应用SRY原位杂交技术检测肝脏干细胞移植肝内种植情况

背景：以往干细胞种植后的定植示踪技术有磁探针标记、荧光示踪标记法、慢病毒感染荧光标记法及性别交叉Y染色体原位杂交检测法,各有优缺点。 目的：应用SRY原位杂交技术观察受体来源肝脏干细胞(肝卵圆细胞)在移植肝内的定植情况。 方法：二袖套法建立大鼠原位肝移植模型。供体为雌性DA大鼠,受体为雌性Lewis大鼠,设受体大鼠60只,肝卵圆细胞为Lewis大鼠来源的雄性细胞,移植中供肝种植肝卵圆细胞悬液。应用SRY原位杂交染色技术观察受体来源的雄性肝卵圆细胞在雌性移植肝内的定植情况。 结果与结论：经门静脉和肝动脉注射种植的肝卵圆细胞及其分化细胞主要定植在移植肝内中央静脉及汇管区周围,应用SRY原位杂交染色技术可以有效观察到受体来源肝脏干细胞在移植肝内的定植情况。     

供肝NK细胞对肝移植免疫反应中NF-κB 活性和IL-15表达的影响

 目的：观察大鼠移植肝组织内和外周血白细胞介素15（IL-15）的表达水平及脾组织内核因子κB(NF-κB)的表达活性变化,探讨供肝NK细胞减轻肝移植术后急性排斥反应的机制。方法：Lewis大鼠为肝移植供体,BN大鼠为受体,改良“二袖套”法建立大鼠肝移植模型。应用［60Co］射线照射清除供体免疫细胞和经门静脉回输供肝NK细胞等技术,实验设立3组。A组: 急性排斥组;B组: 单纯［60Co］照射排斥组;C组: ［60Co］照射+供肝NK细胞门静脉回输排斥组。移植术后第1、3、7天收集受鼠外周血清,ELISA法检测IL-15分泌水平,同时切取移植肝行病理学检查,Western blotting法检测移植肝组织IL-15蛋白的表达,凝胶电泳迁移实验（EMSA）检测受鼠脾组织NF-κB表达活性。另外每组各设亚组观察移植后大鼠自然生存时间。结果：B组术后大鼠自然存活时间较A、C组明显缩短,术后发生急性排斥反应程度较A、C组严重;术后第3、7天,3组受鼠外周血IL-15水平均较第1天时显著升高;移植术后第3、7天,B组大鼠血清IL-15 浓度均显著高于A、C组;术后第3、7天,移植肝组织中B组IL-15表达也显著高于A、C组,受鼠脾组织中B组NF-κB表达活性亦显著高于A、C组。结论：IL-15可能作为肝移植急性排斥反应的监测指标,对急性排斥反应的早期诊断和移植物的预后估计具有临床指导意义;供肝NK细胞可能通过下调NF-κB的表达活性来调节IL-15的水平,进而减轻肝移植术后急性排斥反应。     

放射损伤对于移植的骨髓间充质干细胞在受体大鼠不同器官中植入的影响

目的： 探讨放射损伤对于骨髓间充质干细胞（MSCs）移植后在受体大鼠不同器官中植入的影响以及可能的机制。方法：采用DNA缺口末端标记法(TUNEL)检测正常对照组和单纯放射组大鼠心脏、肾脏、肝脏、肺脏的细胞凋亡率。应用密度梯度离心法结合贴壁法提取雄性大鼠骨髓MSCs，培养后把MSCs移植到［60COγ］照射和未经照射的雌性大鼠体内，通过PCR和Y染色体荧光原位杂交（Y- FISH）示踪雄性大鼠MSCs在雌性大鼠体内的分布情况。结果：照射后大鼠心脏、肾脏、肝脏、肺脏细胞凋亡率显著高于对照组。PCR结果显示照射后移植MSCs的大鼠心脏、肾脏、肝脏、肺脏和外周血中可以扩增出Sry基因的DNA序列，而且Y- FISH显示照射后移植MSCs的大鼠在心脏、肾脏、肝脏、肺脏中可发现Y染色体阳性的细胞。但是未经照射行MSCs移植的大鼠在上述器官中未发现Y染色体阳性的细胞。结论：全身放射促进组织细胞的凋亡，并导致移植的MSCs在受体大鼠心脏、肾脏、肝脏和肺脏的植入。     

