兔肌源性干细胞的分离及诱导分化为成骨细胞的观察

目的：探讨兔肌源性干细胞的分离、鉴定和诱导分化的方法。方法：取2月龄幼兔臀肌1g，采用胶原酶，dispase，胰蛋白酶分步消化，针头过滤，差速贴壁法分离肌源性细胞。用锥虫蓝染色细胞计数描记生长曲线，MTT法间接反映细胞增殖活性。作Bc1-2，Desmin免疫细胞化学染色鉴定肌源性细胞。用分化培养基(DMEM 5mL／L FBS 50mL／L HS 10mg／L BMP2 5g／L 维生素C 10mmol／L β-甘油磷酸钠＋10mg／L 地塞米松 10g／L 青霉素／链霉素)诱导细胞分化，用Osteocalcin，碱性磷酸酶，Ⅰ型胶原免疫细胞化学染色鉴定成骨前体细胞。结果：用上述方法分离的肌源性细胞呈短梭形或多角形，体积明显小于肌细胞，24h贴壁，接种后36h开始增殖，生长有明显的方向性，原代肌源性干细胞对数生长期为7～9d，16d汇合。第3代肌源性干细胞接种后第3～5天为对数生长期，约8d汇合。细胞汇合后少部分细胞出现双核或三核，甚至出现核链，显示肌细胞分化倾向。约60％～70％的原代肌源性干细胞Bc1-2，Desmin免疫细胞化学染色呈阳性。用成骨细胞分化培养基中培养2周后，大部分细胞Osteocalcin碱性磷酸酶，Ⅰ型胶原免疫细胞化学染色呈阳性，显示其成骨前体细胞分化。结论：用上述方法分离的肌源性细胞具有干细胞特征，并能在体外分化为成骨前体细胞和肌起源细胞，是一种组织特异性干细胞，即肌源性干细胞。     

兔肌源性干细胞的生物学特性及表型分析

背景：骨髓间质干细胞作为种子细胞具有巨大的分化潜力和优势，但对于再生障碍性贫血或骨髓源性肿瘤等疾病的应用受限。现已发现肌源性干细胞具备与其相似的优越性，已引起相关领域研究者的注意。目的：观察兔肌源性干细胞的生物学特性，并对其进行表型分析。设计、时间和地点：细胞体外观察，于2005-08／2006-03在中山大学附属第二医院医研中心完成。材料：清洁级1．5月龄新西兰大白兔1只，增殖培养基为DMEM—LG＋体积分数0．1胎牛血清＋100gm/L血清，融合培养基为DMEM-LC＋2％胎牛血清。方法：兔麻醉后取大腿肌肉，采用差速贴壁Preplate技术分离培养肌源性干细胞，以Ⅺ胶原酶、dispase蛋白酶及胰蛋白酶分步消化，沉淀用增殖培养基重悬，接种在胶原包被的培养瓶中，该培养瓶为PP1。PP1于37℃、含体积分数为0．05的CO2培养箱中静置过夜，随后将悬液转移到另一个胶原包被的培养瓶，此为PP2。随后同法建立PP3，PP4，PP5，PP6。将PP6接种到6孔板进行融合实验，分为两组：一组使用增殖培养基培养，在汇合度超过50％后继续培养，不传代；另一组使用融合培养基进行培养，汇合度达30％时传代培养。主要观察指标：收集PP1～PP6，采用流式细胞仪、免疫细胞化学及Western Blot法鉴定细胞表型。通过不同汇合度及不同浓度血清培养，检测PP6融合情况。结果：PP6细胞〉80％为desmin^＋，〉70％为Bcl-2^＋，〉95％为CD45，提示为高浓度肌源性干细胞，随着纯化步骤的进行，α-SMA表达逐渐减弱，至高度纯化的PP6时己无α-SMA表达。PP6在高汇合度（〉50％）或低血清（仅含2％血清）培养时，极易融合成肌管或肌细胞链，骨骼肌肌球蛋白呈阳性表达。结论：肌源性干细胞具有高水平表达desmin，Bcl-2，极低水平表达CD45，不表达α-SMA的生物学特性，在高汇合度或低血清培养条件下能够多向分化。     

