IS6110-限制性片段长度多态性和间隔区寡核苷酸分型技术在结核分枝杆菌菌株鉴定中的应用

目的评价IS6110-限制性片段长度多态性（IS6110-RFLP）和间隔区寡核苷酸分型技术（spoligotyping）两种方法在结核病流行病学中的应用，探讨我国各地区的结核分枝杆菌菌株特点。方法收集158株结核分枝杆菌临床分离株，分别应用IS6110-RFLP和Spoligotyping两种方法进行鉴定。结果①IS6110-RFLP的分辨力大于spoligotyping分型。②将本次实验结果与国际spoligotype数据库进行比较。结果有14个类型属于共有类型，其中类型1为流行的类型，分布广泛，即所说的北京基因型。③广东地区与其他地区成簇率和北京基因型所占比例差异有统计学意义（P〈0．05）。广东地区成簇率和北京基因型所占比例均显著低于其他地区。结论同时应用IS6110-RFLP分型和Spoligotyping两种方法进行结核病流行病学调查研究非常有效，在中国不同地区的菌株具有不同的特点。     

四川省川南地区结核分枝杆菌Spoligotyping分型研究

目的 了解四川省川南地区结核分枝杆菌基因型构成情况,为结核病防控提供分子流行病学依据。方法 采用间隔区寡核苷酸分型(Spacer Oligonucletide typing, Spoligotyping)方法对四川省川南地区267株临床分离菌株进行基因分型,结果采用BioNumerics(Version 5.10)软件进行分析,并将Spoligotyping分型结果与SpolDB4.0数据库中的菌株进行比对分析。结果 267株结核分枝杆菌表现出66种基因型,其中51株表现为独特基因型,其余216株可聚为10个基因簇。与SpolDB4数据库比对分析发现,267株结核分枝杆菌中,144株为北京家族菌株(53.93%),79株为T家族菌株(29.59%),9株为H家族菌株,3株为U家族菌株,2株为MANU家族菌株,其余30株表现的基因型为数据库中不存在的基因型。结论 四川省川南地区结核分枝杆菌存在较高的基因多态性,北京家族菌株和T家族菌株为主要的流行菌株,应加强对这两类菌株的流行趋势的监测及生物学特性研究。     

山东省局部地区结核分枝杆菌散在分布重复单位基因分型技术的应用

目的对结核分枝杆菌散在分布重复单位（mycobacterial interspersed repetitive units，MIRU）基因分型技术在山东省局部地区的应用进行评价。方法2004年2月至2006年6月，对山东省12个县级结核病防治所实验室分离培养的826株结核分枝杆菌，应用MIRU基因分型技术进行分型。结果826株结核分枝杆菌分为201种基因型，123个独特型，78个簇，最大簇基因型为223325173533。成簇的菌株中相对应的患者有流行病学接触史者18例。MIRU基因分型法分辨率为0．90，位点26显示相对较高多态性。该基因分型法的重复性为100％。完成1株菌株基因分型需要成本人民币约50元。结论MIRU基因分型技术的重复性好，快速、简单、经济，不需要昂贵的设备。不足之处是223325173533基因型菌株在山东是社会传播的优势菌群，占分离结核分枝杆菌的30．89％，需要通过二线分型方法IS6110限制性片段长度多态性基因分型技术或增加新的多态性较高的可变数目串联重复序列位点进一步提高分辨率。     

Spoligotyping对广西地区208株结核分枝杆菌临床分离株的基因分型

目的用间隔区寡核苷酸分型(Spoligotyping)对广西地区结核分枝杆菌临床分离株进行基因分型,并分析北京家族菌株与耐药的相关性。方法收集广西地区结核分枝杆菌临床分离株,应用Spoligotyping进行基因分型研究和比例法进行药物敏感性检测。基因聚类分析采用BioNumerics软件。统计分析采用χ2检验。结果共在广西地区收集到208株结核分枝杆菌临床分离株,可分为2个基因群,即北京家族(Beijingfamily)或称北京基因型(Beijinggenotype),和非北京家族(Non-Beijingfamily),分别占55.3%(115/208)和44.7%(93/208),47种基因型,其中36株为独特类型,剩余172株分为11簇。北京家族菌株中,90.4%(104/115)为典型北京家族(TypicalBeijingfamily),非北京家族菌株表现为高度的基因多态性,可分为39个基因型,31株为独特的基因型。有耐药结果的205株菌株中,北京家族菌株,76.25%(76/113)表现为全敏感,而23.75%(37/113)表现为耐药;非北京家族菌株,75%表现为全敏感,而25%表现耐药,经卡方检验(Chi-SquareTests)(表2),两者间的差异无统计学意义(χ2=2.9721,P>0.05)。结论广西结核分枝杆菌存在明显的基因多态性。本研究证实北京基因型与耐药无明显相关性。     

