滇龙胆1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶基因GrDXR的克隆、序列分析与原核表达

目的从滇龙胆Gentiana rigescens幼叶中克隆萜类合成关键酶1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶基因GrDXR,进行序列分析和原核表达。方法根据滇龙胆转录组中GrDXR基因序列,设计引物,通过RT-PCR扩增得到GrDXR开放阅读框(ORF)序列,并进行TA克隆、测序和序列分析;构建原核表达载体pGEX-4T-1-GrDXR,转入大肠杆菌Rosetta(DE3)中,在IPTG诱导下进行表达。结果 GrDXR ORF全长1 425 bp,编码474个氨基酸。序列分析表明,GrDXR基因是DXR家族成员;蛋白质序列系统发育分析表明,GrDXR与萝芙木RvDXR、橡胶树HbDXR和长春花CrDXR亲缘关系较近。构建pGEX-4T-1-GrDXR重组质粒,获得稳定的原核表达体系。SDS-PAGE结果表明所表达蛋白与预期蛋白大小一致。结论克隆了GrDXR基因,建立其稳定的原核表达体系,为进一步纯化GrDXR蛋白,研究其结构和功能奠定基础。     

三七GGPPS基因CDS序列克隆及原核表达

目的为研究GGPPS基因在三七中的功能,从三七中克隆GGPPS基因CDS序列,并进行原核表达。方法以3年生三七叶组织为材料,依据Genbank中已报道的GGPPS基因序列设计引物,利用RT-PCR技术,克隆得到编码区序列;克隆片段连接到p ET-30α(+)表达载体,转入大肠杆菌BL21后,在异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导下进行表达。结果三七GGPPS基因CDS序列全长1 032 bp,编码343个氨基酸。SDS-PAGE结果表明,所构建的原核表达载体表达的融合蛋白大小在29 000~44 000,且表达产物主要以不溶性包涵体形式存在。结论成功克隆了三七GGPPS基因CDS序列,建立了稳定的原核表达体系,为进一步研究其在三七中的生物学功能奠定了基础。     

龙牙楤木三萜皂苷合成途径关键酶AeFPS基因的克隆及原核表达

目的克隆龙牙楤木法呢二磷酸合成酶(AeFPS)基因并进行原核表达。方法以龙牙楤木为材料,采用RT-PCR方法,设计特异引物,克隆AeFPS基因,并将该基因定向插入Sca I/BamH I切开的原核表达载体pET-28a上,转化大肠杆菌BL21,于28℃,IPTG诱导5 h,经SDS-PAGE电泳分析,检测出明显的差异条带,Western blotting进一步检测其为目的基因。结果克隆到AeFPS基因cDNA全长为1 040 bp,含有1 029 bp的开放阅读框(ORF),编码342个氨基酸,GenBank登录号为HM219226.1。成功构建了原核表达质粒pET28a/AeFPS、AeFPS蛋白在BL21中高度表达,SDS-PAGE和Western blotting鉴定了目标蛋白。结论首次获得了AeFPS基因,并将其连入原核载体中成功表达,为研究AeFPS蛋白的活性及生化功能奠定了基础。     

滇龙胆GrCYP450-17基因的克隆、序列分析与原核表达

目的从滇龙胆幼叶中克隆萜类合成相关酶基因GrCYP450-17,进行序列分析和原核表达。方法根据滇龙胆转录组中GrCYP450-17基因序列,设计引物,通过RT-PCR扩增得到GrCYP450-17开放阅读框(ORF)序列,并进行TA克隆、测序和序列分析;构建原核表达载体pGEX-4T-1-GrCYP450-17,转入大肠杆菌Rosetta(DE3)中,在异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导下进行表达。结果 GrCYP450-17 ORF全长1 545 bp,编码514个氨基酸。序列分析表明,GrCYP450-17基因是CYP714家族成员;蛋白质序列系统发育分析表明,GrCYP450-17与番茄SlCYP450亲缘关系最近。构建pGEX-4T-1-GrCYP450-17重组质粒,获得稳定的原核表达体系。SDS-PAGE结果表明所表达蛋白与预期蛋白大小一致。结论克隆了GrCYP450-17基因,建立其稳定的原核表达体系,为进一步纯化GrCYP450-17蛋白、研究其结构和功能奠定基础。     