大鼠阴茎海绵体肌源性干细胞的分离及鉴定

背景:前期研究在大鼠阴茎海绵体组织中检测到了具有干细胞标志物及肌源性标志物的干细胞.目的:在前期研究基础上,对大鼠阴茎海绵体肌源性干细胞进行分离及表型鉴定.方法:取2月龄SD大鼠阴茎海绵体组织,采用Ⅰ型胶原酶、胰蛋白酶消化分离组织,采用Preplate差速贴壁技术对细胞进行初步纯化,获得PP1~PP6贴壁细胞,并进行流式细胞仪检测、免疫荧光细胞化学鉴定及Western blotting检测.结果与结论:连续6步差速贴壁分离后,PP1~PP6细胞贴附能力逐渐减弱,PP6细胞两三天后开始贴壁形成圆形或梭形.流式细胞仪检测PP6细胞中干细胞抗原1(+)5.7%、胚胎抗原(+)2.6%、结蛋白(+) 41.2%.免疫荧光细胞化学显示仅有少量细胞分别表达干细胞抗原1和胚胎抗原,均散在分布,干细胞抗原1主要表达于胞浆,胚胎抗原主要表达于胞核,表达结蛋白的细胞聚集,数量较多,主要表达于胞浆;亦发现有极少量双阳性表达细胞,即干细胞抗原1/胚胎抗原、干细胞抗原1/结蛋白和胚胎抗原/结蛋白.PP1~PP5细胞中未检测到干细胞抗原1及胚胎抗原蛋白明显表达,但在PP6细胞中则检测到干细胞抗原1及胚胎抗原蛋白的表达.结蛋白在PP1~PP6细胞中的表达逐渐增强.提示在大鼠阴茎海绵体中发现具有干细胞及肌源性干细胞表型的细胞.     

大鼠阴茎海绵体肌源性干细胞的分离及鉴定

背景：前期研究在大鼠阴茎海绵体组织中检测到了具有干细胞标志物及肌源性标志物的干细胞。目的：在前期研究基础上,对大鼠阴茎海绵体肌源性干细胞进行分离及表型鉴定。方法：取2月龄SD大鼠阴茎海绵体组织,采用Ⅰ型胶原酶、胰蛋白酶消化分离组织,采用Preplate差速贴壁技术对细胞进行初步纯化,获得PP1~PP6贴壁细胞,并进行流式细胞仪检测、免疫荧光细胞化学鉴定及Western blotting检测。结果与结论：连续6步差速贴壁分离后,PP1~PP6细胞贴附能力逐渐减弱,PP6细胞两三天后开始贴壁形成圆形或梭形。流式细胞仪检测PP6细胞中干细胞抗原1（＋）5.7%、胚胎抗原（＋）2.6%、结蛋白（＋）41.2%。免疫荧光细胞化学显示仅有少量细胞分别表达干细胞抗原1和胚胎抗原,均散在分布,干细胞抗原1主要表达于胞浆,胚胎抗原主要表达于胞核,表达结蛋白的细胞聚集,数量较多,主要表达于胞浆;亦发现有极少量双阳性表达细胞,即干细胞抗原1/胚胎抗原、干细胞抗原1/结蛋白和胚胎抗原/结蛋白。PP1~PP5细胞中未检测到干细胞抗原1及胚胎抗原蛋白明显表达,但在PP6细胞中则检测到干细胞抗原1及胚胎抗原蛋白的表达。结蛋白在PP1~PP6细胞中的表达逐渐增强。提示在大鼠阴茎海绵体中发现具有干细胞及肌源性干细胞表型的细胞。     

