包裹E1A基因的纳米粒子制备及转染人肺腺癌细胞A549实验研究

目的制备包裹E1A基因（腺病毒早期表达基因）的纳米粒子,并观察其介导E1A基因转染人肺腺癌细胞A549的可行性和效率。方法应用聚乳酸聚乙醇酸共聚物和聚乙烯醇包载E1A基因,制备纳米级粒子混合物,检测其包埋率、体外释放情况及粒径大小。用制备的包裹DNA纳米粒子转染人肺腺癌细胞A549,并以阳离子脂质体为对照,用PCR、RT-PCR方法分别检测转染细胞中E1A基因DNA整合和mRNA表达。结果制备的纳米粒子粒径为150～280nm,包埋率为0.78%,体外释放约为22d;在转染相等质量的DNA情况下,纳米组所得克隆数较脂质体组多（P〈0.05）;PCR、RT-PCR结果表明纳米粒子和脂质体转染细胞均有E1A基因整合和mRNA表达。结论成功制备了纳米粒子,纳米粒子可携带外源基因进行基因转染。     

外源性FHIT基因表达对肺腺癌细胞株A549恶性表型的逆转作用

目的 探讨FHIT（fragile histidine triad)基因表达在肺癌细胞增殖、凋亡、成瘤性中的作用。方法 应用脂质体转染法构建能高效表达外源性FHIT基因的A549－FHIT细胞和作为空载体对照的A549－vector细胞，裸鼠皮下接种构建肺癌移植瘤动物模型，应用逆转录－PCR、Western杂交、免疫组化、流式细胞计数等技术检测外源性FHIT基因转录、表达及对肺癌细胞株增殖、凋亡、成瘤性等的影响。结果 A549－FHIT细胞的生长曲线、克隆形成率、移植瘤体积和重量均显著低于A549－vector和亲本A549细胞；A549－FHIT细胞凋亡水平显著高于A549－vector和亲本A549细胞；与两个对照组相比，A549－FHIT细胞G0／G1比例显著增高。结论 外源性FHIT表达基因能够显著抑制肺癌细胞增殖和分裂，诱导其凋亡，抑制其成瘤性，提示FHIT基因在肺癌中具有抑癌基因的功能。     

低氧通过上调乙酰辅酶A羧化酶1促进肺腺癌A549细胞迁移

目的 探讨低氧通过乙酰辅酶A羧化酶1(ACC1)促进入肺腺癌A549细胞迁移的机制.方法 低氧(5％O2)处理肺腺癌A549细胞,应用Transwell迁移实验检测细胞迁移能力,Western blotting检测ACC1表达及上皮-间质转化(EMT)相关蛋白的表达水平.结果 与常氧(对照组)相比,低氧处理促进了A54...     

反义Bmi-1 RNA转染对人肺癌细胞株A549体外增殖的影响

目的 研究转染反义Bmi-1 RNA对人肺腺癌细胞A549的体外增殖及细胞周期和凋亡的影响.方法 将表达反义Bmi-1 RNA的真核表达载体稳定转染A549细胞株,GA18筛选挑取阳性克隆.应用即时荧光定量RT-PCR及Western blot检测转染后Bmi-1基因在mRNA水平及蛋白水平的表达;应用MTT比色法及平板克隆形成实验检测A549细胞体外生长能力;用PI单染及Annexin-V-PI双染技术在流式细胞仪上检测细胞周期及凋亡情况.结果 Western blot结果显示转染反义Bmi-1RNA使A549细胞中Bmi-1蛋白表达量减少了95%;MTT检测细胞生长曲线表明反义Bmi-1 RNA使A549细胞生长速度明显减慢;平板克隆形成实验结果显示转染反义Bmi-1 RNA的A549细胞在平板中形成集落的数目(0.67±0.50)明显低于未转染组(73.0±4.1)及转染空质粒组(67.0±4.0,P<0.01);流式细胞仪结果显示反义Bmi-1使A549细胞阻滞在G_0/G_1期,但对细胞凋亡没有影响.结论 反义Bmi-1 RNA在体外对A549细胞增殖有明显的抑制作用,其抑制作用是通过使A549细胞阻滞在G0/G1期实现的.     

