急性淋巴细胞白血病患者血液中草螺菌的鉴定

目的 分离鉴定源于急性淋巴细胞白血病（ALL）患者血液中的未知细菌.方法 采用常规及VITEK32微生物GNI鉴定卡鉴定细菌,K-B法进行药敏试验,PCR法扩增细菌的16S rRNA基因,通过测序并与GenBank中相关序列进行比对.结果 常规生化反应和微生物自动化鉴定系统不能鉴定.16S rRNA PCR扩增产物经测序与GenBank中序列比对,发现与草螺菌属有99%同源性.结论 来源于ALL患者血液中的未知细菌是草螺菌.     

16SrDNA序列测定在采血耗材污染细菌鉴定中的应用

目的 探讨16SrDNA基因测序方法在鉴定采血耗材中未知细菌污染方面的应用价值.方法 对15例采血原辅耗材样本进行采样、分离、纯化培养.可疑阳性标本进一步采用16SrDNA基因测序检测,同时用表皮葡萄球菌标准菌株作为实验阳性对照.结果 15例样本中有3例细菌培养可疑阳性,PCR扩增其16SrDNA片段,测序结果与GenBank比对,分别与Macrococcus caseolyticus strain（巨型球菌）、Klebsiella pneumoniae（肺炎克雷伯菌）与Bacillus thuringiensis（苏云金芽孢杆菌）的同源性为99%.表皮葡萄球菌标准菌株16SrDNA基因测序结果与来源一致.结论 16SrDNA基因测序方法可用于血制品耗材中未知细菌的污染检测,在菌株鉴定方面有快速、特异的优势.     

巢式聚合酶链式反应检测脑脊液标本中病原体的方法评价

目的探讨巢式聚合酶链式反应(PCR)检测脑脊液标本中病原体的可行性,为疾病的快速临床诊断提供参考。方法源自细菌16S rRNA基因序列设计的巢式PCR技术方法,包括2对引物,2次PCR扩增,第1对引物首次PCR扩增脑脊液标本提取的核酸DNA,第2对引物再次PCR扩增,其DNA模板为第1轮PCR扩增产物。将第2轮PCR扩增产物进行测序,对序列进行比对分析,从而确定感染的病原体。使用DNA微量分光光度测定布鲁氏菌纯菌核酸DNA,将DNA进行倍比稀释,用于巢式PCR敏感性测试。结果巢式PCR能够检测的最低限约为1个核酸DNA拷贝数。应用巢式PCR检测40份临床患者的脑脊液标本,扩增结果表明有37份标本获得约1 460 bp的预期扩增条带(不同细菌扩增片段有差异),测序比对结果显示,检出脑膜炎奈瑟菌7份、产碱假单胞菌1份、草假单胞菌22份、嗜麦芽窄食单胞菌2份、肺炎链球菌1份、未知细菌性病原体4份、未检出3份。结论巢式PCR能够快速检测与鉴定脑脊液标本中的细菌性病原体。     

16S rRNA 测序鉴定1株条件致病性人苍白杆菌

目的：探索一种基于16S rRNA 基因的细菌快速鉴定方法,为临床未知病原菌的诊断及治疗提供科学依据。方法对临床患者的痰标本分离培养纯菌落,直接以菌液为模板,以通用引物 PCR 扩增未知菌的16S rRNA 基因片段,产物直接测序。将测序结果进行 BLAST 比对,根据序列同源性鉴定病原细菌。结果未知病原菌经本实验鉴定为人苍白杆菌,经 ABI 细菌快速鉴定板条检测,确认结果一致。结论该研究简化了临床标本未知病原菌分离培养鉴定的步骤,建立了一种利用16S rRNA 基因扩增快速鉴定病原菌的简便方法。     

人乳头瘤病毒基因分型质控品的建立

目的 建立HPV基因分型质控品.方法 收集宫颈脱落细胞标本300份,通过表面等离子谐振法和测序法检测标本型别,根据GenBank中参考序列设计各型别L1基因扩增引物,通过PCR扩增、连接转化构建包含不同型别L1基因重组质粒,通过30个重组质粒PCR鉴定和序列测定,并将测定序列用BLAST软件进行比对.结果 收集的标本包含了HPV 6、16、18等30种不同型别HPV感染.PCR扩增片段大小和设计引物扩增片段长度相符,除了HPV CP8304外,其余型别均在1 500～2 000 bp之间.重组质粒PCR鉴定与目的 片段相符,测序结果 与GenBank中的参考序列一致性在99%以上,在碱基数为1 500 bp的比对序列中不一致碱基数为11个.结论 建立了30种不同型别HPV L1基因分型质控品,覆盖了所有最常见型别,涵盖了14种高危型、3种中危型和13种低危型.     

