SOCS3基因转染对肺腺癌细胞株A549原癌基因c-fos、c-jun mRNA表达及细胞增殖的影响

目的探讨SOCS3基因对人肺腺癌细胞株A549中c-fos、c-jun mRNA表达及细胞增殖的影响.方法以脂质体为载体将pEFSOCS3和pSV2neo共转染至人肺腺癌细胞株A549,RT-PCR和免疫细胞化学法测定转染前后细胞中SOCS3mRNA和蛋白表达;半定量RT-PCR测定转染前后细胞中c-fos、c-jun mRNA水平表达变化;3H-TdR掺入法检测基因转染前后细胞增殖情况.结果RT-PCR和免疫细胞化学证实转染后细胞中有SOCS3稳定表达;半定量RT-PCR证实转染后细胞中c-fos、c-jun mRNA水平显著降低(P＜0.01);且转染组细胞3H-TdR掺入量显著降低(P＜0.01).结论SOCS3蛋白可能通过负性调控STAT3介导的信号通路降低c-fos、c-jun的表达,从而抑制肺癌细胞增殖.     

SOCS3基因转染对低氧条件下大鼠肺动脉平滑肌细胞增殖的影响

目的　探讨SOCS3基因对低氧大鼠肺动脉平滑肌细胞 (PASMCs)增殖的影响。方法　以脂质体为载体将pEFSOCS3和pSV2neo共转染至体外培养的PASMCs ,应用RT PCR和免疫细胞化学法测定转染前后细胞中SOCS3mRNA和蛋白表达。低氧处理PASMCs ,采用Westernblot法检测转染前后常氧 (N)、低氧 6h(H6)、低氧 12h(H12 )PASMCs中STAT3蛋白酪氨酸磷酸化水平变化 ;流式细胞仪、3 H TdR掺入法检测转染前后各时相点细胞增殖情况。结果　RT PCR和免疫细胞化学证实转染后细胞中有SOCS3mRNA和蛋白稳定表达 ;与同时相对照组 (包括未转染组和转染空载体组 )相比 ,SOCS3基因转染组细胞中STAT3蛋白酪氨酸磷酸化水平显著下降 (P <0 0 1) ;流式细胞仪分析显示SOCS3基因转染组细胞各时相点G0 /G1期细胞比例显著增多 (P <0 0 1) ,S G2 /M期细胞比例显著减少 (P <0 0 1) ;SOCS3基因转染组细胞在常氧和低氧条件下 3 H TdR掺入量显著低于同时相点对照组细胞 (P <0 0 1)。结论　SOCS3蛋白可能通过降低STAT3酪氨酸磷酸化水平抑制PASMCs增殖。     

STAT3 siRNA对肺腺癌A549细胞STAT3及其下游基因表达的影响

目的：观察RNA干扰沉默STAT3基因对人肺腺癌A549细胞STAT3、CyclinD1、Bcl-2、BAX、Caspase-9蛋白表达的影响及其相关性及对细胞生长的影响,探讨肺癌基因治疗的新途径。方法：采用化学合成法,合成针对STAT3基因不同位点设计的3条小干扰RNA（small interfering RNA,siRNA）序列（siRNA1-3）和1条带有荧光标记的应用STAT3-siRNA转染处理人肺腺癌细胞系A549,转染16h后荧光显微镜观察转染效率,RT-PCR检测STAT3基因表达的变化,蛋白免疫印迹法检测转染后A549细胞STAT3,CyclinD1,BAX,Bcl-2,Caspase-9蛋白表达,AM-BLUE检测A549细胞生长情况。结果：经RNA干扰能有效减低A549细胞STAT3mRNA表达水平（P〈0.05）,转染后A549细胞STAT3、CyclinD1、Bcl-2蛋白的表达水平均显著降低（P〈0.05）,而BAX、Caspase-9蛋白的表达水平升高（P〈0.05）。STAT3蛋白表达分别与CyclinD1、Bcl-2蛋白表达呈正相关（r=0.854,0.910,P〈0.05）;与BAX蛋白表达程负相关性（r=-0.848,P〈0.05）;与Caspase-9蛋白表达程无相关性（r=-0.787,P〉0.05）。RNA干扰法沉默STAT3基因后,A549细胞增殖受到明显抑制。结论：STAT3-siRNA可有效抑制STAT3、CyclinD1、Bcl-2在人肺腺癌A549细胞中的表达,升高BAX、Caspase-9在人肺腺癌A549细胞中的表达,抑制A549细胞生长。     