nm23-H1基因对人肺腺癌A549细胞增殖和侵袭的抑制作用

目的:研究转染nm23-H1基因对体外培养A549细胞增殖和侵袭的抑制作用及其机理。方法:构建nm23-H1基因的真核表达载体,转染到体外培养的人肺腺癌细胞A549中,通过G418筛选出稳定表达克隆,RT-PCR及免疫组化检测nm23-H1在细胞内的表达情况。绘制细胞生长曲线检测nm23-H1基因对细胞生长的影响,流式细胞仪检测细胞周期,原子力显微镜观察细胞膜表面伪足的超微结构。结果:转染后的肿瘤细胞能稳定表达nm23-H1基因,抑制了肿瘤细胞的增殖。nm23-H1基因没有诱导细胞凋亡但使G1期细胞增加而S期细胞减少,停滞于G0期。转染nm23-H1基因后细胞边缘的伪足减少。结论:nm23-H1基因能抑制体外培养的A549肿瘤细胞的增殖,可能通过改变细胞表面结构减弱细胞的侵袭能力。     

纳米羟基磷灰石可介导转染人肺癌A549细胞

目的 探讨纳米羟基磷灰石（nHAP）介导带有增强型绿色荧光蛋白（EGFP）基因的pGenesil-1质粒转染人肺癌A549细胞的可行性。方法 用均相沉淀法制备nHAP;透射电镜观察纳米粒结构;经超声分散及碳酸钠预处理后,在pH值7.4环境下应用多聚赖氨酸（PLL）修饰nHAP;实验分为nHAP-PLL组、脂质体组及对照组,分别配制转染复合物并转染A549细胞;荧光显微镜观察EGFP的表达;流式细胞仪检测pGenesil-1的转染率。结果 透射电镜下nHAP呈针状颗粒,粒径较均匀,约（15~20）nm×（60~80）nm,分散程度良好;nHAP-PLL组和脂质体组均见EGFP表达阳性的A549细胞,对照组未见EGFP表达阳性的A549细胞;nHAP-PLL组pGenesil-1转染A549细胞的转染率为(31.8±1.9)%,与脂质体组的转染率 (33.4±3.7)%无差异（P>0.01）,对照组未见转染阳性的A549细胞。结论 nHAP经PLL表面修饰后可介导人肺癌A549细胞基因转染。     

Survivin siRNA对人肺腺癌A549细胞增殖影响实验研究

目的：探讨慢病毒载体介导survivin siRNA对人肺腺癌A549细胞增殖的影响及其作用机制，为肺癌基因治疗新策略提供帮助。方法:构建表达survivin-siRNA的慢病毒载体感染A549细胞株，测定病毒滴度。采用RT-PCR、免疫组化及Western blotting等检测感染后不同分组A549细胞survivin-mRNA和蛋白的变化及caspase-3蛋白的变化，通过流式细胞仪及MTT法检测感染后A549细胞周期及生长曲线。结果: RT-PCR及Western blotting检测显示，转染细胞(MOI=150)中survivin基因mRNA和蛋白的表达明显降低，抑制率分别为97%、88%；细胞生长曲线和周期结果显示转染组细胞增殖明显减慢，G1期细胞比例明显增加，S期细胞比例则明显减少；转染细胞中caspase-3被激活。结论: 慢病毒载体介导的siRNA能有效抑制人肺腺癌A549细胞survivin基因的表达和细胞增殖，有效激发细胞凋亡，有望成为肺腺癌基因治疗的新策略之一。     

短期机械拉伸加载对人肺腺癌细胞A549细胞的增殖效应

目的测量人肺腺癌细胞株A549对机械拉伸加载的短期响应。方法用加载Flexercell-4000TTM系统在4h内对A549细胞进行正常生理参数范围的应变刺激,并测量细胞的增殖效应。结果细胞的增殖率均有不同程度的提高,增殖响应系数M(%)为:0.5h,M=18%;1h,M=22%;4h,M=5%。结论研究证明细胞对短期加载的增殖响应与人成骨细胞特征相似,在1800循环数左右有一峰值,间歇式加载能保持长期高增长率,而过去的研究表明连续加载相反,只会抑制细胞的增长。     