人乳头瘤病毒基因分型质控品的建立

目的 建立HPV基因分型质控品.方法 收集宫颈脱落细胞标本300份,通过表面等离子谐振法和测序法检测标本型别,根据GenBank中参考序列设计各型别L1基因扩增引物,通过PCR扩增、连接转化构建包含不同型别L1基因重组质粒,通过30个重组质粒PCR鉴定和序列测定,并将测定序列用BLAST软件进行比对.结果 收集的标本包含了HPV 6、16、18等30种不同型别HPV感染.PCR扩增片段大小和设计引物扩增片段长度相符,除了HPV CP8304外,其余型别均在1 500～2 000 bp之间.重组质粒PCR鉴定与目的 片段相符,测序结果 与GenBank中的参考序列一致性在99%以上,在碱基数为1 500 bp的比对序列中不一致碱基数为11个.结论 建立了30种不同型别HPV L1基因分型质控品,覆盖了所有最常见型别,涵盖了14种高危型、3种中危型和13种低危型.     

人乳头瘤病毒基因分型质控品的建立

目的 建立HPV基因分型质控品.方法 收集宫颈脱落细胞标本300份,通过表面等离子谐振法和测序法检测标本型别,根据GenBank中参考序列设计各型别L1基因扩增引物,通过PCR扩增、连接转化构建包含不同型别L1基因重组质粒,通过30个重组质粒PCR鉴定和序列测定,并将测定序列用BLAST软件进行比对.结果 收集的标本包含了HPV 6、16、18等30种不同型别HPV感染.PCR扩增片段大小和设计引物扩增片段长度相符,除了HPV CP8304外,其余型别均在1 500～2 000 bp之间.重组质粒PCR鉴定与目的 片段相符,测序结果 与GenBank中的参考序列一致性在99%以上,在碱基数为1 500 bp的比对序列中不一致碱基数为11个.结论 建立了30种不同型别HPV L1基因分型质控品,覆盖了所有最常见型别,涵盖了14种高危型、3种中危型和13种低危型.     

深圳市妇女宫颈癌组织中人乳头瘤病毒16型E6、E7致癌基因的序列分析

目的 检测深圳市宫颈癌患者癌组织中HPV16型E6、E7致癌基因的序列.方法 采用PCR技术扩增1例在深圳生活17年宫颈癌HPV16型阳性患者组织中HPV16 E6、E7基因,对其进行克隆、构建重组质粒并进行核酸限制性内切酶鉴定及DNA测序分析.结果 成功地克隆了HPV16 E6、E7基因,测序分析表明克隆的HPV16 E6、E7基因与GenBank收录的德国标准株相比完全一致.结论 深圳市妇女宫颈癌组织中HPV16型E6、E7致癌基因的序列与德国标准株相同.     

宫颈癌组织中HPV16 URR基因多态性分析

目的 分析宫颈癌组织中人乳头瘤病毒16型(HPV16)上游调控区(URR)基因多态性.方法 收集宫颈癌组织标本25例,提取DNA作为模板,聚合酶链反应(PCR)扩增URR目的 片段,扩增产物直接或构建克隆重组质粒后测序,以GenBank Blast软件分析序列.结果 宫颈癌组织标本中,HPV16检出率为72%(18/2...     

痰标本中金黄色葡萄球菌的分离鉴定方法研究

目的：探索一种基于16S rRNA 基因的细菌快速鉴定方法,为临床标本中未知病原菌的诊断提供新的方法思路。方法对1份临床发热伴呼吸道症候群患者的痰标本进行分离培养,获得3种不同的菌落。直接以纯菌落为模板,以通用引物扩增未知菌的16S rRNA 基因片段,产物直接测序后进行基于局部比对算法的搜索工具比对,根据序列同源性鉴定病原细菌。结果3种菌落分别为不易致病的表皮葡萄球菌、龋齿罗特放线菌及致病性的金黄色葡萄球菌,后者继续用特异性引物扩增检测鉴定,确认为金黄色葡萄球菌。结论本研究建立了一种利用16S rRNA 基因扩增快速鉴定临床标本中未知病原菌的简便方法。     

多瘤病毒在人胶质瘤的基因表达与测序

目的:探讨人胶质瘤发生与多瘤病毒SV40、JCV和BKV的PCR扩增情况,并对扩增产物做了基因测序和序列分析.方法:采用PCR方法检测94例胶质瘤和18例正常脑组织中SV40、JCV和BKV的基因片段,并对基因片段做了克隆测序和序列分析.结果:SV40和JCV序列与GenBank序列完全同源,三条BKV序列有两条与GenBank公布的序列有部分硷基不同,但氨基酸序列分析结果则相同.结论:引起人胶质瘤的多瘤病毒存在有病毒亚型.     

