疫苗的表达效率和免疫效力。方法：分别构建pcDNA3-hCGβ-C3d3、pCaMV4-hCGβ-C3d3真核细胞表达质粒，并转染真核细胞瞬时表达系统COS-7细胞，以分析体外表达效率。抽提与纯化pcDNA3、pcDNA3-hCGβ-C3d3、pCMV4-hCGβ-C3d3质粒。对6周龄BLAB／C小鼠行DNA免疫。于末次免疫后6周采血，用间接ELISA分析实验动物外周血抗hCGβ抗体效价。结果：对COS-7体外表达效率分析，由pCMV4介导的hCGβ-C3d3表达效率明显高于pcDNA3。动物DNA免疫结果，pCMV4-hCGβ-C3d3刺激动物机体产生的免疫应答强度及免疫效果显著高于pcDNA3-hCGβ-C3d3。结论：pCMV4真核表达质粒hCGβ-C3d3体外表达效率及动物DNA免疫效力均显著高于pcDNA3真核表达质粒。     

TLR4胞外段在大肠杆菌中的可溶性表达、纯化及鉴定

目的：构建谷胱甘肽转硫酶-TLR4融合蛋白表达载体，并研究其编码的蛋白质在大肠杆菌中的表达。方法：利用PCR从含TLR4全长cDNA序列的质粒中扩增其胞外段，约1800bp，然后将其克隆入pMD18-T载体中。测序确证后重组入谷胱甘肽转硫酶融合表达载体pGEX-4T-1中，并用IPTG诱导其在大肠杆菌中表达。结果：PCR扩增的TLR4胞外区基因序列与GenBank数据库中的序列一致。重组质粒经酶切鉴定及测序证实，TLR4基因已正确插入到pGEX-4T-1中。重组表达质粒转化感受态大肠杆菌HBl01后用IPTG诱导，获得Mr92 000的GST-TLR4融合蛋白；37℃，O.2mmol／L IPTG诱导4h，SDS-PAGE电泳后，经薄层凝胶扫描分析该融合蛋白占菌体蛋白总量34．25％，部分以包涵体存在，可溶性蛋白约占27．84％；亲和层析纯化后纯度大于90％。Western-blot证实GST-TLR4融合蛋白能与TLR4单抗特异性结合。结论：成功地构建融合蛋白表达载体pGEX-TLR4，并在大肠杆菌中获得有效表达，获得了纯度大于90％的可溶性GSI-TLR4融合蛋白，为进一步研究其功能及制备TLR4单克隆抗体奠定了基础。     

9.1C3/LAIR-1的真核表达、纯化及单克隆抗体的制备和鉴定

目的 表达并纯化9.1C3/LAIR-1胞膜外区与人IgCl Fc段的融合蛋白，轩针对9.1C3/LAIR-1胞膜外区的单克隆抗体（mAb)。方法 构建真核表达载体pIg/3C-9.1C3/LAIR-1,表达并纯化9.1C3/LAIR-1－Fe融合蛋白。以9.1C3/LAIR-1－Fc融合蛋白免疫BALB／c小鼠，制备。以间接免疫荧光染色和流式细胞术鉴定mAb的特异性，以竞争结合实验鉴定mAb识别LAIR－1的表位。结果表达并经9.1C3/LAIR-1－hIgFc融合蛋白，以其免疫BALB／c小鼠，获得1株针对9.1C3/LAIR-1胞膜外区的mAb 4H7。4H7对HL－60细胞和经9.1C3/LAIR-1 cDNA转染的COS7 的表位识别，与已报道的抗9.1C3 mAb体不同。 结论 成功地构建了9.1C3/LAIR-1胞膜外区基因的真核表达载体，并表达纯化了9.1C3/LAIR-1－hIgFc融合蛋白。获得一株针对9.1C3/LAIR-12胞膜外区的mAb，为进一步研究9.1C3/LAIR-1分子的2结构和功能提供了新的手段。     

