构建不稳定型心绞痛淋巴细胞差异表达cDNA消减文库

目的:构建不稳定型心绞痛淋巴细胞差异表达cDNA消减文库。方法:将不稳定型心绞痛病人(n=15)和稳定型心绞痛病人(n=15)的淋巴细胞的RNA进行抑制性消减杂交(SSH), 将获得的顺向和逆向消减产物分别与T/A载体连接, 采用1×TSS一步法转化大肠杆菌JM109, 获得消减cDNA文库, 采用蓝白斑筛选和菌落PCR筛选有插入片段的克隆。结果:各组cDNA文库各获得2000个阳性克隆, cDNA片段大部分分布于(200-600)bp之间。结论:本研究构建了不稳定型心绞痛淋巴细胞消减cDNA文库, 此cDNA文库有助于进一步筛选不稳定型心绞痛淋巴细胞中的差异表达基因。     

抑制性消减杂交技术筛选重组IFNβ下调HepG2细胞靶基因

目的利用抑制性消减杂交（SSH）技术构建重组干扰素β（IFNβ）刺激人肝癌细胞系HepG2差异表达基因的cDNA消减文库，筛选IFNβ下凋HepG2相关基因。方法重组IFNβ2000U／ml刺激对数生长期HepG2细胞，以生理盐水作用的HepG2细胞为阴性对照；制备细胞裂解液，从中提取mRNA并逆转录为cDNA，经Rsa Ⅰ酶切后将实验组cDNA分成两份，分别与两种不同的接头连接，再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性PCR，将产物与T／A载体连接，构建cDNA消减文库，并转染大肠埃希菌进行文库扩增，随机挑选克隆PCR后进行测序及同源性分析。结果成功构建重组IFNβ刺激HepG2细胞差异表达基因的cDNA消减文库。文库扩增后，得到58个阳性克隆，进行菌落PCR分析，均得到200～1000bp插入片段。随机挑选其中35个插入片段测序，并通过生物信息学分析，结果共获得12种编码基因。结论应用SSH技术成功构建了IFNβ刺激HepG2细胞差异表达基因的cDNA消减文库，为进一步了解IFNβ在肝细胞内的免疫调节机制提供了依据。     

应用抑制消减杂交技术构建结核分枝杆菌差异表达基因消减cDNA文库

目的:构建结核分枝杆菌H37Rv与H37Ra的差异表达基因消减文库,分离结核分枝杆菌差异表达cDNA片段.方法:利用抑制性消减杂交技术分析结核分枝杆菌强毒株H37Rv和弱毒株H37Ra的基因组mRNA的表达差异,并进行两轮消减杂交和两次PCR,将第二次PCR产物与pGEM-T载体相连,电击转化大肠杆菌E.coff DH5α进行文库扩增和蓝白斑筛选,RT-PCR承鉴定差异表达文库.结果:以结核分枝杆菌强毒株H37Rv的cDNA为检测子的正相杂交和以弱毒株H37Ra的cDNA为检测子的反相杂交各自高表达或特异性表达的片段都得到选择性扩增,成功构建了差异表达cDNA文库 A库和B库.所长出的菌落中90%为白色克隆,其中单一条带的克隆占75%和80%,片段大小集中在100～800 bp之间.结论:利用SSH技术成功构建了结核分枝杆菌强毒株H37Rv和弱毒株H37Ra差异表达基因消减cDNA文库,该消减文库的建立为进一步筛选、克隆这两种菌株之间差异表达的新基因奠定了基础.     

高温致金黄地鼠神经管畸形的上调表达基因筛选及其鉴定

目的:筛选高温致金黄地鼠神经管畸形的上调表达基因,探讨其分子生物学机制。方法:通过抑制性消减杂交技术获得消减产物,转化大肠杆菌DH5α,构建高温致金黄地鼠胚胎神经管畸形的消减cDNA文库;联合蓝白斑和菌落PCR方法筛选含插入片段的阳性克隆,进行测序和同源性分析,并经Northern杂交技术检测基因的表达。结果:成功构建高温致金黄地鼠胚胎神经管畸形的消减cDNA文库,其中2个克隆插入片段的基因序列与小鼠磷酸甘油酸酯激酶(Pgk-1)同源。Northern杂交证实该基因在高温致畸胚胎神经管的表达较其在同龄正常胚胎神经管明显升高。结论:Pgk-1的上调表达可能与高温致神经管畸形密切相关。     

应用抑制性消减杂交技术筛选及鉴定高温致金黄地鼠神经管畸形下调表达基因

目的克隆高温致金黄地鼠神经管畸形下调表达基因，探讨其分子生物学机理。方法应用抑制性消减杂交技术构建高温致畸金黄地鼠胚胎神经管反向消减cDNA文库；联合蓝白斑和菌落PCR方法筛选阳性克隆进行测序和同源性分析；用Northern印迹方法证实这些基因的表达。结果成功构建高温致畸金黄地鼠胚胎神经管反向消减cDNA文库，从中筛选到15个基因，均与GenBank中已知基因有同源性。Northern印迹证实这些基因在高温致畸胚胎神经管中均呈下调表达。结论发现了高温致金黄地鼠神经管畸形过程中的一些重要相关基因并对其功能进行了初步探讨。     