MMP-7反义寡核苷酸抑制肺腺癌A549细胞体外增殖活性的实验研究

目的 观察基质溶解素(matrilysin,MMP-7)反义寡核苷酸对肺腺癌A549细胞体外增殖活性的影响. 方法采用硫代磷酸修饰的MMP-7反义寡核苷酸(antisense oligodeoxynucleotide, ASODN),通过脂质体导入肺腺癌A549细胞后免疫组化法检测A549细胞MMP-7表达,MTT法检测A549细胞增殖,FCM检测A549细胞周期.结果 相差显微镜下观察A549细胞转染ASODN后细胞体积变小,数目减少.MTT法测细胞增殖活性见不同浓度ASODN均能抑制A549细胞的增殖,抑制作用在48 h最强.免疫组化SABC法检测提示转染ASODN后A549细胞MMP-7蛋白表达水平明显降低.FCM检测显示MMP-7 ASODN可以抑制A549由G0/G1期进入S期.结论 MMP-7 ASODN可以特异性地抑制肺腺癌A549细胞株MMP-7蛋白的表达,调控细胞周期,抑制细胞增殖.     

抑制survivin基因表达对肺腺癌A549细胞增殖和凋亡的影响

目的研究survivin基因与肺腺癌的关系,探讨survivin对肺腺癌A549细胞增殖和凋亡的影响。方法合成抑制survivin基因的siRNA,通过脂质体转染到肺腺癌A549细胞中,荧光倒置显微镜下观察细胞形态学变化,流式细胞仪检测各组细胞增殖和凋亡指数,Western blot检测survivin编码表达的蛋白,RT-PCR检测survivin mRNA的表达。结果抑制survivin在肺腺癌A549细胞中的表达后,能够抑制A549细胞增殖,诱导细胞的凋亡,survivin基因编码表达的蛋白明显减少。结论应用RNAi抑制survivin基因,可以抑制A549细胞增殖,促进细胞凋亡。survivin能作为治疗肺腺癌的一个潜在的基因靶点。     

细胞因子负调控因子3对A549细胞株的侵袭及FAK磷酸化水平的影响

目的 观察细胞因子信号负调控因子3(suppressor of cytokine signaling 3,SOCS3)对人肺腺癌细胞株A549侵袭能力及黏着斑激酶(focal adhesion kinase,FAK)磷酸化水平的影响.方法 建立SOCS3稳定表达细胞株;Boyden Chamber分析法测定细胞的侵袭能力;RT-PCR检测FAK mRNA 表达水平;Western blot检测FAK和磷酸化FAK表达水平.结果 在纤维粘连蛋白(fibronectin,Fn)介导下,SOCS3加Fn组A549细胞穿过滤膜细胞数显著降低,差异有统计学意义(P<0.01);A549细胞各组细胞间FAK mRNA水平差异无统计学意义;而SOCS3加Fn组细胞FAK蛋白及磷酸化FAK蛋白水平显著下降,差异有统计学意义(P<0.05).结论 SOCS3从转录后水平调控FAK表达和活性从而降低A549的体外侵袭能力.     

低氧条件下RNA干扰阻断Notch3通路对人肺腺癌A549细胞增殖的影响

目的 观察低氧条件下RNA干扰阻断Notch3对人肺腺癌A549细胞增殖的影响.方法 低氧条件下(1％O2)培养人肺腺癌A549细胞,以Notch3 siRNA转染A549细胞(Notch3 siRNA组),RT-PCR和Western blotting法分别检测A549细胞内Notch3及其信号通路下游基因HES1 mRNA和蛋白表达,MTT法检测转染24、48、72 h A549细胞的细胞活力;另设阴性对照组和空白对照组.结果 Notch3 siRNA转染A549细胞后,Notch3、HES1 mRNA和蛋白表达均显著降低(P＜0.05);Notch3 siRNA转染后时间依赖性抑制A549细胞生长,Notch3 siRNA组转染48、72 h细胞活力与阴性对照组和空白对照组比较,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 低氧条件下Notch3 siRNA转染人肺腺癌A549细胞可有效抑制Notch3及其下游靶基因HES1的表达,并抑制A549细胞生长.     