人ATG4B的表达及蛋白纯化和鉴定

目的构建含His标签的自噬相关蛋白4同源物B(ATG4B)重组质粒以得到His-ATG4B蛋白,初步鉴定其生物学活性。方法利用PCR技术从人乳腺文库中扩增出ATG4B基因的编码序列,插入p ET-28a(+)载体中得到重组质粒,经酶切鉴定后转化Rossate菌,挑选小量诱导出的His-ATG4B菌液进行His-ATG4B蛋白的纯化,SDS-PAGE和Western blot法检测His-ATG4B蛋白的纯化效果,GST pull-down技术对蛋白生物学功能进行鉴定。结果用PCR技术从人乳腺文库中扩增得到大小约1100 bp的目的片段,插入p ET-28a(+)载体中构建出His-ATG4B重组质粒,酶切鉴定及测序结果均表明His-ATG4B质粒构建成功;转化Rossate菌并小量诱导,表达鉴定成功后纯化蛋白,得到相对分子质量(Mr)约为47 000的His-ATG4B蛋白,且SDS-PAGE检测蛋白纯化效果较好;GST pull-down实验证实His-ATG4B蛋白可以和LC3B蛋白在体外相互作用,生物学活性良好。结论本实验成功得到His-ATG4B蛋白,为研究ATG4B在自噬中的作用机制奠定实验基础。     

重组人IL—4 cDNA及纯化蛋白的鉴定

构建了和且人白细胞介素４（ｒｈＩＬ－４）表达质粒ｐＢＶ２２０／ｒｈＩＬ－４ａ，并在Ｅ．ｃｏｌｉ中高效表达。经核苷酸序列分析，测出ｒｈＩＬ－４ ｃＤＮＡ全序列与国外发表的ｈＩＬ－４ ｃＤＮＡ序列完全相同。其纯化蛋白产品经分子量测定，Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹分析，等电点分析，Ｎ－端氨基酸序列测定，比活性等测定证明，均符合ｒｈＩＬ－４。     

人乳头瘤病毒16型E4蛋白表达、纯化及抗血清制备

目的 表达人乳头瘤病毒16型(HPV16) E4蛋白,并制备小鼠抗HPV16 E4血清.方法 将HPV16 E4基因克隆入pQE30,重组质粒pQE30-HPV 16E4经鉴定后转化大肠埃希菌M15(PREP4),诱导表达并鉴定表达产物.因纯化、变性和复性方法,制备可溶性HPV16 E4蛋白.免疫Bal B/C小鼠制备抗血清,检测小鼠IFN-γ水平、CD4/CD8比值和抗血清滴度变化.结果 酶切和测序结果表明pQE30-HPV16F4构建成功.表达分子相对分子量(Mr)为10 000,Western blot法证明具有较高特异性.小鼠抗血清效价升高,CD4/CD8无升高,小鼠γ干扰素(IFN-γ)无升高.结论 成功制备可溶性HPV16 E4蛋白和小鼠抗HPV16 E4高效价的抗血清.     

幽门螺杆菌cag4蛋白的原核表达、纯化及鉴定

目的:构建幽门螺杆菌cag4蛋白的原核重组体系,表达、纯化融合蛋白。方法:利用PCR技术从幽门螺杆菌NCTC11637中克隆了cag4基因;经T-A克隆,酶切鉴定,构建了原核表达载体pET-28a-cag4;经测序鉴定正确后,转化进入大肠埃希菌BL21(DE3)进行异源表达。利用IPTG体外诱导后,经SDS-PAGE和Western bolt鉴定目的蛋白表达后,采用Ni2+-NTA柱在变性条件下纯化目的蛋白,并对重组蛋白进行透析复性处理。将SDS煮沸法获得的溶壁微球菌肽聚糖掺入SDS-PAGE作为底物,进行酶谱分析。结果:成功扩增了cag4基因基因;重组质粒在大肠埃希菌BL21(DE3)中诱导表达出pET-28a-cag4融合蛋白;优化了pET-28a-cag4原核表达体系的最适条件;Western bolt分析结果显示表达的基因重组蛋白与目的蛋白相符;酶谱分析显示其具有明显的肽聚糖水解活性。结论:幽门螺杆菌cag4蛋白具有溶菌糖基转移酶活性。     