16SrRNA、16S-23SrRNA基因测序分析检测主要血流感染病原菌比较

目的比较细菌16SrRNA、16S-23SrRNA基因测序分析在血流感染病原菌检测中的作用。方法提取临床上血流感染常见的金黄色葡萄菌、表皮葡萄球菌、大肠埃希菌、粪肠球菌、肺炎链球菌、铜绿假单胞菌、阴沟肠杆菌、鲍曼不动杆菌、洛菲不动杆菌、肺炎克雷伯杆菌、化脓性链球菌、奇异变形杆菌、潘尼变形杆菌、屎肠球菌、粘质沙雷菌、宋内志贺菌、产气肠杆菌、小肠结肠炎耶尔森菌、腐生葡萄球菌基因组DNA,运用16SrRNA、16S-23SrRNA基因进行PCR扩增。扩增产物经测序后在美国国家生物技术中心（NCBI）上进行比对分析,确定菌种。结果在所分析的19种临床血流感染常见细菌中,16SrRNA基因测序分析可将除粘质沙雷菌外的细菌鉴定到种的水平,但无法完全区分近缘种属;16S-23SrRNA成功鉴定17种细菌,除大肠埃希菌、宋内志贺菌外所有细菌均成功鉴定到单一种的水平。结论16S-23SrRNA基因可作为血流感染细菌检测较好的分子靶标。     

一株栖稻假单胞菌海南变种的发现与鉴定

目的:鉴定从肺结核患者血液中分离出的病原菌的生物学性状并鉴定至种.方法:按常规鉴定方法进行细菌表型特征的鉴定;提取细菌基因组DNA,使用16S rDNA通用引物,做16S rDNA PCR扩增及序列测定.结果:所分离的病原菌的表型特征基本符合栖稻假单胞菌鉴定标准,但也有诸多不同之处,故称为栖稻假单胞菌海南变种;经16S rDNA扩增及测序结果在NCBI上比对结果为栖稻假单胞菌.结论:海南省首次发现栖稻假单胞菌海南变种引起的菌血症,应引起医务人员及有关部门的重视,变异的核苷酸序列定位,有待进一步研究.     

青藏高原岩羊朊蛋白基因及氨基酸序列分析

目的 分析岩羊的朊蛋白基因(PRNP)序列,评估岩羊对羊瘙痒病的易感性.方法 参照GenBank上已经发表的绵羊PRNP序列设计引物,对岩羊的PRNP序列进行扩增,基因测序后与GenBank上的11种哺乳动物的PRNP序列比对和分析.结果 测序结果显示岩羊PRNP由771个核苷酸构成,编码256个氨基酸.序列分析结果显...     

消化性溃疡患者幽门螺杆菌cagA基因检测与分析

目的建立扩增幽门螺杆菌(Hp)cagA基因的高特异性方法,结合生物信息学方法分析并阐明cagA基因结构特点及地域起源特征。方法在GenBank检索并下载cagA目标基因序列,设计引物。从消化性溃疡患者胃黏膜组织中提取总RNA,逆转录为cDNA,分段、多轮PCR扩增目的基因,ABI3500xl测序仪测定PCR产物核酸序列,ATCG基因分析软件拼接基因序列,ClustalX1.8序列分析软件比对参考序列和患者PCR扩增产物序列,Bioedit及Megalign基因软件分析核苷酸序列同源性,Mega4.1基因软件对分析序列构建进化树。结果 24例胃溃疡患者中有4例胃黏膜扩增出cagA基因片段。20例十二指肠溃疡患者中有2例胃黏膜扩增出cagA基因,均成功测序,命名为XA-cagA2-2。与本研究中目的基因同源性较高(同源性91.8%~97.0%)的菌株来源于泰国-菲律宾岛、日本冲绳岛人群菌株,进化关系较近的为泰国-菲律宾岛菌株、秘鲁亚马逊河的美国印第安人菌株以及日本冲绳岛菌株。结论本研究建立的方法成功扩增出cagA目的基因全长序列,成功进行测序、同源性分析和进化树分析,为陕西省Hp cagA基因多态性及地域性特征研究提供理论基础。     

用16S rRNA基因克隆文库研究腹泻粪便中菌群分布

目的 建立16S rRNA基因克隆文库分析菌群的方法,用于临床标本菌群分布的检测.方法 临床标本直接提取核酸,用16S rRNA基因的通用引物进行PCR扩增、纯化、连接、克隆和测序,建立16s rRNA基因克隆文库,序列与数据库进行比对分析.结果 通过16S rRNA基因克隆文库分析,腹泻标本中检出4种细菌,脆弱拟杆菌为绝对优势菌,占91%;腹泻恢复后的粪便标本中菌群呈多样性,检出12种确定种属的细菌,其中脆弱拟杆菌占14%.结论 16S rRNA基因克隆文库是一种较好地研究粪便标本菌群的方法,可直接进行粪便标本的菌群分析和研究各种细菌在腹泻中的作用.     