大鼠肝细胞热适应差异表达基因消减文库的构建与鉴定

目的: 构建大鼠肝细胞热适应差异表达基因消减文库。方法: 实验采用热适应大鼠模型、常温对照。提取肝组织mRNA,反转录cDNA并酶切、接头连接后分别以其中一组cDNA片段为tester, 另一组为driver进行抑制性消减杂交(SSH)构建消减文库。PCR扩增文库和未消减对照样品中的G3PDH基因以对比评估文库特异性。初步分离、筛选以评估文库的可靠性。结果: PCR证实文库中G3PDH丰度大幅低于对照组,说明文库特异性较高。从文库中分离获得300个目的基因片段, 其中27个经鉴定为差异表达基因, 证实文库高效可靠。结论: 通过构建优质的热适应差异表达基因消减文库, 为深入研究热适应机理奠定了基础。     

应用抑制性消减杂交技术克隆PS1TP1的反式激活基因

目的 应用抑制性消减杂交（SSH）技术构建乙型肝炎病毒（HBV）前-S1蛋白（preS1）反式激活蛋白1（PS1TP1）的相关基因cDNA消减文库,克隆PS1TP1反式激活相关基因,以期发现PS1TP1蛋白反式激活作用的靶位点.方法 以PS1TP1表达质粒PcDNA3.1（-）-PS1TP1转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1（-）为对照;提取mRNA并逆转录为cDNA,进行两次消减杂交及两次抑制性PCR,将产物与pGEM-Teasy载体连接,构建cDNA消减文库.结果 文库扩增后得到90个阳性克隆,随机挑选43个克隆测序,并进行同源性分析,获得12种编码基因,其中10个为已知功能基因,另外2个为未知功能序列.结论 成功构建PS1TP1反式激活的相关基因cDNA消减文库,为今后进一步分析、研究病毒蛋白的致病机制奠定基础.为进一步研究PS1TP1蛋白的功能及其在HBV感染中的分子生物学机制提供理论依据和研究方法.     

肝癌组织差异表达基因cDNA序列的筛选与鉴定

目的：筛选并鉴定肝癌组织特异表达基因。方法：通过菌落原位杂交技术筛选用抑制消减杂交法构建肝癌与癌旁肝组织差异表达基因消减cDNA文库，用PCR方法进一步筛选出有插入片段的阳性克隆，将阳性克隆进行DNA测序和同源性比较分析，用Northern印迹方法对新的cDNA序列进行初步鉴定。结果：从消减文库中随机挑取的100个白色克隆中筛选出13个阳性克隆，DNA测序获得11个不同的cDNA序列；同源性比较分析表明，6个cDNA片段与在基因高度同源，5个cDNA片段为新的序列。其长度大于300bp的3个新序列，Norther印迹证实它都来源于肝癌组织。结论：用抑制消减杂交方法构建的肝癌差异表达基因消减cDNA文库富含肝癌特异表达基因，经验证的3个新的cDNA序列可能为肝癌特异的基因序列。     

丙型肝炎病毒非结构蛋白NS4A反式激活基因的克隆化研究

目的应用抑制性消减杂交（SSH）技术构建丙型肝炎病毒非结构蛋白4A（HCV NS4A）转染细胞差异表达cDNA消减文库，克隆HCV NS4A蛋白反式激活相关基因。方法以HCV NS4A表达质粒pcDNA3．1（-）-NS4A转染Hep G2细胞，以空载体pcDNA3．1（-）为对照，制备转染后的细胞裂解液，提取mRNA并逆转录为cDNA，进行SSH分析。将富集的二次PCR产物与TIA载体连接，并转染大肠埃希菌进行文库扩增，随机挑取克隆，聚合酶链反应（PCR）扩增后进行测序及同源性分析。结果文库扩增后得到36个阳性克隆，经菌落PCR分析显示200～1000bp插入片段。对其中的25个片段测序，并进行同源性分析，显示18种已知基因编码蛋白和2种未知功能基因序列，包括一些与细胞周期、细胞凋亡、信号传导及肿瘤发生等细胞生长调节密切相关的蛋白编码基因，可能是NS4A反式激活靶基因。结论成功构建了HCV NS4A反式激活基因差异表达的cDNA消减文库，为进一步阐明HCV NS4A反式调节的靶基因等提供了相关的平台。     

骨质疏松症骨组织cDNA差减文库的构建

目的构建人抑制差减文库,为筛选骨质疏松骨相关基因奠定基础。方法分别从正常骨和骨质疏松症骨组织分离mRNA并反转录成cDNA,酶切后骨质疏松cDNA分成两组,分别与不同的接头连接。经过两轮差减杂交和两次抑制性PCR后得到两者之间差异表达的cDNA挑取克隆进行PCR扩增鉴定。结果成功地构建了骨质疏松相关的的差减cDNA文库,获得的正、反向差减文库分别含652、345个重组子;插入片段的平均大小为526bp。结论该差减cDNA文库的建立为进一步在分子水平上阐明骨质疏松症的分子机制奠定了基础。     

