大肠杆菌O157：H7 IntC300 B细胞抗原表位的综合预测

目的预测肠出血型大肠杆菌O157：H7 IntiminC端300氨基酸片段（IntC300）的B细胞抗原表位。方法采用计算机软件和网络服务器分析IntC300的亲水性、β-转角、柔韧性、表面可及性和抗原指数。判断其B细胞抗原表位。结果B细胞抗原表位可能在20—36、76—88、189—198、262—279和284—296残基或其附近。结论对EHEC O157：H7 IntC300 B细胞抗原表位的综合预测，为研究诊断性单克隆抗体及多肽疫苗提供了理论工具。     

肠出血型大肠埃希菌O157:H7Tir的表达、纯化及不同免疫途径对其免疫效价的影响

目的 克隆、表达和纯化肠出血型大肠埃希菌(enterohaemorrhagic E.coli,EHEC)O157:H7转位紧密黏附素受体蛋白(Tir),观察不同免疫途径对其免疫效价的影响,为EHEC O157:H7亚单位疫苗的研究提供了实验资料.方法 扩增tir基因,克隆到pET-30a(+)载体上,转化至大肠埃希菌BL21/DE3,诱导表达目的 蛋白,通过Ni-IDA亲和层析进行纯化;将重组蛋白Tir免疫小鼠,检测血清和粪便提取物中抗体效价.结果 双酶切和测序鉴定结果均显示重组质粒pET-30a (+)-tir构建成功.SDS-PAGE结果表明,目的 蛋白Tir在大肠埃希菌BL21(DB3)中得到表达.皮下免疫和鼻腔免疫小鼠,血清中均能检测到高效价的IgG类抗体,鼻腔免疫组小鼠血清和粪便lgA类抗体效价明显高于皮下免疫组.结论 Tir蛋白具有一定的免疫原性.

Abstract：

Objective To clone and express translocation intimin receptor(Tir)of enterohemorrhagic Escherichia coli(EHEC)O157:H7,and to analyze the effect of different routes on the induction of immunity to the recombinant protein.Methods The tir eucoding genes were amplified from EHEC O157:H7 strain guangzhou 246 genome,and genes were cloned into the vector pET-30a(+).The pET-30a(+)tir recombinant was transformed into E.coli BL21.and expression was induced bv IPTG.The expressed product was analyzed by SDS-PAGE and purified by Ni-IDA affinity chromatography.The immunized mice sera and fecal against the recombinant protein was detected.Resuits The length of the tir is 1677 bp,with the initiation codon ATG and the termination codon TAA.Double enzyme digestion and DNA sequencing confirmed that the recombinant expression plasmid pET-30a(+)-tir was constructed.The recombinant protein was expressed in Escherichia coli expression system,and was purified by Ni-IDA affinity chromatography.The mice were able to produce a high serum IgG antibody titer after both subeutaneous and intranasal immunizations.Meanwhile,the intranasal immunization induced serum and fecal IgA antibody titer was significantly higher than that of the subcutaneous immunization group.Conclusion Tir molecule is potential vaccine candidate for preventing EHEC disease.     

肠出血型大肠埃希菌O157：H7 EspF蛋白多克隆抗体的制备和初步纯化

目的制备肠出血型大肠埃希菌（EHEC）O157：H7EspF蛋白多克隆抗体并初步纯化。方法生物信息学方法分析EHECO157：H7EspF蛋白的柔韧性、亲水性、表面可能性及抗原表位,选取1条由15个氨基酸残基组成的多肽为半抗原,在其C端偶联钥孔血蓝蛋白（KLH）,免疫新西兰大白兔制备抗血清。ELISA测定抗血清效价,免疫印迹法鉴定其特异性,辛酸-硫酸铵法初步纯化抗血清,SDS-PAGE检测抗体纯度。结果选择EspF蛋白抗原指数最高的肽段72-TPSRPAPPPPTSGQA-86（0.506）为半抗原,合成抗原多肽经高效液相色谱鉴定,纯度为95.78%,经质谱分析其分子量为1563.76Mr,与目的多肽分子量一致;加强免疫3次后,EHECO157：H7EspF蛋白的抗血清效价达1：2048000;该血清对EHECO157：H7野生株和espF突变株（△espF）的EspF蛋白均有特异性,并经辛酸-硫酸铵法获得一定纯度的抗体。结论成功地制备了效价高、特异性强的EHECO157：H7EspF蛋白多克隆抗体。     