大肠杆菌K88-LTB在原核细胞中的高效表达

利用PCR技术, 从大肠杆菌中扩增出不含信号肽序列的K88基因和LTB基因片段,将其克隆到表达载体pQE-30中, 构建了原核表达载体pQE30-K88-LTB,并转入大肠杆菌中。诱导后,蛋白电泳分析结果显示,目的蛋白获得高效表达。经蛋白印记检测表明,表达的蛋白能与大肠杆菌阳性血清和重组蛋白抗血清发生特异性反应。     

铁皮石斛蔗糖合成酶基因的克隆及表达分析

目的:克隆铁皮石斛Dendrobium officinale蔗糖合成酶基因并对其表达分析,为研究铁皮石斛多糖合成与蔗糖合成酶活性关系及调控表达提供理论依据.方法:基于GenBank上已知的蔗搪合成酶基因SS同源序列,应用RT-PCR和RACE等方法,克隆铁皮石斛蔗糖合成酶基因全长,将目的片段转化大肠杆菌表达菌株BL21中,IPTG诱导表达,SDS-PAGE电泳分析.结果:成功克隆了铁皮石斛蔗糖合成酶基因,该基因cDNA全长2 424 bp,编码807个氨基酸(命名为DOSS1),登录号HQ856835,该基因氨基酸序列与兰科植物Moluara yellow(AF530568)同源性达到95%,与Oncidium goldiana(AF530567)同源性达到90%,与禾本科植物的SS基因同源性在80%以上.并对其进行大肠杆菌原核表达诱导,诱导的工程菌能明显表达出一条相对分子质量约为92×10(3)左右的蛋白质,与理论相对分子质量基本相符.结论:成功克隆了铁皮石斛蔗糖合成酶基因,并诱导出一条与理论蛋白相对分子质量相符的蛋白条带.     

党参CpUGPase基因的克隆、序列分析与原核表达

目的为研究党参多糖代谢途径,从党参Codonopsis pilosula根中克隆多糖代谢关键酶尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶CpUGPase基因,并进行序列分析和原核表达。方法根据党参转录组中CpUGPase基因序列设计引物,通过RT-PCR扩增得CpUGPase开放阅读框(ORF)序列,并进行TA克隆、测序和序列分析;构建原核表达载体PET-28a-CpUGPase,转入大肠杆菌BL21(DE3)后,在异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导下进行表达。结果 CpUGPase ORF序列全长1 413bp,编码470个氨基酸。序列分析表明,CpUGPase基因具有保守的UGPase_euk催化位点,属于A型糖基转移酶蛋白家族。构建PET-28a-CpUGPase重组质粒,获得稳定的原核表达体系。SDS-PAGE结果显示该蛋白的大小约54 900,与预测的蛋白相对分子质量一致。结论从党参根中克隆得到CpUGPase基因,并建立了稳定的原核表达体系,为进一步纯化CpUGPase蛋白,研究其结构和功能奠定了基础。     

山茱萸萜类甲羟戊酸合成途径关键酶CoHMGS基因的克隆与分析

目的克隆得到山茱萸Cornusofficinalis萜类合成途径的关键酶CoHMGS基因的cDNA序列,并进行相应的生物信息学分析,为深入研究CoHMGS基因的功能奠定基础。方法以山茱萸转录组筛选出的c102453_g2序列为参考序列设计特异引物,以山茱萸叶片总RNA,通过RT-PCR扩增获得CoHMGS基因序列,序列纯化回收后连接到pTOPO-T载体上,转化至大肠杆菌DH10B,选取阳性克隆测序。利用生物信息学软件预测CoHMGS基因及其编码蛋白质的功能。结果克隆得到长度为1645 bp的CoHMGS序列,包含1413 bp的完整开放阅读框,编码470个氨基酸。蛋白整体带负电荷,为不稳定亲水性蛋白,定位于细胞质内,不含跨膜结构。结论首次克隆得到山茱萸CoHMGS基因,对其编码蛋白质进行了初步的分析和预测,为深入揭示CoHMGS基因在山茱萸萜类物质合成途径中的功能奠定了基础。     