220株结核分枝杆菌北京临床分离株的基因分型研究

目的了解结核分枝杆菌北京临床分离株的基因分型种类和特征,为结核病防治研究提供基础科学依据。评价两种分型方法在北京地区结核病分子流行病学中的应用。方法收集北京市结核分枝杆菌临床分离株,应用间隔区寡核苷酸分型(Spoligotyping)及多位点可变数目串联重复序列分析(MLVA)二种分型方法进行基因分型,结果聚类分析采用BioNu-merics(Version5.0)软件。结果共在北京地区收集到220株结核分枝杆菌临床分离株。采用Spoligotyping分型方法,220株菌可分为2个基因群,即北京家族(Beijing family)和非北京家族(non-Beijing family),20种基因型。其中北京家族含有202株菌,占91.82%。北京家族菌株中,典型北京家族菌株占95.05%(192/202),非典型北京家族占4.95%(10/202)。北京家族菌株的耐药率为22.55%(22/98),非北京家族菌株的耐药率为16.67%(1/6),两者间的差异无统计学意义(fisher analysis,P=0.5835>0.05)。采用MLVA分型方法,202株菌可分成5个基因群59种基因型,主要为Beijing family、China2和China3,分别占91.37%、2.73%和4.55%。结论北京地区结核分枝杆菌具有明显的基因多态性,其主要流行型为北京家族。北京家族菌株与耐药性无明显相关性。     

间隔区寡核苷酸分型技术用于结核分枝杆菌多重感染的初步研究

目的 初步评价间隔区寡核苷酸分型(Spoligotyping)技术在鉴定结核分枝杆菌多重感染中的应用。方法 选取结核分枝杆菌临床分离株,5 μm孔径滤膜过滤法制备单个细菌菌悬液,平板接种37 ℃培养,选取生长良好的单个菌落培养增菌,提取基因组DNA,Spoligotyping进行基因分型鉴定,比较临床分离株与相应的单克隆分离株的分型结果。结果 共选取32株结核分枝杆菌临床分离株,获得306个单克隆分离株。Spoligotyping分型鉴定结果显示30株结核分枝杆菌临床分离株与相应的单克隆分离株的分型结果一致,2株临床分离株的单克隆分离株呈现了多种基因型,多重感染率为6.25%。结论 Spoligotyping可用于快速,有效地区分结核分枝杆菌多重感染。     

多位点可变数量串联重复序列分析在北京家族结核分枝杆菌基因分型中的应用及位点筛选

目的对于北京家族菌株占绝大多数的感染人群,评价多位点可变数量串联重复序列（variable number tandem repeats,VNTR）分析（multiple loci VNTR analysis,MLVA）中不同位点组合在结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis,MTB）基因分型研究中的应用。并以IS6110限制性片段长度多态性（restriction fragment length polymorphism,RFLP）为参照,筛选有效位点。方法分别采用IS6110-RFLP、间隔区寡核苷酸分型（Spoligotyping）及MLVA不同位点组合对北京海淀区收集的MTB临床分离株进行基因分型研究,比较3种方法及MLVA不同位点组合的分型效果。结果 45株MTB分离株中86.7%为北京家族菌株,Spoligotyping和结核分枝杆菌散在分布重复单位（mycobacterial interpersed repetitive units,MIRU）-12系列的HGI（Hunter-Gaston Index）值分别为0.4313和0.8700,将45株MTB菌株分为10个和23个基因型。VNTR-9系列和IS6110-RFLP的分型结果一致,HGI值较高,为0.9980,将45株MTB菌株分为43个基因型。结论北京家族结核分枝杆菌在北京海淀区呈高水平流行。对于北京地区北京家族菌株占绝大多数的感染人群,VNTR-9系列MLVA是较为简便和高分辨率的分型方法 ,其分辨率能够达到MTB基因分型＂金标准＂IS6110-RFLP水平。     