肠出血性大肠杆菌O157：H7的紧密黏附素基因eae的测序及生物信息学分析

目的克隆编码肠出血型大肠杆菌O157：H7的紧密黏附素eae基因，并对其进行测序及生物信息学分析，为研究EHEC与宿主细胞相互作用奠定基础。方法利用PCR技术扩增eae基因，经过纯化，将其定向插入克隆载体PMD19-T simple vector并进行测序．应用生物信息学软件分析其生物学特性。结果用PCR方法扩增eae基因，大小为2802bp，编码934个氨基酸，用DNAstar5．0软件分析紧密黏附素（Intimin）蛋白的生物活性，在202～210、510—520、716—735个氨基酸残基的肽链上，显示该蛋白具有良好的亲水性，在175～220、300。315、550～610、710—780、825～880个氨基酸残基的肽链上具有良好的柔韧性，在220～300、615～710个氨基酸残基的肽链上．显示该蛋白具有良好的抗原性。结论本研究用PCR法扩增出了O157：H7的eae基因，成功构建了肠出血性大肠杆菌O157：H7紧密黏附素eae基因的重组质粒，并分析了黏附素蛋白的亲水性、柔韧性、抗原性，为进一步研究大肠杆菌O157：H7黏附素的致病机制奠定了基础，为下一步表达出Intimin蛋白，进一步研究该蛋白与宿主细胞的粘附、免疫原性、抗原抗体反应提供了理论依据。     

化学发光磁酶免疫法检测O157∶H7大肠埃希菌

目的建立灵敏稳定检测O157∶H7大肠埃希菌的化学发光磁酶免疫法。方法利用AMPPD-ALP化学发光体系,通过磁珠酶联免疫法对O157∶H7大肠埃希菌进行检测。结果其检测灵敏度达到850个,线性范围为1000~50000个,批间变异小于15%,批内变异小于20%,与人工计数培养检测相比相关系数达0.9807。结论化学发光磁酶免疫分析法操作简便,检测精密度和灵敏度高,是一种很有发展前景的可靠方法。     

化学发光磁酶免疫法检测O157:H7大肠埃希菌

目的：建立灵敏稳定检测O157：H7大肠埃希菌的化学发光磁酶免疫法.方法：利用AMPPD-ALP化学发光体系,通过磁珠酶联免疫法对O157：H7大肠埃希菌进行检测.结果：其检测灵敏度达到850个,线性范围为1 000～50 000个,批间变异小于15%,批内变异小于20%,与人工计数培养检测相比相关系数达0.9807.结论：化学发光磁酶免疫分析法操作简便,检测精密度和灵敏度高,是一种很有发展前景的可靠方法.     

环丙沙星药敏检测在大肠埃希菌graA基因突变关系研究

为了解3株3次环丙沙星药敏检测结果不一致的大肠埃希菌gyrA基因基因突变状况，本文对该3株菌和另3株3次环丙沙星药敏检测均为耐药的大肠埃希菌进行了gyrA基因基因喹诺酮耐药区（QRDR）PCR扩增和产物DNA测序。结果为3株3次环丙沙星药敏检测结果不一致的和另3株3次检测均为耐药的大肠埃希菌均存在gyrA基因基因第83和第87位氨基酸密码子的突变（TCG→TTG，GAC→AAC）。     

深圳市大肠埃希菌超广谱β-内酰胺酶的基因分型

目的分析深圳市大肠埃希菌超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）的主要基因型。方法对50株产ESBLs大肠埃希菌分别用TEM、SHV、CTX-M和OXA-1群基因引物进行PCR扩增,并对PCR产物进行序列分析。结果 92%菌株检出CTX-M型ESBLs,测序结果显示,以CTX-M-14型ESBLs为主,其次为CTX-M-55型。结论 CTX-M-14型和CTX-M-55型是深圳地区大肠埃希菌ESBLs的主要基因型。     