荧光染料CFSE作为细胞标记的特性研究

探讨荧光染料CFSE在作为细胞标记时的特性。方法 :应用激光共聚焦扫描显微术 ,观察CFSE在细胞中的准确定位。利用MTT比色法测定CFSE标记的细胞及未标记细胞的增殖情况 ;通过细胞计数和流式细胞仪 (FCM) ,测定细胞在不加任何刺激及诱导的情况下细胞数及平均荧光强度的变化趋势。结果 :在共聚焦显微镜下 ,可见CFSE标记的细胞的细胞膜、细胞核及细胞质中都带有绿色荧光 ,以胞核荧光最强。利用MTT比色法测定标记及未标记细胞的A值无显著差异。连续 6d记录的细胞数与FCM测定的平均荧光强度呈负相关。结论 :CFSE可作为细胞的标记物 ,用于细胞移植的体内检测、细胞增殖试验及细胞分裂周期的估算等研究     

移植骨髓间充质干细胞减轻脂多糖诱导的小鼠急性肺损伤

目的 观察移植骨髓间充质干细胞 （MSCs） 对脂多糖 （LPS） 诱导小鼠急性肺损伤 （ALI）的治疗修复作用。方法 全骨髓培养法培养小鼠骨髓MSCs;细胞免疫化学染色鉴定MSCs特异表面标记;小鼠咽后壁吸入LPS制造小鼠肺损伤;尾静脉注射引入MSCs;称重计算肺水肿指数;肺组织切片HE染色观察组织病理改变;ELISA检测肺泡灌洗液和肺组织匀浆中IL-1β含量;Brdu（5-Bromo-2-Deoxyuridine）标记供体MSCs,免疫组织化学染色及双染色观察移植细胞的迁移和分化状态。结果 培养的MSCs细胞表面标记CD44阳性,而造血系表面标记CD34阴性。吸入LPS后,小鼠出现典型的肺损伤病理改变,肺水肿指数和肺组织匀浆IL-1β含量明显增加。标记的MSCs移植入同种异体的肺损伤小鼠,其肺部出现标记的MSCs,并表达上皮细胞标志抗原-细胞角蛋白（CK）。治疗后小鼠的肺水肿指数和肺组织匀浆IL-1β含量下降。结论 外源性MSCs移植到肺损伤小鼠体内,可迁移至肺损伤部位,并表达上皮细胞标志;减轻肺水肿程度,减少炎症因子释放。     

间充质干细胞标记示踪方法研究进展

间充质干细胞（MSCs）具有很强的自我更新能力和多向分化潜能,现已成为组织修复的理想种子细胞和基因治疗的靶细胞。但MSCs移植入体内的标记和示踪是当今研究的热点和难点问题。目前常用的标记示踪技术按不同的标记分类有：荧光染料标记,分子细胞标记,影像学成像技术标记等。就这些标记示踪方法的优缺点加以综述。     

同种异体移植骨髓间质干细胞治疗大鼠心梗后心室重构

目的： 观察骨髓间质干细胞（MSCs）移植对大鼠心梗后心室重构和心功能的影响，比较成年大鼠MSCs与乳鼠MSCs移植疗效，初步探讨同种异体移植的可行性。方法: 分别取大鼠和乳鼠的骨髓，体外分离、扩增培养MSCs，Brdu标记。在结扎冠脉后1-2 h 分别将大鼠MSCs和乳鼠MSCs分点注射到异体大鼠心脏梗死边缘区，6周后，采用超声心动图和解剖直测法获得大鼠心功能、心室重构和病理学资料。结果: 细胞移植组左室舒张末期内径和收缩末期内径短于、室壁厚于对照组，重量指数和心室腔都明显小于对照组。组织病理表现细胞移植组心梗区心肌数目多于、血管密度大于对照组，细胞外基质胶原的形成和血管周围胶原沉积均明显少于对照组，心梗区可见Brdu阳性细胞。但大鼠MSCs移植组和乳鼠MSCs移植组间无明显差异。结论: 同种异体骨髓间质干细胞可以在心梗区定植，减少胶原形成，促进心肌和血管生成，从而延缓心梗后心室重构，提高左室收缩和舒张功能。成年鼠干细胞移植与乳鼠干细胞移植具有相似的效果。     