兔骨髓间充质干细胞分离培养及体外诱导分化为成骨细胞

【目的】建立兔骨髓间充质干细胞（MSCs）的分离、纯化及鉴定方法,观察体外成骨潜能。【方法】应用密度梯度离心联合贴壁筛选的方法,体外分离培养兔骨髓来源的M SCs ,培养过程中倒置显微镜下观察其生物学特性,流式细胞仪检测细胞表型,所得的细胞进行成骨诱导分化后进行碱性磷酸酶（alkaline phos‐phatase ,ALP）染色及茜素红染色鉴定,并对成骨分化指标进行检测。【结果】原代分离培养的贴壁细胞呈长梭形,漩涡状排列。传代后增殖迅速,细胞为单一的梭形,排列更加有序。培养的细胞CD44呈阳性表达,而CD34呈阴性表达。成骨诱导后ALP染色和茜素红染色均呈阳性。诱导组成骨分化后成骨标志物含量较对照组明显要高。【结论】密度梯度离心结合贴壁的方法可以获得高纯度MSCs ,增殖旺盛,体外具有成骨潜能。     

兔骨髓间充质干细胞体外分离培养及多向诱导分化

背景:间充质干细胞不仅自身免疫原性弱,还可以调节细胞免疫功能,减轻移植物排斥反应,在组织工程中具有良好的应用前景.但骨髓中间充质干细胞含量稀少,约占单个核细胞的十万分之一到百万分之一.目的:建立一种分离、培养扩增兔骨髓间充质干细胞的方法,观察体外培养骨髓间充质干细胞的生长特性,及其潜在的诱导分化能力.方法:采用灌流法获取兔胫骨骨髓,密度梯度离心法联合贴壁培养法体外纯化扩增,相差显微镜观察其形态学特点,MTT法测定绘制传代骨髓间充质干细胞生长曲线,经成骨诱导液(L-DMEN/F12,体积分数为10%胎牛血清,0.1 μmol/L地塞米松,200 μmol/L抗坏血酸,10 mmol/L β-甘油磷酸钠)、成脂诱导液(L-DMEN/F12,体积分数为10%胎牛血清,1 μmol/L地塞米松,200 μmol/L吲哚美辛,0.5 mmol/L IBMX,10 mg/L胰岛素)、成软骨诱导液(L-DMEN/F12,体积分数为10%胎牛血清,10 μg/L转化生长因子β1,0.1 μmol/L地塞米松,50 μmol/L抗坏血酸,6.25 mg/L胰岛素)体外诱导骨髓间充质干细胞向成骨细胞、脂肪细胞及软骨细胞分化,并分别经碱性磷酸酶染色、油红O染色和甲苯胺蓝染色法鉴定.结果与结论:通过密度梯度离心法联合贴壁培养法可在体外大量扩增、纯化骨髓间充质干细胞,所获细胞具有高度自我更新能力和多向分化潜能,原代及传代骨髓间充质干细胞为梭形.经成骨细胞诱导,细胞碱性磷酸酶染色阳性;经成脂肪细胞诱导,细胞内出现红色脂滴,经成软骨细胞诱导,甲苯胺蓝染色阳性.     

兔脂肪干细胞的分离培养及定向诱导为软骨细胞的实验观察

目的:探索从脂肪组织中分离、培养干细胞的方法;研究脂肪干细胞向软骨方向定向诱导的可行性。方法:从成年兔颈后部脂肪组织取材,酶消化法分离、培养脂肪干细胞;免疫荧光测定CD34抗原的表达;诱导培养基定向软骨细胞方向诱导;组化及免疫组化鉴定软骨细胞特性。结果:从兔脂肪组织中能够分离出生长旺盛的干细胞,CD34表达阳性,定向诱导后表现出软骨细胞的特性。结论:从兔颈后部脂肪组织中能够分离出干细胞,并能定向软骨细胞方向诱导,说明脂肪干细胞作为软骨组织工程种子细胞有一定的可行性。     

