一起副溶血性弧菌食物中毒的调查研究

目的 探讨如何调查一起食物中毒的原因。方法 根据患者临床表现,对2017年1月7日某婚宴酒店进行现场流行病学调查,具体采集环境和物表样本、从业人员和病例肛拭子、粪便、呕吐物等,同时根据卫生学调查结果结合现场采集样本的实验室结果进行综合判断。结果 本次发生食物中毒患者共27例,罹患率为29.03%（27/93）,多名患者排泄物检出副溶血性弧菌。结论 处理食物中毒事件采样时应采集剩余食品、环境与物表样本、从业人员样本、病例样本（特别是重症病例和首发病例）这四类样品,只有足量采集到这四类样本,才能确定致病因子,找出污染源和污染途径。     

快速检测副溶血弧菌及其毒力株方法的建立

目的利用实时PCR技术，建立检测副溶血弧菌及其毒力株的方法。方法根据副溶血弧菌的跨膜转录激活蛋白toxR基因序列设计引物和改良分子信标（ROX标记），建立检测所有副溶血弧菌菌株的方法。通过与文献报道的检测直接耐热溶血素（TDH）基因的实时PCR体系合并，建立了同时检测副溶血弧菌及其毒力株的双重实时PCR方法。结果通过对9个属的101株菌株进行试验，所有的52株副溶血弧菌均产生ROX阳性信号（toxR’），其余菌株均检测为阴性，其中46．2％（24／52）的副溶血弧菌产生HEX阳性信号（tdh^＋）。检测toxR基因的实时PCR体系DNA灵敏度为10～100fg／PCR体系，菌液灵敏度为59．2～592CFU/ml或2．96～29．6CFU／PCR体系。另外成功构建了双重实时PCR体系，能同时对副溶血弧菌的toxR和tdh基因进行检测。结论建立的双重实时PCR体系能同时检测副溶血弧菌及其毒力株，从而为食品的安全检疫提供有效手段。     

番禺区水产品副溶血性弧菌污染调查

目的了解番禺区水产品副溶血性弧菌（Vibrio parahae molyticus,VP）的污染状况。方法随机从番禺区的水产批发市场、零售市场和餐饮单位采集各类水产品样品,按照《食品卫生微生物学检验副溶血性弧菌检验》（GB／T4789．7—2008）标准对VP进行定性和定量的检测。结果103份样品中有15份检出VP．检出率为14．6％。各类场所VP检出率差异无统计学意义（P〉0．05）。淡水水产品和海水水产品VP检出率差异无统计学意义（P〉0．05）。采集的4类水产品中虾蟹类的VP检出率最高（34．8％）,生吃水产品未检出VP,4类水产品VP检出率差异有统计学意义（χ^2=14．49,P〈0．05）。阳性样品中VP的平均浓度为7．6MPN／1g,虾蟹类样品的VP浓度明显高于鱼类,但与贝壳样品相比差异无统计学意义。结论番禺区水产品VP的污染情况较为突出,应加强对水产品VP的主动监测。     

一起副溶血性弧菌食物中毒的现场流行病学调查分析

目的查明一起食物中毒事件的发生原因和可疑危险因素来源。方法通过流行病学曲线及回顾性队列研究查找可疑餐次,对可疑餐次食物开展病例对照研究,分析食用不同食物与食物中毒的关联性,并采集可疑食物和病例等标本进行实验室检测。结果共发现87例病例,症状主要为腹泻（96.5%）、腹痛（91.9%）、呕吐（44.8%）、发热（32.2%）。20日午餐（RR=21,95%CI=9.2~47）、晚餐（RR=4.9,95%CI=3.3~7.3）均是本次疑似食物中毒的暴露餐次。烧鸭（OR=26,95%CI=5.7~118）和白切鸡（OR=21;95%CI=2.5~180）是发病的危险因素。厨师在对白切鸡及烧鸭切块过程中发生交叉污染可能是此次食物中毒的感染环节。病例肛拭子检测为副溶血性弧菌阳性。结论食用被副溶血性弧菌污染的白切鸡和烧鸭是导致本次食物中毒的主要原因,建议加强对餐饮机构厨师的监督管理,提高其卫生安全意识,防止类似事件再次发生。     