CM-DiI标记的BMSCs在实验性自身免疫性脑脊髓炎大鼠的体内示踪分布

目的观察并探讨CM-DiI标记骨髓间充质干细胞(BMSCs)移植到实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)大鼠体内的示踪分布。方法全骨髓培养法分离培养大鼠BMSCs;用CM-DiI荧光染料进行体外标记;将标记后的BMSCs移植到EAE大鼠体内,观察移植后细胞的形态及分布。结果荧光显微镜下可在移植BMSCs的EAE大鼠大脑、小脑和脊髓切片内检测到发出红色荧光的细胞,疾病高峰期数量较多,主要位于软膜下和血管周围,形状为圆形或椭圆形;疾病缓解期大部分细胞仍存在,荧光强度略有减弱。结论 CM-DiI是一种短中期标记、示踪BMSCs的良好染料,CM-DiI标记的BMSCs在EAE大鼠体内主要分布在血管周围,少量向脑实质内迁移。     

绿色荧光蛋白转基因小鼠来源肌卫星细胞的体外培养及体内示踪

目的:从绿色荧光蛋白转基因小鼠中分离培养肌卫星细胞(MSCs)并进行体内示踪.方法:利用差速贴壁结合克隆分选方法,分离了MSCs,并于体外进行培养传代、鉴定及分化.检测所获MSCs的生长曲线及细胞周期并与来源于野生型鼠的同代MSCs进行比较.将绿色荧光蛋白标记的MSCs注射到裸鼠胫前肌,于注射后当时、注射后1周、2周、3周和4周利用二维荧光成像平台进行体内示踪.结果:MSCs被成功分离、传代及鉴定.来源于绿色荧光蛋白(GFP)标记或未标记小鼠MSCs的生长曲线、细胞周期及肌原性分化等无差别.MSCs注射后4周内可以动态观察到注射部位的绿色荧光信号并获得组织学证实.结论:来源于GFP转基因小鼠的MSCs在生长和增殖特性上与未转基因来源的MSCs相似,在体内可以通过二维荧光成像平台进行可靠的、无创性的示踪.     

人脐血MSCs移植修复大鼠脊髓损伤的效果及机制的初步探讨

目的　探讨人脐血间充质干细胞（MSCs）移植修复大鼠脊髓损伤的作用及机制。 方法　分离纯化人脐血MSCs;制备大鼠脊髓半横断损伤模型,随机分为三组,分别在术后3 d经尾静脉注射生理盐水、培养液和BrdU标记的MSCs。移植后7、14、21、28 d,采用BBB评分法评估各组大鼠脊髓功能恢复情况;免疫荧光双标法检测MSCs在脊髓内的迁移、存活和分化,免疫组织化学法检测炎症因子高迁移率族蛋白B1（HMGB1）和核因子（NF-κB）在脊髓损伤部位的表达规律。 结果　移植后28 d,MSCs移植组大鼠肢体功能恢复明显,与生理盐水组和培养液组比较差别有统计学意义(P＜0.05)。移植后7、14、21d,脊髓损伤区及周边均可见大量Brdu+细胞,其中BrdU+GFAP+细胞约占53.3%,BrdU+NSE+细胞约占　22.15%。相同时间点MSCs移植组HMGB1和NF-κB的阳性表达率远低于生理盐水组和培养液组,差别有统计学意义(P＜0.05)。 结论　人脐血MSCs移植后可替代损伤的神经细胞,并可减轻脊髓损伤后的炎症反应,从而促进大鼠脊髓功能的恢复。     