兔脂肪干细胞的分离培养及定向诱导为软骨细胞的实验观察

目的：探索从脂肪组织中分离、培养干细胞的方法；研究脂肪干细胞向软骨方向定向诱导的可行性。方法：从成年兔颈后部脂肪组织取材，酶消化法分离、培养脂肪干细胞；免疫荧光测定CD34抗原的表达：诱导培养基定向软骨细胞方向诱导；组化及免疫组化鉴定软骨细胞特性。结果：从兔脂肪组织中能够分离出生长旺盛的干细胞，CD34表达阳性，定向诱导后表现出软骨细胞的特性。结论：从兔颈后部脂肪组织中能够分离出干细胞，并能定向软骨细胞方向诱导，说明脂肪干细胞作为软骨组织工程种子细胞有一定的可行性。     

人骨髓间充质干细胞的分离培养及诱导分化成骨细胞的实验研究

目的探讨人骨髓间充质干细胞(MSCs)的分离培养及诱导分化成骨细胞的潜能。方法采用Perco密度梯度离心和贴壁细胞法对MSCs进行分离培养,并观察其形态学特征。在诱导剂诱导作用下,通过形态学观察,采用免疫组化法检测细胞CD44,CD54表型,钙钴法检测ALP活性,Von-Kossa法矿化结节染色,RT-PCR扩增成骨细胞中CBFA I基因表达。结果采用Perco分离的MSCs,CD44,CD54表达阳性,经诱导后细胞出现与成骨细胞相似的形态学特征,ALP合成增多,活性增加,Von-Kossa法矿化结节染色阳性,RT-PCR扩增出165bp CBFA I基因转录片段。结论体外分离纯化培养的MSCs经成骨诱导剂诱导后能向成骨细胞方向分化增殖。     

乳鼠肌源性干细胞向许旺样细胞的诱导分化

背景：有证据显示,肌源性干细胞能够促进肌纤维的再生,增强再生肌组织的功能,并具有分化为神经外膜组织细胞和具有许旺细胞表型细胞的潜能。目的：分析许旺细胞条件培液诱导小鼠乳鼠源肌源性干细胞向许旺细胞的分化,探讨其作为神经组织工程的种子细胞的可行性。方法：取C57BL/6乳鼠四肢骨骼肌,采用改良的Preplate技术纯化培养肌源性干细胞,利用抗体Desmin和Sca-1对纯化后的细胞进行免疫细胞化学鉴定。采用许旺细胞条件培液诱导其向许旺细胞分化,并行许旺细胞特异性抗体S100β、P75NTR免疫细胞化学鉴定。结果与结论：从小鼠骨骼肌中分离得到肌源性干细胞,能在体外稳定增殖传代,Desmin和Sca-1免疫细胞化学染色阳性。肌源性干细胞经体外诱导分化后部分细胞S100β、P75NTR染色阳性。说明应用改良的Preplate方法,可从新生小鼠骨骼肌中分离得到肌源性干细胞;采用许旺细胞条件培液能将其诱导分化为许旺样细胞,有可能成为神经组织工程神经较理想的许旺细胞替代物。     

大鼠肌源性干细胞的分离、纯化和培养

背景:要获得满足临床需要的肌源性干细胞,体外筛选和扩增已成为关键环节.目的:拟建立稳定高效的成年大鼠肌源性干细胞的分离培养、纯化方法.方法:成年SD大鼠麻醉后,无菌条件下取骨骼肌,采用Ⅺ型胶原酶、Dispase和胰酶消化法获得肌源性干细胞,以密度梯度离心法和差速贴壁法进行纯化.记录细胞生长曲线,MTT比色法观察不同接种密度对细胞生长的影响,采用免疫细胞化学染色对细胞进行鉴定.结果与结论:原代肌源性干细胞体积较小,贴壁缓慢,折光性较好,多呈球形、梭形或纺锤形,增殖缓慢.传代培养后,加入含体积分数为20%血清浓度的完全培养基,以1×109L-1密度接种时活细胞数量最多,为适宜接种密度,传1～4代细胞生长状态良好.免疫细胞化学染色结果为desmin(+),CD34(+),CD45(-),Sea-1(+),证实通过体外原代培养获得了高纯度的肌源性干细胞,并成功扩增.     