人参中核黄素激酶基因的克隆与原核表达

目的从人参中克隆出核黄素激酶基因,进行相关的生物信息学分析,构建原核表达载体并在大肠杆菌诱导表达。方法根据人参转录组数据库筛选出序列comp61599_c0_seq12,经相关软件对其进行序列分析;该序列3’末端缺失,利用3’RACE技术获得3’端序列;通过PCR技术获得人参核黄素激酶基因的全长c DNA序列,并构建原核表达载体p ET-32a-Pg RFK,通过热激法转化到大肠杆菌BL-21中进行诱导表达。结果从人参中成功克隆出1条长度为1 200 bp的核黄素激酶基因,其编码399个氨基酸,同时成功构建该基因的原核表达载体,SDS-PAGE电泳结果显示该蛋白大小与预测蛋白相对分子质量一致。结论成功克隆了人参核黄素激酶基因,并在大肠杆菌中成功表达。     

红花转录因子CtMYB1基因的克隆及原核表达

目的 从红花Carthamus tinctorius 花瓣中克隆转录因子基因CtMYB1,并进行序列分析和原核表达载体的构建。方法 根据红花转录组测序结果中得到的高表达的Unigene123933序列,利用RT-PCR和RACE技术从红花花瓣中扩增得到CtMYB1基因的全长cDNA序列,并进行生物信息学分析;以CtMYB1基因的全长cDNA序列为模板,PCR扩增得到CtMYB1基因的开放阅读框(ORF)序列,构建原核表达载体pEASY-E1-CtMYB1。转化大肠杆菌BL21(DE3)进行诱导表达。结果 成功从红花中克隆1个MYB基因,命名为CtMYB1,GenBank登录号为KJ524853。CtMYB1基因全长893 bp,ORF为750 bp,编码249个氨基酸。同时,成功构建了该基因的原核表达载体。SDS-PAGE结果显示该蛋白的大小约30 000,与预测的蛋白相对分子质量一致。结论 成功克隆了CtMYB1基因,构建了原核表达载体,初步证明该基因在大肠杆菌中成功表达。     

南方红豆杉紫杉二烯合成酶cDNA的克隆

目的采取分子手段通过紫杉醇生物合成途径对细胞中的紫杉醇产量进行调控。方法根据已发表的中国红豆杉紫杉二烯合成酶cDNA序列设计2对引物,从南方红豆杉愈伤组织提取总RNA,通过RT-PCR技术扩增出该酶5’端长度为1 201 bp和3’端长度为1 388 bp的2个cDNA片段,将其克隆到pGEM-T Vector上并转化到E.coli DH5α中,5’端片段经XbaⅠ和BglⅡ双酶切鉴定,3’端片段经BglⅡ和SacⅠ双酶切鉴定后,对阳性克隆进行序列测定,证实确为紫杉二烯合成酶基因。将这2个cDNA片段与双元载体pCAMBI-A1300连接并转化到E.coli DH5α中,经XbaⅠ和SacⅠ双酶切鉴定。结果成功得到全长为2 589 bp的紫杉二烯合成酶基因,编码862个aa。结论南方红豆杉紫杉二烯合成酶基因与中国红豆杉紫杉二烯合成酶基因具有98%的同源性;并且紫杉二烯合成酶cDNA成功插入到pCAMBIA1300中,为下一步的转基因工作做好了准备。     