食物中毒中分离的副溶血性弧菌的分子分型研究

目的运用脉冲场凝胶电泳（PFGE）技术研究深圳市罗湖区2005-2007年食物中毒事件中分离获得的49株副溶血性弧菌的分子流行情况。方法样品采用荧光PCR与传统分离培养同时检测,对分离获得的副溶血性弧菌阳性菌株进行脉冲场凝胶电泳（PFGE）,BioNumerics软件对图谱进行聚类分析。结果 49株副溶血性弧菌中,有12株不能分型,其余36株副溶血性弧菌分离株大致可分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ3个群,相同血清型的菌株其PFGE型大致相同,同一起食物中毒的菌株间有较高的相关性。结论罗湖区副溶血性弧菌食物中毒存在流行克隆株,PFGE分子分型技术在食物中毒追踪溯源方面有重要提示性作用。     

三种副溶血性弧菌分子检测试剂盒的评价

目的综合评价国内三种副溶血性弧菌商品试剂盒的检测效果。方法选用TIANDA公司的副溶血性弧菌PCR检测试剂盒、TAITAIGEN公司的副溶血性弧菌Real-timePCR检测试剂盒和HF公司的副溶血性弧菌LAMP检测试剂盒,以10倍稀释梯度的标准菌液确定各种试剂盒检出限;以国标法为标准,评价每种试剂盒的灵敏度、特异度和符合率;最后比较三种试剂盒的耗时、成本和操作性。结果 PCR、Real-timePCR和LAMP检测试剂盒的检出限分别为1.18×103cfu/ml、11.8cfu/ml和11.8cfu/ml;在74份海产品检测中,三种试剂盒的灵敏度分别为100%、100%和100%;特异度分别为56%、48%和50%;符合率分别为70%、65%和66%;三种试剂盒检测结果之间差异无统计学意义（P=0.074）;耗时分别为120、80和80min;成本分别为：10、40和45元/次;操作性从难到易排列依次为PCR、Real-timePCR和LAMP检测试剂盒。结论三种分子检测试剂盒的灵敏度高,特异度较低,操作简便,可推荐作为副溶血性弧菌检测的初筛方法。     

肠道细菌基因间重复序列基因分型方法研究副溶血性弧菌的基因多态性

目的 采用肠道细菌基因间重复序列(enterobacterial repetitive intergenic consensus,ERIC)基因分型技术对副溶血性弧菌进行分型,评估其基因多态性,探讨其在鉴别该菌散发和暴发中的应用.方法 采用ERIC-PCR分型方法对187例分离自患者、海产品和环境中的副溶血性弧菌基因组模板进行扩增,根据PCR产物中不同产物片段组合模式获得基因型,采用进化树分析软件直观评价不同基因型的相似性,并根据离散程度分为不同的族,同时进行血清分型.结果 187例菌株可获得产物长度160～2780 bp共16种大小不同的PCR产物片段,所有菌株根据扩增片段分布可分为59种基因指纹模式,通过进化树软件可分为12族,血清分型结果表明O3∶K6为86％ (161/187),O2、O4和O12占4％ (8/187),10％ (18/187)无法分型.结论 ERIC-PCR分型结果表明,我国分离的副溶血性弧菌具有较高基因多态性,ERIC-PCR具有高分辨力,可用于快速基因分型.     

副溶血性弧菌直接溶血毒素基因的原核表达及产物的性质

目的 实现副溶血性弧菌直接溶血毒素tdh基因在大肠杆菌中的表达,鉴定表达产物在生物学活性和免疫原性。方法 构建tdh基因的原核表达系统NWⅡ（tdh/Trc99A/JM109),并在30℃条件下,用0.8mmol/L IPTG诱导表达。用SDS－PAGE分析蛋白表达;溶血试验检测表达蛋白的溶血活性。将表达产物腹腔注射免疫兔,用试管凝集反应试验检测特异性抗体。用溶血抑制试验检测该抗体体外对TDH溶血活性的抑制作用。结果 NWⅡ在上述条件下诱导后,TDH呈可溶性、融合性表达。SDS－PAGE表明,表达蛋白的相对分子质量（Mr)约23000。薄层扫描显示,细菌的周质腔中的蛋白量最高,占总蛋白的13．4％。溶血试验表明,表达的蛋白具有溶血活性。用表达蛋白免疫兔产生的相应抗体,在体外具有抑制TDH溶血活性的作用。结论 tdh基因在原核表达系统Trc99A/JM109中获得成功表达,为基因工程大规模制备TDH抗原,制备抗TDH的多克隆和／或单克隆抗体,构建基因工程菌苗,阐明该菌的致病机制打下了基础。     

广东地区副溶血性弧菌暴发分离优势血清型菌株的分子特征

目的 研究广东地区多宗副溶血性弧菌暴发分离的优势血清型(O3:K6、O1:Kut、O4:K8)株的毒素基因携带情况、“大流行群”株分布特征以及不同血清型株之间的相关性.方法 对2008-2010年23起副溶血性弧菌暴发患者临床样本和当餐食品分离的62株优势血清型进行tdh、trh基因检测及“大流行群”鉴定(GS-PCR...     