MAGE-D4a融合蛋白的原核表达、纯化及鉴定

目的:构建肿瘤相关抗原MAGE-D4a的原核重组体系,表达、纯化融合蛋白。方法:PCR法从胶质瘤组织cDNA中扩增MAGE-D4a基因全长编码区,连接入原核表达载体pMAL-c2,筛选、鉴定阳性克隆并测序。将重组质粒转化至大肠杆菌Rosetta(DE3)诱导表达,表达产物经AmyloseResin亲和层析分离纯化,并且对纯化的融合蛋白进行质谱鉴定。结果:成功扩增了MAGE-D4a基因;重组质粒在Rosetta大肠杆菌中诱导表达出MBP/MAGE-D4a融合蛋白;优化了MAGE-D4a原核表达体系的最适条件;蛋白质谱分析结果显示表达的基因重组蛋白与目的蛋白相符。结论:获得了高效表达、可溶性的MAGE-D4a重组蛋白,为抗体的制备及血清学分析奠定了基础。     

人GST-Cdc25C融合蛋白的原核表达、纯化及功能初步检测

目的:构建人Cdc25C基因原核表达载体,获得纯化的GST-Cdc25C融合蛋白,并对其功能进行初步检测。方法:用PCR方法从乳腺文库中扩增Cdc25C基因编码序列,将其正确插入pGEX-KG载体,重组质粒转化大肠杆菌Ros-sate表达后,用GST-Sepharose 4B珠子纯化融合蛋白,并用SDS-PAGE和Western blot方法检测融合蛋白表达,通过GSTpull-down技术检测纯化蛋白与已知结合蛋白Chk2的相互作用。结果:构建得到Cdc25C基因的原核表达载体,双酶切鉴定得到与预期片段大小相符的外源基因插入片段,经测序与目的序列完全一致;在Rossate菌中诱导表达出相对分子质量(Mr)约为80 000的目的蛋白,经SDS-PAGE和Western blot检测,融合蛋白成功表达,并纯化得到GST-Cdc25C融合蛋白,GST pull-down检测证实GST-Cdc25C蛋白可以和已知相互作用蛋白Chk2相互作用。结论:成功克隆Cdc25C基因,并获得了活性良好的GST-Cdc25C蛋白,为进一步研究细胞周期蛋白调控机制奠定了实验基础。     

人GPC3基因真核表达载体的构建及重组蛋白表达纯化

目的:人磷脂酰肌醇蛋白3是肝癌的诊断标志物和潜在治疗靶点。本研究目的在于获得足量的GPC3蛋白用于结构、功能及应用研究。方法:通过RT-PCR从人胎肝中克隆GPC3编码cDNA,利用Xho I和Xba I酶切位点,将GPC3ORF编码基因插入毕赤酵母表达载体pPICZ A中,构建真核表达质粒pPICZ A-GPC3。以该表达质粒转染毕赤酵母菌株GS115,在含有Zeocin的YPD平板上进行筛选。然后使用HRP标记的山羊抗人IgG在醋酸-硝酸纤维素双层膜上进行Dot blot筛选。对筛选获得的菌株进行诱导表达,表达上清经SDS-PAGE和Western blot检测。结果:筛选获得的阳性菌株诱导表达上清SDS-PAGE结果表明在预期位置观察到GPC3重组蛋白条带,且该蛋白条带与抗GPC3单克隆抗体(mAb)孵育后呈现特异性反应。工程菌株经高密度培养后,发酵上清中重组GPC3表达量约5 mg/L,进而通过阳离子交换层析从发酵上清中纯化了重组蛋白。结论:利用毕赤酵母表达并纯化了重组人GPC3蛋白,为进一步研究GPC3的结构和功能奠定了基础。     