HIF-1α介导了间歇低氧对人肺腺癌A549细胞体外生物学行为的影响

目的:探讨缺氧诱导因子1α(HIF-1α)是否介导间歇低氧对人肺腺癌A549细胞体外活力、凋亡以及侵袭的影响。方法:采用体外转染方法将特异性针对HIF-1α的siRNA导入A549细胞,在间歇低氧条件下培养后通过real-time PCR和Western blot法检测HIF-1α及其下游Bcl-2、Bax、P53、P21、VEGF的mRNA和蛋白表达;通过MTT法和流式细胞术分别检测A549细胞的活力、凋亡及细胞周期;通过Transwell小室检测A549细胞的侵袭能力。结果:未转染HIF-1α-siRNA的A549细胞[间歇低氧空白对照组(IHC组)、间歇低氧空载体对照组(IHE组)及间歇低氧阴性对照组(IHN组)]经间歇低氧干预后的HIF-1α、Bcl-2及VEGF表达均明显高于常氧对照组(RA组),Bax及P21表达均明显低于RA组(P0.05),而转染HIF-1α-siRNA的A549细胞[间歇低氧siRNA组(IHS组)]较IHC组、IHE组及IHN组经间歇低氧干预后的HIF-1α、BCL-2及VEGF表达均明显下调,Bax及P21表达较均明显上调(P0.05);所有间歇低氧组A549细胞的P53表达均较RA组升高(P0.05),但各间歇低氧组之间无显著性差异。IHC组、IHE组及IHN组A549细胞经间歇低氧干预后较RA组的细胞活力增强,凋亡率下降,侵袭力增强(P0.05),而IHS组A549细胞经间歇低氧干预后细胞周期被阻滞于G1期,较未转染组的细胞活力下降,凋亡增加,侵袭能力下降(P0.05)。结论:间歇低氧可通过HIF-1α途径调控其下游基因表达进而促进A549细胞的活力和转移;通过RNA干扰技术造成HIF-1α基因沉默可以抑制间歇低氧引起的A549细胞生长和转移。     

乏氧条件下坎地沙坦增加肺腺癌A549细胞放射敏感性

目的:探讨乏氧条件下坎地沙坦对肺腺癌A549细胞放射敏感性的影响及其机制.方法:将A549细胞分为常氧组、乏氧组和坎地沙坦+乏氧组,ELISA检测血管紧张素Ⅱ(Ang Ⅱ)的表达,Western blot检测乏氧诱导因子1α(HIF-1α)、P53和P21的表达,流式细胞术检测细胞周期分布,CCK-8检测细胞增殖,克隆...     

人B7-H3基因转染及其生物学功能的研究

B7 H3是新近发现的B7家族新成员。为探讨其体外生物学功能及单克隆抗体的研制构建了B7 H3基因转染细胞。利用PCR的方法扩增出B7 H3基因 ,继而插入逆转录病毒载体pGEZ Term ,重组逆转录病毒载体与两个辅助病毒载体脂质体法共转染包装细胞 2 93T ,经用含有完整病毒颗粒的 2 93T细胞的培养上清感染L92 9细胞 ,Zeocin筛选获得B7 H3的基因转染细胞。RT PCR、Westernblot和流式细胞仪表型分析等方法鉴定表明 ,B7 H3/L92 9基因转染细胞能稳定表达人B7 H3蛋白。继而基因转染细胞对T细胞体外培养试验显示该基因转染细胞与T细胞共培养可抑制其体外增殖。ELISA法分析表明该基因转染细胞抑制活化T细胞IFN γ及IL 10的分泌。CD2 8信号可以逆转B7 H3对活化T细胞的抑制效应。综上结果证实 ,B7 H3对体外活化的T细胞具有负性调控作用。     

导入TAP基因上调其在肺腺癌细胞系的表达

目的　克隆TAP1及TAP2基因 ,分别转染TAP1及TAP2表达下调的人肺腺癌细胞系Anip973,以提高其表达水平 ,从而增强肿瘤细胞的抗原提呈能力。方法　采用RT PCR方法自EBV刺激的B LCLs克隆TAP1及TAP2基因 ,与pcDNA3.1 V5 His TOPOTAExpressionvector连接 ,构建真核细胞表达载体 ,脂质体法 (LipofectamineTM2 0 0 0 )转染人肺腺癌细胞系Anip973,经G4 1 8筛选 4～ 6周 ,通过RT PCR检测TAP1及TAP2的表达。结果　经测序确认已成功克隆人TAP1及TAP2基因 ,建立稳定表达TAP1或TAP2的细胞系 ,经RT PCR分析 ,Anip973细胞TAP1、TAP2的mRNA表达明显增加。结论　基因转染可恢复肿瘤细胞TAP1及TAP2的表达 ,为增强MHCⅠ类分子提呈肿瘤抗原奠定了基础     