人干燥综合征B抗原重组体的构建及融合表达

目的克隆人干燥综合征B抗原基因(human sjogren’s syndrome antigen B,SSB)并进行原核表达,为使用重组抗原用于自身抗体的临床检测奠定基础。方法根据GenBank中检索到的人SSB cDNA序列,在5′非编码区和3′非编码区设计特异性引物,提取人源HeLa细胞总RNA作为模板,逆转录RT-PCR扩增人干燥综合征B抗原cDNA。PCR产物纯化后连接至载体PET-30a,导入大肠埃希菌DH5α,构建重组质粒PET-30a-SSB。对重组质粒进行酶切鉴定,选择阳性克隆测序。重组质粒导入大肠埃希菌BL21,阳性克隆经鉴定后在IPTG诱导下表达。结果RT-PCR扩增产物为1245bp。重组质粒PET-30a-SSB经EcoR Ⅰ和HindⅢ双酶切证实含目的基因片段。序列分析提示与GenBank中检索到的一致。SDS-PAGE和Western印迹结果显示融合蛋白相对分子量为73ku,具有天然SSB抗原活性。结论成功克隆SSB基因并表达融合蛋白。     

环丙沙星药敏检测与大肠埃希菌gyrA基因突变关系研究

为了解3株3次环丙沙星药敏检测结果不一致的大肠埃希菌gyrA基因突变状况,本文对该3株菌和另3株3次环丙沙星药敏检测均为耐药的大肠埃希菌进行了gyrA基因喹诺酮耐药决定区(QRDR)PCR扩增和产物DNA测序。结果为3株3次环丙沙星药敏检测结果不一致的和另3株3次检测均为耐药的大肠埃希菌均存在gyrA基因第83和第87位氨基酸密码子的突变(TCGTTG,GACAAC)。     

病毒性肝炎后肝硬化住院患者血液感染大肠埃希菌超广谱β-内酰胺酶基因型调查CSCD

目的研究病毒性肝炎后肝硬化住院患者血液感染的大肠埃希菌产超广谱β内酰胺酶基因型。方法连续收集2011年1月至12月分离自病毒性肝炎后肝硬化住院患者血培养阳性的大肠埃希菌,VITEK-II鉴定细菌,K-β药敏试验检测细菌的药敏,多重PCR、PCR、测序及比对等对大肠埃希菌超广谱β内酰胺酶基因型进行分析。结果肝硬化主要原因为病毒感染,共收集79株大肠埃希菌,PCR扩增产物测序、比对：20株大肠埃希菌产TEM-1型β-内酰胺酶;仅有的-株产SHV-1型β-内酰胺酶,未检测出TEM型和SHV型超广谱β-内酰胺酶;40株产CTX-M型超广谱B-内酰胺酶,CTX-M-1群20株,CTX-M-9群26株,其中有6株菌同时产两群CTX-M型超广谱β-内酰胺酶,测序比对出CTX-M-3、CTX-M-15、CTX-M-14等八种基因型。结论病毒性肝硬化患者血液感染的大肠埃希菌超广谱B内酰胺酶最常见为CTX-M型,CTX-M-14是最常见的基因型。     

大肠杆菌O157：H7多糖—重组铜绿假单胞菌外毒素A结合疫苗的研制

目的用大肠杆菌O157∶H7(Escherichia coli O157∶H7, E. coli O157)的一个重要保护性抗原即菌体脂多糖(LPS)制备有效的候选疫苗. 方法选用Westphal热酚法提纯E. coli O157∶H7的LPS,经酸水解法进一步脱毒处理后得到无毒但却具弱免疫原性的O-特异性多糖(O-SP),然后采用己二酸二肼(ADH)将其共价结合到琥珀酰化(或没琥珀酰化)重组铜绿假单胞菌外毒素(rEPAsucc或rEPA)上. 结果制备得到的E. coli O157∶H7的O-SP-rEPAsucc或O-SP-rEPA结合疫苗是安全有效的,其免疫原性要比单一O-SP的免疫原性强,免疫小鼠后产生的血清抗LPS IgG抗体滴度比单一O-SP免疫后产生的抗体水平均有显著性升高(P<0.01),且再次注射后存在加强应答. 结论 E. coli O157∶H7的O-SP-rEPAsucc结合疫苗可望作为一种预防肠出血性E. coli引起的感染性腹泻的有效候选用疫苗.     