SPIO标记骨髓间充质干细胞移植入心肌梗死大鼠的示踪研究

目的探讨超顺磁性氧化铁微粒（SPIO）体外标记骨髓间充质干细胞（BMSCs）及体内示踪移植入大鼠心肌梗死心脏的BMSCs的能力。方法使用左旋多聚赖氨酸-SPIO共培养方式标记BMSCs。采用普鲁士蓝染色观察细胞内铁颗粒,流式细胞术检测细胞活力,将经过SPIO标记的干细胞移植入心肌梗死大鼠心脏,应用1.5TMRI系统行磁标记干细胞成像。超声心动图检测各组心脏的左室射血分数（EF）,左室舒张末期内径（LVIDd）,左室收缩末期内径（LVIDs）及短轴缩短率（FS）。结果普鲁士蓝染色显示,SPIO标记的BMSCs细胞胞质内出现细小的蓝色铁颗粒,标记效率为（99.81±1.57）%;与正常未标记细胞相比较,细胞的活力差异无统计学意义（P〉0.05）。标记了SPIO的BMSCs体内MRI成像时显示,细胞移植区域信号缺失,对应区域病理切片普鲁士蓝染色可见胞浆内染色阳性的细胞。超声心动图显示,PBS组FS移植前后没有明显变化,BMSC组FS从移植前的（23.1±1.88）%上升到第1周的（31.28±4.15）%。BMSC组EF在移植前是（51.13±5.07）%,第1周时上升到（60.12±8.40）%。结论 SPIO能成功地标记BMSCs,且对BMSCs的活力无明显影响。BMSCs移植后能改善心梗大鼠的心功能。SPIO标记的BMSCs移植后在大鼠体内的分布、迁移过程可用MRI进行检测评价。     

骨髓间充质干细胞移植后在mdx鼠体内的分布研究

目的： 研究骨髓间质干细胞移植治疗Duchenne型肌营养不良鼠(mdx鼠)后体内各主要器官的分布状况。方法: 取第5代SD大鼠骨髓间质干细胞，应用［3H］－TdR标记后以2×107cells／只细胞尾静脉移植到经7Gy γ射线预处理后的7-9周龄mdx鼠体内，分别于移植后24 h、48 h、4周、8周和16周测定血液、肺、肝、骨髓、骨骼肌及心肌的放射性分布计数。结果: 经7Gy γ射线放疗预处理的mdx鼠，在尾静脉移植骨髓干细胞后，24 h肺的放射性分布计数最高，为36.70±3.04；48 h肝的放射性分布计数最高，为36.74±3.28；骨髓分布计数随移植时间延长增多，2周时达到高峰，计数为38.43±4.99，以后逐渐下降，但4月时仍明显高于其它组织器官，计数为13.45±1.37；骨骼肌、心肌的放射性分布计数随移植时间延长明显增高，16周时分别达到4.79±0.94和9.55±1.53。结论: 在MSCs移植后早期，MSCs主要分布于肺、肝等血流丰富的器官，随移植时间延长逐渐归巢到骨髓定居，2周时达到高峰，此后逐渐向损伤器官如骨骼肌、心肌等定向迁移，并且随时间延长分布增加，从而为MSCs定居于肌组织并且分化为肌细胞提供了证据。     

Intravenous transplantation of allogeneic bone marrow mesenchymal stem cells and its directional migration to the necrotic femoral head

In this study, we investigated the feasibility and safety of intravenous transplantation of allogeneic bone marrow mesenchymal stem cells (MSCs) for femoral head repair, and observed the migration and distribution of MSCs in hosts. MSCs were labeled with green fluorescent protein (GFP) in vitro and injected into nude mice via vena caudalis, and the distribution of MSCs was dynamically monitored at 0, 6, 24, 48, 72 and 96 h after transplantation. Two weeks after the establishment of a rabbit model of femoral head necrosis, GFP labeled MSCs were injected into these rabbits via ear vein, immunological rejection and graft versus host disease were observed and necrotic and normal femoral heads, bone marrows, lungs, and livers were harvested at 2, 4 and 6 w after transplantation. The sections of these tissues were observed under fluorescent microscope. More than 70 % MSCs were successfully labeled with GFP at 72 h after labeling. MSCs were uniformly distributed in multiple organs and tissues including brain, lungs, heart, kidneys, intestine and bilateral hip joints of nude mice. In rabbits, at 6 w after intravenous transplantation, GFP labeled MSCs were noted in the lungs, liver, bone marrow and normal and necrotic femoral heads of rabbits, and the number of MSCs in bone marrow was higher than that in the, femoral head, liver and lungs. Furthermore, the number of MSCs peaked at 6 w after transplantation. Moreover, no immunological rejection and graft versus host disease were found after transplantation in rabbits. Our results revealed intravenously implanted MSCs could migrate into the femoral head of hosts, and especially migrate directionally and survive in the necrotic femoral heads. Thus, it is feasible and safe to treat femoral head necrosis by intravenous transplantation of allogeneic MSCs.     