兔脂肪间充质干细胞分离培养及其向神经细胞分化的特征

目的:分离培养兔脂肪间充质干细胞,探讨兔脂肪间充质干细胞在体外向神经细胞分化的能力。方法:实验于2002-09/2005-09在陕西省干细胞工程技术研究中心完成。选取清洁级新西兰大白兔5只,采用Ⅰ型胶原酶消化兔腹股沟皮下脂肪组织,分离培养脂肪间充质干细胞。取生长状况良好的第2,5,10代细胞,绘制生长曲线,计算细胞群体倍增时间。采用免疫组化方法对脂肪间充质干细胞表面分子标志[CD14,CD29,CD34,CD44,CD45,CD105及人白细胞抗原DR亚类(群)]进行鉴定,并采用1,2.5,5,10mmol/L不同浓度的β-巯基乙醇检测脂肪间充质干细胞向神经细胞分化的能力。结果:①脂肪间充质干细胞生长曲线分析:第2,5,10代细胞体外传代培养的潜伏期约为24～48h,传代培养细胞的对数增殖期为6d,接种后第9天进入平台期。在细胞生长的对数期,脂肪间充质干细胞的倍增时间为64.12h。②脂肪间充质干细胞分子特征的鉴定结果:第2～5代细胞90%以上CD29,CD44,CD105呈阳性表达,而不表达CD14,CD34,CD45及人白细胞抗原DR亚类(群)等表面分子标记。③脂肪间充质干细胞向神经细胞分化情况:体外能够分化为神经细胞。结论:兔脂肪组织可分离培养出脂肪间充质干细胞,并能够向神经细胞分化,有望成为组织工程的种子细胞来源。     

兔脂肪间充质干细胞分离培养及其向神经细胞分化的特征

目的：分离培养兔脂肪间充质干细胞，探讨兔脂肪间充质干细胞在体外向神经细胞分化的能力。 方法：实验于2002-09／2005—09在陕西省干细胞工程技术研究中心完成。选取清洁级新西兰大白兔5只，采用1型胶原酶消化兔腹股沟皮下脂肪组织，分离培养脂肪间充质干细胞。取生长状况良好的第2，5，10代细胞，绘制生长曲线，计算细胞群体倍增时间。采用免疫组化方法对脂肪间充质干细胞表面分子标志[CD14，CD29，CD34，CD44．CD45，CD105及人白细胞抗原DR亚类（群）]进行鉴定，并采用1，2、5，5，10mmol／L不同浓度的β-巯基乙醇检测脂肪间充质干细胞向神经细胞分化的能力。 结果：①脂肪间充质干细胞生长曲线分析：第2，5．10代细胞体外传代培养的潜伏期约为24-48h，传代培养细胞的对数增殖期为6d，接种后第9天进入平台期。在细胞生长的对数期．脂肪间充质干细胞的倍增时间为64．12h。②脂肪间充质干细胞分子特征的鉴定结果：第2～5代细胞90％以上CD29，CD44，CD105呈阳性表达，而不表达CD14，CD34．CD45及人白细胞抗原DR亚类（群）等表面分子标记。③脂肪间充质干细胞向神经细胞分化情况：体外能够分化为神经细胞。 结论：兔脂肪组织可分离培养出脂肪间充质干细胞，并能够向神经细胞分化，有望成为组织工程的种子细胞来源。     