副溶血性弧菌鞭毛蛋白单克隆抗体的制备及其活性分析

目的 制备副溶血性弧菌鞭毛蛋白单克隆抗体(mAb)并建立双抗夹心ELISA.方法 采用差速离心法提取副溶血性弧菌ATCC 17802菌株的鞭毛蛋白,并以此为抗原免疫BALB/c小鼠,抗血清效价达到1∶32 000时,取脾细胞与生长良好的对数期Sp2/0骨髓瘤细胞进行融合.多次克隆化培养后获得杂交瘤细胞株并制备腹水,纯化后得到抗体.结果 获得6株持续、稳定分泌抗副溶血性弧菌鞭毛蛋白mAb的杂交瘤细胞株,命名为VpNo.1～VpNo.6,抗体效价高达1∶2×106.对抗体进行了Ig类和亚类检测以及Western blot法鉴定,其Ig亚类依次为IgGl、IgG1、IgM、IgG1、IgG2a和IgM.SDS-PAGE结果显示,提取出的鞭毛蛋白相对分子质量(Mr)为42 000并且纯度较高.采用VpNo.6抗体建立了副溶血性弧菌双抗夹心ELISA,该方法的检测灵敏度达到103 CFU/mL菌液,通过采用134株副溶血性弧菌和74株非副溶血性弧菌进行特异性实验,结果表明134株副溶血性弧菌呈阳性反应,74株非副溶血性弧菌呈阴性反应,VpNo.6抗体具有非常好的特异性.在基质添加试验中,最低检出限为21CFU/g样品.结论 成功制备了副溶血性弧菌鞭毛蛋白mAb,并将其应用于双抗夹心ELISA,该方法的检测灵敏度达到1×103 CFU/mL菌液,与所测试的非副溶血性弧菌没有交叉反应.     

珠江河口外环境及海（水）产品副溶血弧菌研究

目的了解广州珠江河口地区不同生态环境中副溶血弧菌（Vp）的分布情况,为Vp型污染防控提供可靠的依据。方法根据广州珠江河口地区水网主要特征进行监测,定量分析按照GB/T4789-2003中的方法进行;阳性菌株采用荧光定量PCR法进行毒力基因的检测。结果外环境及海水产品Vp总阳性率为34.10%（671/1968）;水产品的阳性率为47.50%（114/240）,水体总阳性率为27.27%（373/1368）,淤泥和水草等环境样本的阳性率为51.11%（184/360）,大部分（118/120）不携带毒力基因。外环境Vp检出率与水体深度、潮汐、水温、pH、盐度等有关。结论广州珠江河口地区海（水）产品、海水等外环境中Vp污染严重,其中以贝壳类海产品最高,海水中污染率高于其他环境水体。     

副溶血弧菌TDH单克隆抗体的研制与性质鉴定

目的:制备副溶血弧菌耐热直接溶血毒素TDH单克隆抗体,并分析其免疫学特性。方法:用纯化的TDH毒素蛋白作为免疫原免疫BALB/c小鼠,取免疫小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合,用间接ELISA方法进行阳性细胞筛选,有限稀释法进行亚克隆。并对该单克隆抗体进行了分子量大小、效价、亚类、特异性和亲和力分析。结果:筛选出一株能够稳定分泌TDH单克隆抗体的杂交瘤细胞株命名为T9H4,其免疫球蛋白亚型鉴定为IgG1,亲和力常数可达2.19×109L/mol,并表现出较强的特异性。抗体纯化后效价达1∶1 024 000,SDS-PAGE电泳结果显示单抗蛋白重链分子量约为50 kD和轻链23 kD。结论:成功获得一株能稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞,为开发免疫学快速检测方法提供重要实验基础。     

深圳西乡2007-2009年腹泻患者中副溶血弧菌感染情况

目的掌握本地区腹泻患者中副溶血弧菌的构成,了解该菌流行季节及血清型的变迁趋势。方法采集在西乡医院就诊的腹泻患者粪便标本2 588份,对致病菌进行分离、培养和鉴定,并对分离出的585株副溶血弧菌感染年龄段、流行季节及血清学进行分析。结果副溶血弧菌是本地区的主要致病菌,阳性率以10～20岁年龄组最高,10岁以下的年龄组最低,且不同年龄组间阳性率差异有统计学意义（χ2=235.32,P〈0.001）。副溶血弧菌的发病率在秋季达高峰,血清型以03：K6为主。结论副溶血弧菌是本地区的主要病原菌,以03：K6血清型为主,3年均以秋季高发,易感人群以青壮年为主。