分枝杆菌散在重复单位对结核分枝杆菌分型的研究

目的评价分枝杆菌散在重复单位（MIRU）分型方法在结核病流行病学上的应用，探讨该方法的应用前景。方法采用MIRU分型对158株结核分枝杆菌进行基因分型，这些菌株均已进行IS6110－RFLP分型。结果MIRU分型结果产生只需1d。158株结核分枝杆菌共产生105个类型，其中65个为独特类型。在MIRU的12个区中，重复区4、10、26、40具有较高的多态性。用Hunter-Gaston Index（HGI）对2种方法进行评价，IS6110－RFLP的分辨指数为99．4％，MIRU技术的分辨指数为97．8％。当IS6110拷贝数小于等于10个时，IS6110－RFLP的分辨指数为98％，MIRU的分辨指数达到98．2％。结论MtRU分型方法具有快速、简便、分辨力较高的特点，便于普及，可在结核病分子流行病学研究中发挥重要作用。     

分枝杆菌散在重复单位对结核分枝杆菌分型的研究

目的 评价分枝杆菌散在重复单位（MIRU）分型方法在结核病流行病学上的应用,探讨该方法的应用前景。方法采用MIRU分型对158株结核分枝杆菌进行基因分型,这些菌株均已进行IS6110-RFLP分型。结果MIRU分型结果产生只需1d。158株结核分枝杆菌共产生105个类型,其中65个为独特类型。在MIRU 的12个区中,重复区4、 10、26、40具有较高的多态性。用Hunter-Gaston Index（HGI）对2种方法进行评价,IS6110-RFLP的分辨指数为99.4%,MIRU技术的分辨指数为97.8％。当IS6110拷贝数小于等于10个时,IS6110-RFLP的分辨指数为98％,MIRU的分辨指数达到98.2％。结论MIRU 分型方法具有快速、简便、分辨力较高的特点,便于普及,可在结核病分子流行病学研究中发挥重要作用。     

以数目可变的串联重复序列和结核分枝杆菌散在分布重复单位为基础的基因分型方法在结核分枝杆菌流行病学研究中的应用

结核病是一种严重影响人类健康的传染病。全球有近1／3人口感染了结核分枝杆菌，主要分布在发展中国家。如果不能及时和有效地控制结核病传播，在今后20年内，发展中国家将会有2亿人罹患结核病。在我国，三分之一人口已感染结核分枝杆菌，受感染人数超过4亿，其中约有10％发生结核病。如果不采取有效的措施，在未来十年内预计有3000万人发生结核病。当前结核病控制面临的主要困难有：贫困人口的结核病发病率高、发现率低、耐药结核菌感染增多，而伴随着城市化过程的人口流动，     

多种基因分型技术在识别结核分枝杆菌基因型的联合应用

京基因型MTB(分辨力分别为0.9930和0.9933)的分型中.结论 MIRUs分型的方法简便、快速,结果有效、可靠,在大规模的结核病分子流行病学研究中,可先采用MIRUs,再对成簇MTB菌株进行IS6110-RFLP二次分型的联合分型策略.     

宜昌地区结核分枝杆菌基因分型与成簇特征分析

目的 描述宜昌地区结核分枝杆菌的基因分型及成簇特征,为宜昌地区的结核病防治提供依据。方法 搜集宜昌地区2016年12月至2017年5月经基因芯片检测阳性的结核病患者痰标本,接种罗氏培养基进行培养后,得到的367株结核分枝杆菌临床分离株选择国际通用的24位点结核分枝杆菌散在分布重复单位及可变数目串联重复序列(MIRU-VNTR)进行分子分型,用Hunter-Gaston指数(HGI)和遗传差异值(h)对MIRU位点的分辨率和差异性进行评价;运用BioNumerics 5.0软件对VNTR-MIRU结果进行成簇性分析,根据近期传播率公式计算其近期传播率;367株菌株分离来自367例患者,细分为初治患者321例、复治患者46例后分别进行成簇率统计,初复治患者的成簇率比较采用χ ²检验,P<0.05为差异有统计学意义。结果 367株结核分枝杆菌24位点VNTR-MIRU分型结果显示,其总的分辨率HGI值为0.999,其中遗传多样性最高的位点为QUB11b,其h值为0.79;遗传多样性最低的位点为MIRU24,其h值为0.03。分析时发现基因型呈明显的多态性,总共有324个基因型。成簇性分析发现,其中90株菌株形成39个簇,成簇率为24.52%(90/367),近期传播率为13.90%(51/367);复治患者菌株成簇率为21.74%(10/46),初治患者菌株成簇率为24.92%(80/321),两者成簇率比较,差异无统计学意义(χ ²=0.220,P=0.639)。结论 宜昌地区的结核分枝杆菌呈现出较高的遗传多样性,近期传播率较低,且成簇率与初复治无关,提示宜昌地区结核分枝杆菌以内燃复发为主,也存在小范围内的流行,在结核防控方面要加以重视。     