家兔脂肪基质干细胞的分离培养及多向分化诱导

背景:脂肪基质干细胞在人体皮下脂肪中储备充足,体外能快速增殖,具有多向分化潜能,是目前组织工程种子细胞的研究热点.目的:体外分离培养家兔脂肪血管基质部分细胞,并验证其具有多分化潜能.方法:体外分离家兔脂肪血管基质部分细胞,在标准条件下培养,流式细胞仪检测第3代血管基质部分细胞表面标记物CD44,CD29,CD45,取第3代血管基质部分细胞进行成脂、成骨、成软骨诱导,油红O染色鉴定成脂诱导,碱性磷酸酶染色、茜索红染色,Von kossa染色鉴定成骨诱导,Ⅱ型胶原免疫组织化学染色和Ⅱ型胶原mRNA RT-PCR检测鉴定成软骨诱导.结果与结论:原代血管基质部分细胞为短梭形和多角形,第3代血管基质部分细胞为长梭形,流式细胞仪检测提示CD44+,CD29+,CD45,成脂诱导组,染色油红O阳性,成骨诱导组,碱性磷酸酶染色、Vonkossa染色、茜素红染色阳性,成软骨诱导组,诱导14 d Ⅱ型胶原免疫组织化学染色阿利新蓝染色阳性,RT-PCR检测Ⅱ型胶原mRNA显示产物条带较未诱导前信号明显增强.提示体外分离培养的家兔血管基质部分细胞具有干细胞表型,具有向成骨、软骨、脂肪细胞分化的能力,初步鉴定为脂肪基质干细胞.     

胃癌肿瘤干细胞的分离与成脂分化

背景：肿瘤干细胞是否存在于所有肿瘤中仍有争议。目的：从人胃癌细胞中分离并鉴定类肿瘤干细胞,对胃癌的发生机制进行探讨。方法：原代培养胃癌细胞,并通过流式细胞术检测CD44和CD29等细胞因子的阳性表达率,分选阳性细胞进行成脂诱导。结果与结论：胃癌细胞中CD44、CD29的阳性百分率分别为5.67%和5.53%,CD44和CD29阳性细胞具有成脂能力,证明胃癌肿瘤细胞中存在具有分化能力的类肿瘤干细胞。     

胃癌肿瘤干细胞的分离与成脂分化

背景:肿瘤干细胞是否存在于所有肿瘤中仍有争议。目的:从人胃癌细胞中分离并鉴定类肿瘤干细胞,对胃癌的发生机制进行探讨。方法:原代培养胃癌细胞,并通过流式细胞术检测CD44和CD29等细胞因子的阳性表达率,分选阳性细胞进行成脂诱导。结果与结论:胃癌细胞中CD44、CD29的阳性百分率分别为5.67%和5.53%,CD44和CD29阳性细胞具有成脂能力,证明胃癌肿瘤细胞中存在具有分化能力的类肿瘤干细胞。     

应用改良差速贴壁法和有限稀释技术分离培养小鼠来源肌源干细胞

背景:研究者们通过多种方法从肌组织中分离得到肌源干细胞,并应用于各类组织工程和再生医学研究.目的:结合改良的差速贴壁法和有限稀释技术分离小鼠来源肌源干细胞,并培养其单细胞克隆和亚克隆集落.方法:以新生C57BL/6小鼠四肢作为肌组织取材对象,经三重酶消化和细胞筛过滤,运用改良的差速贴壁法分离出肌源干细胞,予细胞特异标记物以免疫组织化学染色;以有限稀释技术克隆培养的方法,获得稳定的肌源干细胞单克隆和亚克隆集落.结果与结论:差速贴壁培养过程中,肌性细胞占比逐渐增高,首次贴壁1 h可以获得足够数量的细胞进行第6次贴壁培养;肌源干细胞需72 h左右贴壁生长,经10 d左右可以增殖为300~500细胞数量的集落,细胞形态以小圆形细胞为主,并有少量梭形细胞,肌源干细胞能够维持形态并持续增殖;应用有限稀释技术可获得肌源干细胞单克隆和亚克隆集落,肌源干细胞克隆细胞均呈现Desmin染色阳性,Sca-1染色阳性,阳性率为(92.3±4.1)%.提示应用preplate法和有限稀释技术可以分离得到小鼠来源肌源干细胞及其克隆集落.