长江中下游地区菱属植物的DNA分子鉴别

目的 对野生菱和栽培菱种rDNA ITS片段进行分析，探讨该片段在两大群体中的系统学及鉴别研究意义。方法 对菱的rDNA ITS区进行了PCR扩增、测序，运用clustal、Mega 2．0等软件对ITs区进行序列分析鉴别。结果 获得rDNAI TS1、ITS2和5．8S rDNA完整序列，10个居群菱的ITS1与ITS2序列的长度分别为234～236 bp和220～221 bp，5．8S区均为164bp，不同居群的碱基差异为0．22％～2．94％。变异位点数为16个，信息位点数6个。用NJ法根据ITS序列数据构建系统发生树。结论 尽管菱属各居群间rDNA ITS的差异百分率较小，其亲缘关系较近，但根据ITS序列的特征可以很好地鉴别野生菱、栽培菱，菱属植物有可能都起源于同一种野生类居群。     

蚯蚓溶栓酶基因的克隆及非融合性表达

 目的克隆和表达我国特有的双胸蚓属蚯蚓(Lumbricus bimastus)体内一种具有纤溶活性的蛋白质。方法通过蛋白质N-末端测序、引物设计及合成、RT-PCR得其对应的cDNA，随后构建了pBV₂₂₀-P₃₀重组质粒，在大肠杆菌DH_5α中进行非融合性表达，再经亲和色谱柱纯化复性，得到重组蚯蚓溶栓酶蛋白。结果 克隆cDNA全长888 bp，编码含242个氨基酸的成熟肽，SDS-PAGE电泳显示分子量在30×10-3左右，因此将其命名为P₃₀，经活性测定，具有纤溶活性。结论P₃₀为首次发现的新基因，在国际基因库的输入号为Genebank AF-109648，并获得国家专利，专利号为98102257.X。     

5种习用柴胡的ITS序列鉴别

目的:用PCR扩增方法测定5种常用柴胡的ITS序列,为柴胡的分子鉴定提供依据。方法:分别从5种柴胡的叶片中提取总DNA,以核基因组通用引物进行扩增,扩增产物经纯化后,用PCR产物直接测序。结果:各样品的ITS1长度为214～220bp,ITS2长度为230～231bp。5种柴胡的ITS序列分别有多个特异性信息位点。结论:ITS序列可以作为柴胡分子鉴定的依据。     

源于鲨鱼肝的一种新基因的克隆表达及其对肝肿瘤细胞的抑制作用

目的：从鲨鱼肝脏中克隆表达一种新基因psll2，纯化该基因的表达产物，研究其对肝肿瘤细胞的抑制作用。方法与结果：我们前面已报道发现了鲨肝细胞再生刺激因子（sHRSF），根据sHRSF的N端氨基酸序列设计了引物，并利用RT-PCR方法从鲨鱼再生肝组织的，6-RNA中扩增到大小约为350bp的cDNA片段，序列分析表明350bp的片段含有一个开放阅读框（ORF），含有333个碱基，编码111个氨基酸残基，其编码的N端氨基酸序列与天然sHRSF的前7个氨基酸一致。该肽被命名为PSL12（来源于鲨肝的分子量约为12kD的肽）。该cDNA被连接到质粒pGEM—T-Easy，获得重组质粒pGEM—T-psll2。根据cDNA序列分析和质粒pET-32a的多克隆位点（BamHI和SalⅠ）的序列，设计并合成了psll2基因的特异性引物，质粒pGEM—T-psll2作为模板，进行了PCR扩增。将此PCR产物插入pET-32a得到表达质粒pET-32a—psll2，并将它转化入E．coli的BL21菌株。经IPTG诱导，带有组氨酸标签的融合蛋白的表达量约为40％。用金属螯合层析纯化融合蛋白后，再用FXa切割融合蛋白，经ResourceQ和MonoQ柱层析得到PSL12纯品，它可抑制肝肿瘤细胞株SMMC．7721和HepG2的增殖。结论：从鲨鱼肝脏中获得了一种新基因psll2。该基因的表达产物PSL12能显著抑制体外培养的肝肿瘤细胞的增殖。     