可溶性HLA-G1重链分子的构建、表达及纯化

目的：获取原核表达的可溶性HLA-G1重链分子(1neavy chain of soluble HIA-G1，SHLA-G1-hc)，为进一步构建可溶性HIA-G1单体分子奠定基础。方法：应用引物点突变技术，RT-PCR扩增去信号肽的可溶性HLA-G1重链分子的cDNA序列，构建表达载体pET22b／s HLA-G1-hc，导人大肠杆菌BL21(DE3)Plys，IPTG诱导sHLA-G1-hc-6(his融合蛋白表达，提取包涵体蛋白，溶解后经Ni-NTA亲和层析纯化，透析后浓缩保存。SDS-PAGE、Westem blot鉴定目的蛋白的表达和纯化。结果：克隆基因序列符合重链基因特征；表达产物以包涵体形式为主，表达量占菌体总蛋白的20％；纯化后证明表达产物具有较高纯度达到95％。结论：成功构建可溶性HIA-G1重链分子原核表达载体，为阐明可溶性HIA-G1的功能奠定基础。     

重组人淋巴毒素α缺失体的表达、纯化及鉴定

目的 :构建重组人淋巴毒素α缺失体 (rhLT αΔN2 7)的原核表达载体 ,在大肠杆菌中进行表达 ,建立纯化rhLT αΔN2 7的工艺。方法 :从Jurkat细胞中提取总RNA ,用RT PCR扩增rhLT αΔN2 7基因 ,并插入原核表达载体 pET 2 3b中 ,转化大肠杆菌BL2 1(DE3) ,用IPTG诱导rhLT αΔN2 7表达。包涵体经洗涤和复性后 ,用DEAESepharoseFF和Phenyl SepharoseFF纯化。结果 :rhLT αΔN2 7以包涵体的形式表达 ,表达量占菌体总蛋白的 30 %以上。纯化后 ,rhLT αΔN2 7的纯度达 99% ,比活性高于 8× 10 7U/mg。纯化样品的相对分子质量 (Mr)、等电点 ,以及N端序列等其他理化性质均同预计的结果相符。结论 :构建了rhLT αΔN2 7的表达载体 ,并成功地在大肠杆菌中进行了表达 ,建立了rhLT αΔN2 7的纯化工艺     

大鼠IgE依赖组胺释放因子重组蛋白纯化效果的优化

目的提高大鼠IgE依赖组胺释放因子（rHRF）的可溶性表达水平，改善其亲和层析纯化效果，为深入研究该重组蛋白的生物学功能奠定基础。方法选择多克隆酶切位点BamH Ⅰ和Xho Ⅰ,将rHRF完整编码区基因从原有的pET-30a—rHRF重组质粒亚克隆至pET-28a载体，构建重组质粒pET-28a-rHRF;转化大肠杆菌BL21（DE3）后，通过改变IPTG浓度（0．1～1．0mmol／L），调节诱导表达温度（25～370C）和时间（1-5h），筛选能够提高rHRF可溶性表达水平的条件；同时改进亲和层析纯化的条件，提高纯化效果。结果成功构建重组质粒pET-28a-rHRF，不同IPTG浓度、诱导温度和时间对重组蛋白的可溶性表达水平无明显影响。但是．与pET-30a-rHRF转化菌相比，pET-28a—rHRF转化菌所表达的重组蛋白因其N端和C端均带有6xhis标签．增强了目的蛋白与树脂的结合力，而使亲和层析纯化效果（重组蛋白的浓度和纯度）显著提高。结论rHRF重组蛋白的可溶性表达水平不受IPTG浓度、诱导表达温度和时间的影响，但是可溶性重组蛋白两端均携带6xhis标签可使亲和层析纯化效果显著提高，从而有利于获得足量rHRF用于进一步的生物学功能研究。