结核分枝杆菌潜伏感染相关蛋白Rv2004c的抗原表位预测

本文应用生物信息学技术预测结核分枝杆菌潜伏感染相关蛋白Rv2004c的抗原表位,为结核病的诊断和疫苗研发筛选合适的抗原靶位。通过Blast分析发现Rv2004c蛋白与人类蛋白的同源性较低;采用DNAStar软件包中的Protean软件分析其二级结构、亲水性、抗原性、柔韧性及表面可能性,预测该蛋白有10个候选B细胞抗原表位;应用RANKPEP及SYFPEITHI法预测该蛋白有37个候选Th细胞抗原表位,主要位于第200位氨基酸之后,其中HLA-DRB1*0401及HLA-DRB1*0701表型相对的表位数目较多且某些候选表位的主要组织相容性复合体(MHC)限制类型存在交叉重叠;应用SYFPEITHI法、BIMAS法及NetCTL法预测该蛋白有10个候选细胞毒性T淋巴细胞(CTL)表位,其中以HLA-A2限制性表位数目较多、分值较高。由此得出结论:Rv2004c蛋白含有较多潜在的T细胞和B细胞抗原表位,可作为新的结核病诊断试剂和疫苗研发的候选靶蛋白。     

透皮免疫佐剂LTB及LTK63的表达与鉴定

目的 研究新型的透皮免疫佐剂。方法 从大肠埃希菌E．coli H10407中扩增出大肠埃希菌不耐热肠毒素（Heat-labile enterotoxin，LT）全长基因，并用基因工程的方法表达出了无毒性的A亚单位蛋白LTKA及B亚单位蛋白LTB。将表达产物纯化后用SDS-PAGE、GMI-ELISA等方法进行鉴定。结果 表达的LTB亚单位仍具有和神经节苷脂GMI特异结合的生物学活性，LTK63已经不具有毒素活性。结论 LTB和LTK63有希望成为候选的透皮免疫佐剂。     

H1N1亚型流感病毒血凝素Th和B细胞表位预测及抗原性分析

目的:应用生物信息学方法预测H1N1亚型流感病毒血凝素Th和B细胞相关抗原表位,并初步分析其抗原性,为研制H1N1亚型流感病毒的表位疫苗奠定基础.方法:依据近年流感病毒流行趋势,从GenBank下载具有代表性的H1N1亚型流感病毒HA蛋白氨基酸序列.进行生物信息学综合分析预测,获得Th和B细胞相关抗原表位,并比较其保守性和特异性.通过Balb/c小鼠H1N1亚型流感病毒阳性血清与表位肽的结合试验,初步鉴定候选表位抗原性.结果:综合多项预测及空间构像模拟结果,我们获得了三条候选Th和B细胞表位,分别为HA_(73～87)、HA_(125～139)、HA_(188～205).候选表位处于H1N1亚型流感HAI蛋白序列上相对保守的区域内,且与目前流行的H1N1亚型流感病毒HA相应区域具有较好的一致性.而不同候选表位在BMB/e小鼠H1N1亚型流感病毒阳性血清反应中显示了不同抗体结合能力,预示了其成为功能表位的可能.结论:所筛选的表位具有成为H1N1亚型流感病毒HA Th和B细胞相关抗原表位的可能.此研究为深入揭示流感病毒感染与免疫机制,H1N1亚型流感功能表位认知及表位疫苗研究奠定了基础.     

甲型肝炎病毒P1B、P2A、P3AB和P3D蛋白在原核系统中的表达和抗原活性分析

目的研究甲型肝炎病毒P1B、P2A、P3AB和P3D在原核系统中的表达,并探讨这些蛋白的抗原活性和作为诊断抗原的应用价值。方法采用PCR方法,从克隆有HAV HM175株全长cDNA基因的克隆载体pHAV16H1上扩增出目的基因,以M47作为表达载体,构建N端带硫氧还蛋白的重组表达质粒。重组质粒在大肠埃希菌BL21(DE3)中经IPTG诱导表达。采用DEAE阴离子交换和镍离子柱螯和亲和层析纯化的方法对重组蛋白进行纯化。以Western Blot和间接ELISA的方法检测重组蛋白的抗原活性。结果四个重组质粒经测序证明构建正确无误,在大肠埃希菌中表达四个蛋白的相对分子质量也正确无误。Western Blot分析和间接ELISA方法证实四个蛋白中只有p2a有抗原活性。结论原核表达的P2a蛋白,具有较好的抗原活性,在间接ELISA方法中检测出了所有的24份阳性血清和24份阴性血清,非常有希望做成诊断抗原用于诊断急性甲肝患者和区分甲型肝炎自然感染与注射疫苗所产生的不同免疫。     