黑龙江省五常市结核分枝杆菌基因型及传播特征

目的 根据黑龙江省结核分枝杆菌差异区域105(RD105)缺失基因检测与北京基因型菌株的相关性分析,了解黑龙江省五常市结核分枝杆菌基因型特征及传播特征,为该地区控制结核病提供有效的工具。方法 对黑龙江省五常市结核病防治(简称“结防”)所登记并培养阳性的121例肺结核患者的结核分枝杆菌分离株,采用比例法药敏试验检测其耐药性,用RD105缺失基因检测和7个位点可变数目串联重复序列(variable number of tandem repeats,VNTR)进行分子分型, 计算耐药率、Hunter-Gaston指数(Hunter-Gaston Index,HGI)、成簇率,分析结核分枝杆菌DNA多态性及北京基因型菌株与耐药的相关性。结果 在黑龙江省五常市121株结核分枝杆菌菌株中,通过RD105缺失基因检测,其结果显示有101株为北京基因型菌株,占83.5 %.(101/121),其余20株为非北京基因型菌株,占16.5%(20/121)。121株菌株对异烟肼、利福平、乙胺丁醇、链霉素的耐药率分别为5.8%(7/121)、3.3% (4/121) 、 5.0%(6/121)、15.7%(19/121);其中北京基因型菌株对上述药物的耐药率分别为5.0%(5/101)、3.0% (3/101)、5.9%(6/101)、17.8%(18/101),非北京基因型菌株对上述药物的耐药率分别为10.0%(2/20)、 5.0% (1/20) 、 5.0%(1/20)、未检出对乙胺丁醇耐药0.0%(0/20)。两者比较差异无统计学意义(χ ²=1.090,P=0.296)。121株菌株中耐多药率为2.5%(3/121),其中2株为北京家族基因型,1株为非北京基因型;北京基因型和非北京基因型耐多药率分别为2.0%(2/101)和5.0%(1/20),两者比较差异无统计学意义(χ ²=0.531,P=0.460)。进一步使用7位点VNTR分型技术检测,结果显示121株菌株可分为17个基因簇和64个独立的基因型;每个簇包括2~14株临床分离株,最大的簇由14株结核分枝杆菌菌株构成,所占比较高为11.6%(14/121);121株结核分枝杆菌菌株中成簇菌株57株,成簇率为 47.1%(57/121)。近期感染率最小估计值为33.1%(40/121)。7位点VNTR检测结果表现出高度多态性,各位点的HGI值为0.513~0.786;经聚类分析,121株结核分枝杆菌菌株可分为3个大的基因群(Ⅰ群、Ⅱ群、Ⅲ群),81个基因型。分别为:Ⅰ群占14.9%(18/121),含15 个基因型;Ⅱ群占76.9%(93/121),含59个基因型,Ⅲ群占8.2%(10/121),含7个基因型。结论 北京基因型为黑龙江省五常市主要流行株,且该地区的结核分枝杆菌呈明显的基因多态性。耐药菌株中北京基因型菌株所占比率较高,要加强对耐药优势菌群的监测和防控。     

西藏藏族结核分枝杆菌临床分离株的MIRU-VNTR基因多态性分析与评价

目的 了解西藏地区藏族人群中结核分枝杆菌24位点MIRU-VNTR的基因多态性及其评价.方法 应用欧盟推荐的24位点MIRU-VNTR分型方法,将本次分型结果与MIRU-VNTRplus数据库进行比对,并应用BioNumerics5.0软件进行聚类分析.结果 577株结核分枝杆菌分为347种基因型,其中299株分为69个基因簇,另278株表现为独特的基因型.MIRU31、Qub11b2、Qub26、Qub4156c、Mtub21、MIRU20和MIRU26七个位点对西藏地区藏族人群中结核分枝杆菌临床分离株的分辨力较高,另17个位点的分辨力较低,其中MIRU24位点分辨率为0.结论 西藏地区藏族人群中结核分枝杆菌MIRU-VNTR分型具有良好的多态性,且该地区以现代型结核分枝杆菌为流行优势菌.     