滇重楼鲨烯环氧酶基因的克隆及原核表达研究

目的克隆滇重楼Paris polyphylla var.yunnanensis三萜皂苷生物合成途径中的关键酶鲨烯环氧酶(squalene epoxidase,SE)基因,并进行原核表达。并用Real-time PCR法检测cDNA样本中SE1基因和SE2基因的相对量。方法以滇重楼根为材料提取总RNA并反转录为cDNA。以cDNA为模板,根据转录组数据中的2组SE基因全长序列设计特异性引物,对SE基因进行克隆后转入到pEASY-T1 Simple Cloning Vector中,经测序鉴定正确后,构建pEASY-E1-SE表达载体,利用Art Media protein Expression/Amp+培养基自动诱导表达。Real-time PCR法检测cDNA样本中SE1和SE2基因的相对量。结果获得了2条滇重楼SE基因,命名为ppSE1和ppSE2。ppSE1的全长为1 932 bp,开放阅读框(ORF)为1 578 bp,编码525个AA;ppSE2的全长为1 828 bp,ORF长为1 548 bp,编码515个氨基酸。荧光定量PCR结果显示ppSE1基因和ppSE2基因在茎和叶中的表达具有显著差异,ppSE1的表达在叶中最为显著。酶切和测序结果表明,原核表达载体pEASY-E1-SE构建成功;SDS-PAGE分析显示,在BL21(DE3)表达感受态细胞中成功诱导表达了SE基因的2种融合蛋白。结论克隆了滇重楼的SE基因,获得了在体外具有生物学活性的SE蛋白。ppSE1基因和ppSE2基因在滇重楼中具有不同的表达模式,在滇重楼次生代谢产物的合成中起着不同的作用。     

广佛手rDNA ITS序列测定及特点的初步分析

目的分析广佛手及其近缘种香橼的rDNA ITS序列及其规律。方法采用PCR直接测序技术测定广佛手和香橼rDNA ITS序列并作序列变异分析。结果4个植物样品rDNA ITS序列长度为644-672bp。其中5．8S rDNA长度为165bp，编码区较保守。广佛手和香橼的ITS1和ITS2序列平均遗传距离分别为0．0095和0．0142。结论rDNA ITS序列可为鉴定佛手提供分子参照系统。     

丹参及鼠尾草属植物的rDNA ITS序列分析

目的研究丹参ITS片段遗传多样性,分析该片段在丹参药材DNA分子鉴别和鼠尾草属植物系统学研究中的意义。方法用一对引物进行PCR扩增,扩增产物纯化后用双脱氧终止法测序。结果获得核糖体DNA中ITS和5.8SrDNA完整序列,13个鼠尾草属植物ITS1与ITS2序列的长度分别为222～224bp、220～223bp。鼠尾草属植物种间ITS1序列差异百分率为0～12.16%,ITS2序列的差异百分率为0.5%～13.51%;丹参种内ITS1序列的差异百分率为0～0.9%,ITS2序列的差异百分率为0～0.5%;鼠尾草属各类群与外类群的差异百分率ITS1序列为16.07%～20.27%,ITS2序列为15.91%～20.27%。用邻接法(NJ)根据ITS1与ITS2序列数据建立系统发生树。结论两段序列在丹参种内保守,在属间有较大的差异,与外类群的差异最大,可作为中药丹参分子鉴定的标记,而鼠尾草属植物的系统发生关系尚须进一步研究。     

人胰激肽原酶的表达

 目的克隆人胰腺组织激肽原酶基因，构建分泌型原核表达载体。方法使用RT-PCR的方法扩增人胰腺组织cDNA，从中扩增出激肽原酶基因。将扩增的激肽原酶基因用XhoⅠ和EcoRⅠ双酶切后，连接到同样双酶切处理的pET-20b(+)载体上，酶切鉴定后，进行核苷酸序列分析和融合蛋白的表达。结果将IPTG诱导表达的菌体进行SDS-PAGE，在相对分子质量31.4×103处可见明显的高表达带。蛋白质免疫印迹实验表明，重组蛋白具有激肽原酶的抗原性。结论成功克隆人胰腺组织激肽原酶基因，并高效表达融合蛋白，为进一步开发基因工程药物打下基础。