脑内移植间充质干细胞治疗大鼠帕金森病模型的研究

目的研究大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)脑内移植治疗帕金森病(PD)大鼠的可行性。方法贴壁培养法分离、培养大鼠骨髓MSCs。将BrdU标记的第3代MSCs移植到PD大鼠纹状体内,移植后1、2和4周检测PD大鼠的行为学变化,应用BrdU免疫荧光观察移植细胞在脑内的存活情况,应用免疫组化法检测酪氨酸羟化酶(TH)在移植细胞及黑质的表达。结果移植细胞后1周、2周和4周PD大鼠与移植前相比行为学有改善,旋转圈数明显减少(P<0.05);PD大鼠损毁侧和健侧黑质内TH阳性细胞数之比随移植时间的延长而增加,但未发现移植细胞呈现TH阳性表达。细胞移植后1周、2周和4周检测均可见纹状体内BrdU阳性细胞散在分布。结论植入脑内的MSCs能够生存和迁移,MSCs脑内移植对PD大鼠有一定的治疗作用。     

龟板对植入大鼠损伤脊髓内骨髓间充质干细胞分化为神经元的影响

应用密度梯度法分离大鼠骨髓间充质干细胞(mesenchymalstem cells,MSCs)进行培养,经5溴脱氧尿嘧啶(BrdU)标记和CD44(celldifferentiation protein44)染色及BrdU/CD44双标染色鉴定,将标记有BrdU的MSCs分别植入脊髓损伤体内和龟板治疗脊髓损伤体内。于移植后1周、2周、3周、4周和6周取损伤脊髓组织,对BrdU、神经丝蛋白(NF)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)进行免疫组化染色及BrdU/NF和BrdU/GFAP双标染色检测移植后MSCs的存活和分化。结果发现:移植后1周,两组在移植区内都可见BrdU单位、BrdU/NF双标细胞,移植后2周达到高峰。龟板组可使BrdU单位和BrdU/NF双标细胞持续高表达至移植后6周,而脊髓损伤组BrdU单位和BrdU/NF双标细胞表达减少至移植后4周,组间比较差别有显著性。结果提示益肾龟板能促进脊髓损伤移植MSCs存活和分化为神经元。     

Hepatocyte-like cells from human mesenchymal stem cells engrafted in regenerating rat liver tracked with in vivo magnetic resonance imaging

Cell transplantation using hepatocytes derived from stem cells has been regarded as a possible alternative treatment for various hepatic disorders. Recently, mesenchymal stem cells (MSCs) from the bone marrow have shown the potential to differentiate into hepatocytes in in vitro and in vivo conditions. Noninvasive imaging techniques allowing in vivo assessment of the location of cells are of great value for experimental studies in which these cells are transplanted. We labeled human mesenchymal stem cells (hMSCs) with green fluorescence protein (GFP) and superparamagnetic iron oxide (SPIO) using a transfection agent (GenePORTER). Cellular labeling was evaluated with magnetic resonance (MR) imaging of labeled suspensions, and Prussian blue staining for iron assessment. hMSCs labeled with SPIO and GFP were injected into the portal veins of immunosuppressed, hepatic-damaged rats. MR imaging findings were compared histologically. To identify the differentiation of hMSCs into hepatocytes and to trace the hepatocytes with molecular imaging, we observed the potential of SPIO and GFP double-labeled hMSCs to differentiate into hepatocyte-like cells in the regenerating rat liver. Serial MR imaging showed the possible detection of transplanted cells in the early period of transplantation. Our results indicate that magnetic labeling of hMSCs with SPIO may enable cellular MR imaging and tracking in experimental in vivo settings.     