稳定表达组织型纤溶酶原激活因子基因的人脐静脉内皮细胞株的建立

为建立稳定表达组织型纤溶酶原激活因子(t-PA)基因的人脐静脉内皮细胞株,为其在基因修饰的组织工程血管中的应用奠定基础。首先构建t-PA基因的真核表达载体pcDNA3.1-Myc-HisB(-)/t-PA,将该表达载体用阳离子脂质体介导,转染人脐静脉内皮细胞系细胞,经G418筛选,获得阳性细胞克隆,扩增后分别用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)、免疫印迹(Western-blotting)检测t-PA转录和蛋白表达水平,用底物发色法检测t-PA的活性。逆转录聚合酶链反应检测出了t-PA的稳定转染细胞克隆,免疫印迹证实该克隆细胞有含Myc标签的t-PA蛋白表达,底物发色法检测发现其表达产物的活性增加。结果证明成功建立了稳定表达t-PA基因的人脐静脉内皮细胞株。     

mB7-1转染大鼠卵巢癌细胞诱导细胞免疫应答及体内致瘤性研究

为探讨转染mB7 1基因大鼠卵巢癌细胞系后体外诱导细胞免疫应答及其致瘤性 ,我们以逆转录病毒为载体将mB7 1基因转染入大鼠低分化卵巢上皮癌细胞株NuTu 19中 ,流式细胞仪检测mB7 1的表达。用同源淋巴细胞肿瘤细胞混合培养实验 (MTLCs)测定淋巴细胞增殖指数 ,MTT法检测细胞毒淋巴细胞的增殖及其杀瘤活性。将NuTu 19/Neu、NuTu 19/mB7 1细胞分别接种于同源大鼠Fischer344皮下 ,观察mB7 1修饰的肿瘤细胞在动物体内的致瘤性。结果显示 ,mB7 1基因成功地转染入大鼠低分化卵巢上皮癌细胞株NuTu 19,流式细胞仪测定mB7 1基因呈阳性表达。NuTu 19/mB7 1体外刺激脾淋巴细胞增殖能力明显高于对照组细胞 (P <0 0 5 )。NuTu 19/mB7 1体外诱导的CTL较对照组对NuTu 19细胞的杀伤率显著增高 (P<0 0 1)。两种细胞体外增殖能力无明显改变 ,NuTu 19/mB7 1组在Fischer344大鼠体内成瘤时间明显晚于对照组 (P <0 0 5 )。由此可见 ,mB7 1基因修饰的鼠卵巢癌细胞可体外诱导细胞免疫应答 ,接种动物后 ,实验瘤苗的致瘤性下降     

人p27^kip1基因的克隆及其真核表达载体的构建

目的克隆人p27^kip1基因并构建其真核表达载体，为进一步研究其功能奠定基础。方法根据p27^kip1已知序列设计引物，分别在上下游引入Mlu I和Spe I酶切位点，从人肾脏组织中提取总RNA，经逆转录PCR得到cDNA，亚克隆入携带GFP报告基因的pWPXL真核载体中，经筛选获得正确的克隆，并通过双酶切凝胶电泳及测序鉴定。将成功构建的质粒在脂质体介导下转染肾癌786．0细胞，并通过RT—PCR及Western-blot检测表达情况。结果克隆了人p27^kip1基因，与GenBank中序列比对无误；真核表达载体经酶切鉴定表明为正确重组子，成功构建了真核表达载体。转染肾癌786-0细胞48h后，p27^kip1蛋白出现高表达。结论成功克隆了p27即基因，构建了其真核表达载体并在肾癌细胞中成功表达，为p27^kip1在肾肿瘤中的进一步研究提供了工作基础。     