北京结核菌株分子流行病学的研究

目的　北京结核分支杆菌分子流行病学的研究。方法 (1)使用标准化的RFLP法检测并分析从128位初治患者分离的结核分支杆菌IS6110指纹多态性;(2)对选例患者进行社会人口学和流行病学调查问卷;(3)分析结核分支杆菌IS6110指纹多态性特征与流行病学的关系。结果 (1)根据IS6110指纹特征的同源性,检测的128株结核分支杆菌可基本分为3组,A、B组的菌株间因具有较高的同源性而被称为“北京基因型”菌株,并且此类菌株在检测菌株中所占的比例较高(103/128,80.5%);C组菌株间同源性较低,多态性变化多而被称为“非北京基因型”,仅占19.5%。(2)从较低年龄(<40岁)患者分离菌株的多态性变化,与从较高年龄(>40岁)患者分离菌株多态性变化比较存在差异,提示“北京基因型”菌株不是由于BCG接种而造成的选择性优势。(3)检测菌株的多态性变化与患者结核病接触史、患者长期居住地、菌株药物敏感性情况无明显联系。结论 结核分支杆菌的指纹分析对结核病现代流行病学的研究是一个有用的工具。     

结核分枝杆菌多重感染的初步研究

目的 鉴定结核分枝杆菌多重感染的存在.方法 从上海市疾病预防控制中心结核病参比实验室保存的菌株中,选择1999年至2004年在同一抗结核疗程中前后2次分离菌株的耐药表型改变的患者为研究对象.挑选并活化入选病例的首次分离株,分离培养单菌落.利用可变数目串联重复序列多态性分型(VNTR)方法,对每个分离株的30个单菌落进行基因型分析.结果 在22例入选病例中,2例患者的首次分离株中存在2种不同基因型的菌株.2种不同基因型菌株在单菌落中占的比例分别是24:6和29:1.其余20例患者分离株各自的30个单菌落的基因型相同.结论 上海地区结核病患者中存在结核分枝杆菌的多重感染.     

北京基因型结核分枝杆菌感染的相关因素分析

目的 研究感染北京基因型MTB菌株的危险因素及其与耐药和临床症状的相关性.方法 2007年9月至2008年3月痰涂片阳性肺结核患者172例(男132例,女40例),平均年龄(56±10)岁.收集痰标本,采用罗氏培养法,培养阳性菌株行DNA提取,使用基因RD105缺失法及7个位点可变数量串联重复序列(VNTR-7)方法进行基因分型.两组间率的比较采用χ~2检验,定量资料比较采用t检验.结果 172例痰标本中共得到培养阳性菌株116株,其中非MTB菌株4株,MTB菌株112株.来自上海及江浙地区的MTB菌株中北京基因型占86.6%(84/97),非北京基因型占13.4%(13/97).女性患者的北京基因型(31/84,36.9%)明显高于非北京基因型(1/13,7.7%),初治患者中CD_4/CD_8<1者北京基因型(17/41,41.5%)明显高于非北京基因型(0/7,0%),差异均有统计学意义(χ~2值分别为4.436和4.494,均P<0.05).采用VNTR-7分型方法,北京基因型菌株可分为31种基因型,各型之间的分布不均匀,有4种基因型集中了47.6%(40/84)的MTB菌株及43.6%(17/39)的耐药菌株.结论 上海及江浙地区的MTB菌株以北京基因型为主,女性及免疫功能低下的初治肺结核患者可能是感染北京基因型菌株的危险因素.北京基因型菌株与耐药及临床症状可能无明显相关性.     

DNA数目可变串联重复序列用于结核分枝杆菌分型研究

目的　采用数目可变串联重复序列(VNTR)分型方法对安徽省的52株结核分枝杆菌进行分子分型研究,探讨该方法用于结核分枝杆菌分型的作用。方法 设计引物,采用PCR和琼脂糖凝胶电泳技术对结核分枝杆菌13个VNTR位点进行检测,并通过BioNumerics30软件进行DNA指纹图谱多态性分析。结果 52株结核分枝杆菌可分4个类别,其中88.5%菌株属于一个型,其他3个型所占比例很小,分别为5.8%、3.8%和1.9%。结论 来自安徽的结核分枝杆菌存在主要的流行型,VNTR分型技术简便、快速,是较好的结核分枝杆菌分型方法。