外源性人分化抑制因子3在A549／DDP细胞中的表达及意义

目的:Id 蛋白即分化抑制因子(Id),在人类多种肿瘤中异常表达,并参与肿瘤细胞的增生、分化和凋亡等.文中旨在探讨人分化抑制因子3(Id3)基因体外转染在人肺腺癌细胞顺铂耐药株A549/DDP细胞中的表达及意义. 方法:构建人Id3基因和增强型绿色荧光蛋白(EGFP)真核表达载体Id3/pEGFP,采用脂质体介导的转染技术将Id3融合基因(Id3-EGFP)导入A549/DDP细胞,激光共聚焦显微镜观察细胞内EGFP的表达情况;半定量RT-PCR检测Id3表达的改变;MTT法观察Id3对细胞的增殖抑制情况. 结果:成功构建人Id3/pEGFP真核表达载体并转染A549/DDP细胞,倒置荧光显微镜下转染的A549/DDP细胞发出强绿色荧光,转Id3/pEGFP质粒的细胞其荧光主要表达于细胞核;RT-PCR结果显示Id3 mRNA在转染后的A549/DDP细胞能有效表达;MTT法结果表明,与对照组相比,转染Id3重组质粒的细胞增殖被抑制. 结论:转染的Id3/pEGFP融合基因在A549/DDP细胞能有效表达,外源性Id3基因能抑制该细胞的增殖.     

shRNA沉默TPX2基因对肺腺癌细胞A549紫杉醇敏感性的影响

目的观察靶向Xklp2靶蛋白(TPX2)-短发夹状RNA(shRNA)对肺腺癌A549细胞TPX2基因以及紫杉醇敏感性的影响。方法将靶向TPX2基因的片段插入载体后构建重组质粒,经Lipofectamine 2000将其导入A549细胞,并进行筛选及克隆化培养。细胞分3组培养:(1)转染组;(2)阴性对照组;(3)空白对照组。反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)及蛋白印迹法(Western Blot)分析转染前后TPX2基因的表达情况。MTT法检测转染干扰载体后A549细胞对紫杉醇化疗的敏感性变化。RT-PCR检测肺耐药蛋白(LRP)及多药耐药相关蛋白(MRP)mRNA表达水平的变化。结果与对照组相比,转染重组质粒后,TPX2基因的表达明显降低,MTT法显示转染TPX2-shRNA载体质粒的A549细胞对紫杉醇的敏感性明显增加;RT-PCR检测相关基因显示,LRP、MRP mRNA表达水平与空白对照组相比无明显改变(P>0.05)。结论 TPX2-shRNA干扰载体能有效抑制肺腺癌细胞系A549中TPX2基因的表达,并增强其对化疗药物的敏感性。     

顺铂上调STAT1蛋白抑制宫颈癌细胞增殖

目的研究Stat1蛋白对宫颈癌Hela细胞生长、增殖及顺铂敏感性的影响及其作用机制。方法采用蛋白印迹法（Western
blot）检测不同浓度DDP处理Hela细胞后Stat1蛋白表达差异;转染Stat1-siRNA后,通过Western blot验证干扰效果;应用四甲
基偶氮唑蓝（MTT）法和5-溴脱氧尿嘧啶核苷（BrdU）观察转染Stat1-siRNA后Hela细胞对DDP敏感性变化,并检测Stat1相关细
胞因子c-Myc的表达变化。结果随着DDP浓度的增加,Hela细胞中Stat1蛋白的表达量逐渐增加,DDP浓度为5 mg/L时,Stat1
蛋白表达上调1.5倍,DDP浓度为10 mg/L时,Stat1蛋白表达上调近2倍;特异性Stat1-siRNA 使Hela细胞中Stat1的表达下调
70%,促进细胞生长和增殖;Stat1-siRNA可以降低DDP对Hela细胞生长和增殖的抑制效应,削弱DDP对c-Myc的抑制作用。
结论Hela细胞中c-Myc是STAT1发挥抑癌作用的靶点基因之一;STAT1/c-Myc通路介导了DDP抑制Hela细胞生长、增殖的作
用;STAT1可增强Hela细胞对DDP的敏感性。
     