转入IL-18 cDNA的鼻咽癌细胞在hu-PBL-SCID鼠中致瘤性的影响

为了探讨人白细胞介素 18(hIL 18)的表达对鼻咽癌细胞体内致瘤性的影响 ,我们构建了hIL 18的真核表达载体pcD NA3/hIL 18,转染人鼻咽癌细胞株SUNE细胞 ;然后以转染阳性的SUNE细胞和未转染的SUNE细胞接种到用健康人外周血白细胞免疫重建的SCID鼠 (hu PBL SCID鼠 ) ,观察成瘤情况。结果发现 ,所构建的真核表达载体在鼻咽癌细胞中能高效表达hIL 18;ELISA法测得转染阳性细胞培养上清液中hIL 18的含量为 (85± 10 )pg/ml,而未转染的SUNE细胞的培养上清液中hIL 18的含量低于 5pg/ml。将转染阳性的细胞克隆和未转染的SUNE细胞接种hu PBL SCID小鼠后连续观察 5 0d ,发现前者形成的肿瘤其生长速度明显慢于后者 ,其平均瘤重也有显著性差异 (P <0 0 0 1)。说明在体内hIL 18的表达能有效地抑制鼻咽癌细胞的成瘤作用。     

端粒酶催化亚单位基因启动子调控Hsv-tk/GCV系统对肺癌细胞A549选择性杀伤作用的研究

目的研究人端粒酶催化亚单位(human telomerase catalytic subunit,hTERT)基因启动子调控单纯疱疹胸苷激酶/更昔洛韦(herpes simplex virus-thymidine kinase/ganciclovir,Hsv-tk/GCV)治疗系统对人肺癌细胞株A549的选择体外杀伤作用。方法(1)用脂质体法将hTERT启动子和sv40启动子调控的tk基因表达质粒(pGL3-hTp-tk和pGL3-sv40-tk)转染端粒酶阳性的人肺腺癌细胞株A549及端粒酶阴性的人胚肺成纤维细胞株MRC-5,用逆转录-PCR方法检测转染细胞中tk基因的表达情况;(2)用MTT法检测GCV对上述转染细胞体外增殖的抑制作用;(3)用流式细胞仪检测GCV对上述转染细胞凋亡和细胞周期的影响。结果(1)转染pGL3-sv40-tk的细胞A549、MRC-5和转染pGL3-hTp-tk的A549均有tkmRNA表达,转染pGL3-hTp-tk的MRC-5无tkmRNA表达;(2)GCV对转染pGL3-sv40-tk的细胞A549、MRC-5和转染pGL3-hTp-tk的A549体外增殖均有明显抑制作用,对转染pGL3-hTp-tk的MRC-5无明显抑制作用;(3)转染pGL3-sv40-tk的A549、MRC-5和转染pGL3-hTp-tk的A549细胞,GCV处理后细胞凋亡指数(21.58%、9.35%和23.19%)均显著高于转染pGL3-hTp的A549和MRC-5细胞(0.78%和0.55%)及空白对照A549和MRC-5细胞(2.17%和0.60%),转染pGL3-hTp-tk的MRC-5细胞凋亡指数(0.88%)无明显升高。结论hTERT启动子调控Hsv-tk基因可以在肺癌细胞中选择性表达,hTERT调控的Hsv-tk/GCV治疗系统对肺癌细胞体外增殖具有靶向性抑制作用。     

腺病毒介导突变Rip2基因对膀胱上皮细胞清除克雷伯杆菌的影响

目的探讨受体相互作用蛋白2（Rip2）在克雷伯杆菌所致的尿路感染中的作用。方法使用含有突变Rip2基因（mRip2）、绿色荧光蛋白（GFP）基因的复制缺陷腺病毒（Ad-mRip2-GFP）感染人膀胱上皮癌细胞T24细胞，表达GFP为转染成功标志，观察转染率，同时感染含有GFP基因腺病毒做对照，利用克雷伯杆菌临床分离株Kp5与细胞37℃孵育4、24、48小时，用平板培养菌落计数活菌数。结臬刺激后，在感染Ad-mRip2-GFP的T24细胞清除胞内Kp5能力下降，与Ad-GFP组比较P〈0．01。结论Rip2可以阻断膀胱上皮细胞的清除克雷伯杆菌作用，提示Rip2在膀胱上皮细胞的天然免疫中可能起重要作用。