尘螨Ⅱ类变应原Der f2和Der p2的DNA改组及生物信息学分析

目的构建尘螨Ⅱ类变应原Der f2和Der p2嵌合基因文库,并进行生物信息学分析。方法用PCR分别扩增Der f2和Der p2,扩增产物等量混合后用DNaseⅠ酶解;回收50～100 bp的片段,连续3轮无引物PCR,以Der f2基因的特异性引物进行有引物PCR,扩增片段连接于pUCm-T载体并转化E.coli DH-5α,随机挑取60个单菌落测序,应用生物信息学进行序列比对分析和抗原表位预测(包括T和B细胞抗原表位)。结果获得的10个重组子其编码蛋白不仅呈现新的Th细胞表位,也减少了B细胞表位。结论成功获得Der f2和Der p2嵌合基因文库,为后期筛选和制备高免疫原性和低变应原性的高效尘螨哮喘疫苗奠定了基础。     

结核分枝杆菌α晶体蛋白(Rv2031c)的T、B细胞抗原表位在线分析

目的预测结核分枝杆菌潜伏感染相关蛋白α晶体蛋白(Rv2031c)的抗原表位。方法 BLAST在线分析Rv2031c与人类蛋白的同源性;利用DNAStar软件包中的Protean模块预测其B细胞和T细胞抗原表位;RANKPEP和SYPEPITHI在线预测辅助性T(Th)细胞抗原表位;SYFPEPI、BIMAS和Net CTL方法在线预测细胞毒性T淋巴细胞(CTL)表位。结果 Rv2031c与人类蛋白同源性较低,有8个潜在的B细胞抗原表位,7个候选Th细胞抗原表位和3个候选CTL表位。结论 Rv2031c含有较多潜在的人类B细胞、Th细胞和CTL抗原表位,可作为新的结核病疫苗研发的候选靶蛋白。     

养殖动物分离的大肠埃希菌质粒介导喹诺酮耐药机制的研究

目的 调查养殖业动物大肠埃希菌对喹诺酮类抗生素的耐药情况,阐明耐药机制,为控制畜牧养殖业滥用抗生素提供依据.方法 从7省市9家养殖场采集鸡和猪的肛门拭子样本,分离并鉴定其中的大肠埃希菌,PCR扩增筛选其中的质粒上的喹诺酮耐药基因qnrA、qnrB、qnrS、qnrC、qnrD和aac(6')-I 6-cr,并进行测序和药敏试验,通过接合试验以确定耐药基因的可转移性以及在喹诺酮耐药中的作用.结果 在818株大肠埃希菌中检出38株qnr阳性菌株和75株aac阳性菌株,其中gyrA突变的有15株,parC突变的有13株.结论 养殖业动物分离大肠埃希菌对喹诺酮的耐药性较为普遍,质粒介导的喹诺酮耐药作为一个重要的机制参与其中,提示应加强食源性细菌耐药性的监测.     

旋毛虫抗原分子克隆及其T细胞和B细胞表位预测

目的 克隆旋毛虫肌幼虫Mr21 000抗原蛋白基因(Ts21),预测其T细胞和B细胞表位.方法 旋毛虫(河南地理株)感染小鼠后收集肌幼虫,提取肌幼虫总RNA,应用RT-PCR技术获取目的基因Ts21,构建重组质粒pUC18-Ts21并测序,应用生物信息分析软件预测其T细胞和B细胞表位.结果 成功构建克隆载体pUC18-Ts21.旋毛虫Mr21 000抗原的T细胞表位位于第9～23、135～150位氨基酸位点;B细胞表位位于第31～35、53～56、98～104、124～130、133～157、160～172位氨基酸位点.结论 成功克隆了旋毛虫河南地理株肌幼虫Mr21 000抗原的编码基因,T细胞和B细胞表位预测结果表明该抗原蛋白具有较好的抗原性,可作为旋毛虫病免疫诊断和预防的候选抗原.