淡色库蚊性别差异表达cDNA文库的构建和分析

目的为探讨媒介与病原、媒介与宿主的相互作用，建立传播疾病的淡色库蚊性别差异表达cDNA文库。从而筛选阻断疾病传播的疫苗候选分子。方法以淡色库蚊雌蚊成蚊为检测方（Tester）、雄蚊成蚊为驱动方（Driver），进行正向抑制性消减杂交；以雄蚊成蚊为Tester、雌蚊成蚊为Driver，进行反向抑制性消减杂交。将获得的正向抑制性消减杂交产物克隆入pGEM-T easy vector，并以菌液PCR扩增鉴定插入片段。随机抽取100个阳性克隆进行DNA序列分析，并将所得ESTs序列进行在线BLAST分析。结果从100个阳性克隆中测得98个ESTs序列，在测定的序列中与已知基因具有同源性的有57个，其余41个ESTs与已知基因不具有同源性。结论抑制性消减杂交技术建立雌蚊特异性基因文库，发现了淡色库蚊雌蚊新的ESTs序列，为性别相关基因的功能及性别调控。探讨媒介与病原、媒介与宿主的相互作用及其筛选传播阻断疫苗候选分子的研究奠定了基础。     

浸润性突眼相关基因/cDNA片段的筛选

筛选浸润性突眼相关基因／cDNA片段，为探究浸润性突眼发生的分子机制莫定基础。采用抑制消减杂交技术，以甲亢伴突眼患者甲状腺组织的cDNA为tester，甲亢不伴突眼患者甲状腺组织的cDNA为driver，经过两轮消减杂交和两轮PCR，获得二者之间的消减PCR产物，将产物插入至pCR2．1载体，转化感受态细胞E．coli DH5α，进行蓝白筛选。随机挑取48个白色菌落，经过Colony PCR，其中有1个转化子的扩增产物为双带，其余均为0．2～2kb之间的单一条带。将Colony PCR产物点样于同一尼龙膜上，一式两份，分别与地高辛标记的甲亢伴突眼和甲亢不伴突眼患者甲状腺组织的cDNA探针杂交。以与甲亢伴突眼患者甲状腺组织的cDNA探针有杂交信号，而与甲亢不伴突眼患者甲状腺组织的cDNA探针无杂交信号或信号明显弱的转化子为阳性克隆。筛选的阳性率为50％左右，阳性克隆中的插入片段即是与浸润性突眼相关的基因／cDNA片段。     

小鼠生发泡完整卵母细胞一个特异基因的克隆及其在胚胎的表达

目的：克隆和筛选小鼠生发泡完整卵母细胞(Gv卵)特异基因，并检测其一在胚胎中的表达。方法：应用抑制性消减杂交技术(SSH)，建立Gv卵特异的cDNA文库。通过斑点杂交法进一步筛选并对阳性克隆进行序列测定和同源性分析；采用RT-PC方法观察其一在着床前胚胎的表达。结果：克隆发现18个基因和8个EST序列在GV卵中特异表达。RT-PCR显示该阳性克隆的基因在GV卵、MII卵、1-细胞胚胎和2-细胞胚胎有表达，其短片段是预期要扩增者，从MII卵开始表达下降；长片段在Gv卵、MII卵、1．细胞胚胎和2-细胞胚胎表达未见明显变化。长、短片段两端序列一致。结论：该基因是GV卵特异cDNA文库中的一个基因，且是母源性基因，提示该基因在卵母细胞成熟和合子基因激活中起一定作用。     

应用抑制性消减杂交技术研究哮喘发作外周血嗜酸细胞与细胞粘附及免疫调节相关基因的差异表达

目的：研究哮喘发作时外周血嗜酸细胞(EOS)与细胞粘附及免疫调节相关基因的差异表达。 方法:利用Percoll密度梯度离心分离哮喘患者发作时与治疗缓解外周血嗜酸性粒细胞，提取总RNA，并利用Super SMART cDNA Synthesis技术合成cDNA第1链及优化扩增第2链。按照SSH常规方法构建cDNA消减文库，筛选阳性克隆并加以鉴定以得到带有差异表达的基因克隆。 结果:成功构建具有高消减效率的哮喘发作患者外周血EOS　cDNA文库，筛选鉴定后确认15个差异表达基因，测序并同源性比对分别为夏科-莱登结晶蛋白（CLC protein, galectin-10）、假定mRNA前剪接调节子female-lethal(2D)［putative pre-mRNA splicing regulator female-lethal(2D)］、水通道蛋白9（AQP-9）、IL-8、slingshot磷酸酶(SSH-2L)、蛋白磷酸酶1催化亚基β亚型（PP1CB）、RNA解旋酶HELZ、β2-微球蛋白（β2-MG）及一个线粒体相关基因。 结论:这些基因的差异表达证明了EOS的趋化、迁移、粘附及免疫调节功能参与了哮喘病理生理调节，对这些途径的干预可能为未来哮喘靶向性治疗提供依据。