RNA干扰Stat3基因对EC-1细胞侵袭转移和增殖能力的影响

目的：构建针对信号转导子和转录激活子3（Stat3）基因的siRNA表达载体,研究Stat3基因沉默对人食管鳞癌EC-1细胞侵袭转移及增殖的影响.方法：构建pSUPER-EG-FP-Stat3siRNA表达载体,转染EC-1细胞,RT-PCR,Western Blot检测Stat3的表达;Boyden-chamber体外侵袭实验检测siRNA对细胞侵袭转移能力的影响,MTT法检测siRNA对细胞增殖能力的作用.结果：酶切和测序证实pSUPER-EGFP-Stat3siRNA表达载体构建成功;RT-PCR,Western Blot结果表明,siRNA能有效地降解EC-1细胞中Stat3基因的mRNA,下调Stat3蛋白的表达;转染siRNA后,与对照组相比,EC-1细胞侵袭转移和增殖能力明显下降.结论：成功构建针对Stat3基因的siRNA表达载体,可有效沉默Stat3基因在食管鳞癌EC-1细胞中的表达,抑制EC-1细胞的侵袭转移及增殖能力,可为食管癌的基因治疗提供理论依据.     

siRNA干扰Pokemon基因影响A549细胞增殖的实验研究

目的 研究siRNA干扰Pokemon基因对肺腺癌A549细胞增殖抑制效应的变化.方法 专业设计合成3条针对Pokemon的siRNA,分别转染A549细胞后,RT-PCR检测转录水平Pokemon mRNA表达的变化,筛选出其中最高效的1条siRNA;用MTT法检测该siRNA干扰Pokemon对A549细胞增殖的抑制作用;流式细胞技术检测该siRNA干扰Pokemon对A549细胞凋亡的影响.结果 3条siRNA均成功转染A549细胞,倒置荧光显微镜下观察细胞呈圆绿色.RT-PCR结果显示有2条siRNA使细胞中Pokemon的mRNA表达降低(P＜0.05).MTT法结果显示siRNA干扰Pokemon后对A549细胞增殖有抑制作用(P＜0.05),其中48 h抑制效率达(24.14±1.39)％.流式细胞技术检测结果显示该siRNA干扰Pokemon可增加A549细胞的凋亡,凋亡率为14.05％.结论 应用RNA干扰Pokemon基因能够抑制A549细胞的增殖,促进A549细胞的凋亡.Pokemon基因有可能成为肺癌治疗中的一个新靶点.     

青藤碱对肺癌细胞A549中COX2、α7nAChR和A2A表达的影响

【目的】观察青藤碱(sinomenine,SIN)对环氧化酶2(COX2)、α7烟碱型乙酰胆能受体(α7nAChR)和腺苷受体(A2A)表达变化的影响,探讨青藤碱对A549细胞增殖的抑制作用及机制。【方法】采用四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色(MTT)法检测青藤碱和4-甲基亚硝胺基-1-3-吡啶基-1-丁酮(NNK)对A549细胞增殖的影响;细胞划痕实验观察青藤碱和NNK对A549细胞迁移的影响;Western blot法观察青藤碱和NNK对A549细胞COX2蛋白表达的影响;RT-PCR和Western blot法观察青藤碱和NNK对A549细胞α7n ACh R、A2A表达的影响。【结果】NNK能促进增殖和迁移,青藤碱能抑制A549细胞增殖和迁移;NNK组COX2蛋白质水平增加,青藤碱组COX2蛋白质水平下降;NNK组α7n ACh R、A2A的表达增加,青藤碱组α7n ACh R、A2A表达下降。【结论】青藤碱能通过抑制COX2蛋白表达发挥抗A549细胞增殖和迁移作用;青藤碱对α7n ACh R和A2A受体的表达均有抑制作用。     