大鼠骨髓间充质干细胞的PKH26标记和示踪☆

背景：骨髓间充质干细胞标记是体内迁移分化研究的重要环节。 目的：对大鼠骨髓间充质干细胞进行PKH26标记,探讨PKH26标记对骨髓间充质干细胞的生长特征、分化的影响及体内示踪情况。 方法：培养扩增大鼠骨髓间充质干细胞,第2代细胞按PKH26标记程序进行细胞标记,观察标记组和未标记组细胞的增殖、周期和凋亡情况,对标记组细胞行成骨成脂体外诱导分化。尾静脉移植PKH26标记细胞,6周后荧光显微镜观察骨髓间充质干细胞在子宫内膜的分布情况。 结果与结论：PKH26标记对细胞增殖、凋亡和周期无明显影响,不影响成骨成脂诱导分化。子宫内膜组织中PKH26标记阳性的细胞分布于腺上皮和间质细胞。PKH26标记技术可用于示踪骨髓间充质迁移转归和干细胞移植方面的实验研究。      

CM-Dil标记大鼠骨髓间充质干细胞的生物学特性探讨

BACKGROUND:Existing evidence has shown that CM-Dil-labeled mesenchymal stem cells have delivered better results in experiments in vivo and in vitro. OBJECTIVE:To investigate the effect of in vitro CM-Dil labeling on biological characteristics and directed migration of rat bone marrow mesenchymal stem cells. METHODS:Mesenchymal stem cells were isolated and cultured from the bone marrow of Sprague-Dawley rats. The specific surface antigens, CD29, CD44, CD11b, CD45, were detected by flow cytometry. The rat bone marrow mesenchymal stem cells were labeled with CM-Dil, and then were cultured and passed continually. Thereafter the morphology and proliferation ability of labeled cells were assessed. The strength and duration of fluorescence after CM-Dil labeling were detected. Transwell chambers were used to investigate the migration ability of labeled cells towards the homogenate of the gastrocnemius muscles of mdx mice. RESULTS AND CONCLUSION:The cultured cells were markedly positive for CD29 and CD44, but negative for CD11b and CD45, which were in accordance with the features of bone marrow mesenchymal stem cells. CM-Dil-labeled cells were not different from unlabeled cells in the aspect of morphology and proliferation. Fluorescence was still visible after passage; however, a reduction in fluorescent intensity was observed under an inverted fluorescent contrast phase microscope after labeling. The labeled cells showed no different migration ability from the unlabeled cells (P > 0.05). In conclusion, the procedure of CM-Dil labeling is safe, simple and effective. CM-Dil could be a good choice for labeling and tracing rat bone marrow mesenchymal stem cells.     

体外诱导骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化

目的 探讨生长因子在体外能否诱导大鼠骨髓来源的间充质干细胞（BM-MSC）向心肌样细胞分化,是否增强其旁分泌作用.方法 取4周龄雄性SD大鼠骨髓,贴壁法培养BM-MSC至第3代时,应用流式细胞仪检测其表面标志物CD29、CD44、CD105、CD34、CD45、CD31.将细胞随机分为间充质干细胞组（MSC组）和生长因子共培养组（GF-MSC组）.MSC组继续培养传代;GF-MSC组与生长因子[其中包括培养基（IMDM）、2％胎牛血清（FBS）、20 nmol/L地塞米松、100μmo1/L维生素C（VitC）、50 μg/L成纤维细胞生长因子2（FGF-2）、10 μg/L成骨蛋白2（BMP-2）、2μg/L胰岛素样生长因子1（IGF-1）、青霉素和100 mg/L链霉素]共培养.1周后细胞免疫荧光染色检测两组细胞肌钙蛋白Ⅰ（TnⅠ）和结蛋白（Des）表达;反转录-聚合酶链反应（RT-PCR）检测两组细胞Tn Ⅰ和Des mRNA的表达;ELISA法检测两组细胞裂解液以及细胞培养上清中的肝细胞生长因子（HGF）和血管内皮生长因子（VEGF）的蛋白水平.结果 体外培养的BM-MSC表达CD29、CD44、CD105,而不表达CD31、CD34、CD45.免疫荧光染色显示GF-MSC阳性表达TnⅠ和Des.RT-PCR结果显示TnⅠ和Des mRNA在GF-MSC有阳性表达,而MSC为阴性表达.GF-MSC组HGF、VEGF在细胞裂解液和细胞培养上清中的蛋白水平（ng/L）高于MSC组（HGF裂解液32.05±0.41比12.10±0.21,培养上清574.21±4.19比169.16±2.41;VEGF裂解液45.66±2.22比30.37±0.54,培养上清487.78±36.29比44.25±1.31;均P＜0.05）.结论 体外与生长因子共培养,可诱导BM-MSC向心肌样细胞分化,并增强其旁分泌作用.