沉默HMGA基因对非小细胞肺癌A549细胞增殖和转移的影响及机制

目的：研究沉默HMGA1 和HMGA2 基因的表达对非小细胞肺癌细胞A549恶性增殖和转移的影响及其机制。方法：通过MTT实验测定HMGA1和HMGA2基因沉默之后,A549细胞的增殖能力;通过流式细胞术测定HMGA1和HMGA2基因沉默之后,A549细胞凋亡的情况;利用划痕实验测定分别沉默HMGA1和HMGA2基因的表达之后,A549细胞的转移能力;用Q-PCR和Western blot分析HMGA1和HMGA2基因沉默后,抑制A549细胞增殖和转移的分子机制。结果：siRNA-HMGA1和siRNA-HMGA2 干扰A549 细胞48 h后,A549 细胞的生长活力降低（P ＜0.05）。Q-PCR结果显示,siRNA-HMGA1 干扰A549 细胞48 h之后,导致细胞凋亡相关基因FOXM1和c-Myc的相对表达量降低（P ＜0.05）,但对细胞侵袭转移相关基因E-Cadherin、N-Cadherin和Vimentin的表达没有影响（P ＞0.05）。Western blot实验结果进一步证实siRNA-HMGA1干扰A549细胞后,可抑制FOXM1和c-Myc蛋白水平的表达（P ＜0.05）。Q-PCR结果显示,siRNA-HMGA2不仅可以导致FOXM1和c-Myc的表达量降低（P ＜0.05）,还可促进细胞侵袭转移相关基因E-Cadherin的表达,并抑制N-Cadherin和Vimentin的表达（P ＜0.05）。Western blot结果进一步证实,沉默HMGA2在A549细胞内的表达后,会导致FOXM1和c-Myc表达量的降低（P ＜0.05）,E-Cadherin表达量的增加（P ＜0.05）,同时引起N-Cadherin和Vimentin表达量的降低（P ＜0.05）。结论：HMGA1和HMGA2基因沉默后,通过下调FOXM1和c-Myc的表达诱导A549细胞凋亡;HMGA2表达的沉默通过下调N-Cadherin和Vimentin的表达,上调E-Cadherin的表达抑制A549细胞的转移。     

RNA干扰A549细胞核干细胞因子基因表达

目的探讨A549细胞株NS基因的表达干扰后,A549细胞株的mRNA表达水平及细胞增殖变化。方法构建NSshRNA真核表达载体,转染A549细胞,G418筛选稳定表达细胞克隆,RT-PCR检测NS基因沉默,MTT检测细胞增殖情况。结果构建的NSshRNA真核表达载体经菌落PCR和测序证实重组表达载体中插入序列与设计一致。RT-PCR检测显示构建的shRNA表达载体转染A549细胞后可显著降低NSmRNA的表达;M1vr结果显示干扰后细胞增殖速率明显减低。结论成功构建了一组针对NS基因的shRNA真核表达载体,转染A549细胞后NS基因表达被特异性沉默,且细胞增殖受到明显抑制,通过RNAi技术实现NS基因沉默可能是一种较有前景的肿瘤治疗方法。     

干扰素对肺腺癌A549细胞B7-H4分子表达的影响

目的:探讨IFN-α和IFN-γ对人肺腺癌细胞株A549 B7-H4 mRNA和蛋白表达的影响。方法:用不同浓度(100、500、1 000、2 000 U.ml-1)IFN-α和IFN-γ分别处理A549细胞,未经药物处理细胞作对照(对照组)。用MTT法观察细胞增殖活性的差异,RT-PCR观察B7-H4 mRNA表达水平的变化,蛋白质印迹法观察B7-H4蛋白表达水平的变化。结果:IFN-α和IFN-γ对人肺腺癌细胞株A549增殖有抑制作用,其抑制效应具有时间和剂量依赖性(P<0.05)。随着IFN-α浓度的增加,B7-H4分子mRNA和蛋白表达增强(P<0.05),而IFN-γ对B7-H4分子mRNA和蛋白表达影响不明显(P>0.05)。结论:IFN-α和IFN-γ均可抑制人肺腺癌A549细胞株的增殖;IFN-α可增强B7-H4mRNA和蛋白水平的表达,而IFN-γ对B7-H4分子mRNA和蛋白表达影响不明显。