漳州地区战备消毒包内细菌来源的实验研究

目的探讨沿海地区自然环境中战备消毒包内细菌来源。方法根据战备消毒包内腊样芽孢杆菌、人葡萄球菌、藤黄微球菌、沃氏葡萄球菌筛选战备仓库空气中同种细菌不同菌株,提取基因组DNA,以其为模板,对16SrRNA和23SrRNA的转录间隔区（Internal transcribled spacer,ITS）序列进行PCR扩增,将扩增产物回收测序,结果用Blast进行比对。结果腊样芽孢杆菌、人葡萄球菌、藤黄微球菌、沃氏葡萄球菌DNA的PCR扩增产物分别在850bp、1000bp、1100bp、1000bp左右显现单一特异性条带;战备消毒包与空气同种细菌不同菌株之间的ITS序列相似性约为98％～99％。结论漳州地区自然环境中战备消毒包内细菌来源于空气细菌。     

DNA Ladder的制备

背景:目前,制备DNA 分子量标准的方法主要有2 种,一种是用限制性内切酶消化某种DNA,另一种是利用PCR 扩增,2 种方法各有优缺点.在前期采用PCR 技术在前期扩增100～500 bp 片段的基础上,实验室又成功扩增出600～1 000 bp片段,PCR 产物经过纯化,混匀,制备的DNA Ladder,结果制备DNA Ladder 的条带清晰,易于识别,可完全与公司商品化的DNA Ladder 相比,完全可用于分子生物学实验.目的:利用PCR 扩增技术制备DNA 分子量标准参照物.方法:自行构建了一种特殊适宜扩增的质粒pUC-DNA,根据pUC-DNA 的基因序列,利用primer5.0 设计能特异扩增100～1 000 bp 的PCR 引物.PCR 扩增出100～1 000 bp 大小的DNA 片段,在2%琼脂糖凝胶中电泳观察结果.用凝胶回收试剂盒回收目的PCR 产物,测序结果与pUC-DNA 上基因序列进行序列比对,Blast 进行同源性分析.将PCR 产物用酚/氯仿抽提,乙醇沉淀,按比例混匀,即可使用.结果与结论:利用PCR 技术能够成功扩增出100～1 000 bp 条带,片段大小与预期结果相符,片段序列与GenBank 序列完全一致,利用回收片段制备的DNA Ladder 条带清晰,可与同类产品相比.     

基于液相芯片技术建立快速检测6 种临床常见血流感染厌氧菌的方法及评价

目的 基于液相芯片技术建立一种可同时快速检测 6种临床常见血流感染厌氧菌的方法。方法 通过 GenBank寻找脆弱拟杆菌、厌氧消化链球菌、具核梭杆菌、中间普雷沃菌、产气荚膜梭菌和痤疮丙酸杆菌的 16S rDNA基因序列,经序列比对分析,选择菌内保守菌间特异的区域作靶序列,使用 Primer 5.0软件设计特异性引物及探针,建立不对称多重 PCR扩增体系,将 PCR产物与偶联核酸探针的荧光微球混合物进行杂交,建立一种多重检测方法,并对该方法的特异度、灵敏度和重复性进行评价。收集 2020年 6月～2022年 5月东莞市厚街医院阳性血厌氧培养瓶 84例及阴性培养瓶 16例,应用建立的方法进行检测,结果与传统培养法进行比较。结果 6种厌氧菌靶基因序列经 PCR扩增后,电泳成像清晰可见 6条目标条带;经反应体系优化,生物素标记与非标记引物浓度比为 4∶1时,选择退火温度 56℃进行多重扩增,加入 5μl PCR产物, 52℃温育 20 min检测效果最佳;各目标序列荧光强度中位值（median fluorescence intensity,Mfi）＞ 1 000,无非特异性信号;最低检测限可达 103cfu/ml～104cfu/ml;当菌液浓度为 105cfu/ml时,批内及批间的变异系数分别在 7.38%和 11.10%以下; 100例临床样本中 6种厌氧菌的检测结果与培养法一致。结论 成功建立一种快速、简便、高效的液相芯片方法,可同时检测 6种常见血流感染厌氧菌。     

湖北省首例输入性卵形疟原虫wallikeri亚种的病原学诊断分析

目的应用巢式PCR技术对1例罕见卵形疟原虫wallikeri亚种进行诊断和鉴定。方法采集初诊为输入性间日疟患者血样,进行疟疾快速诊断试剂盒、显微镜镜检和巢式PCR检测,并进行测序分析。结果该患者疟疾快速诊断试剂盒检测阴性;镜检查见寄生于红细胞内的疟原虫环状体和滋养体;采用卵形疟原虫wallikeri亚种特异性引物(rOVA1v/rOVA2v)进行巢式PCR,在760bp处有特异性扩增条带,测序后经Blast比对,与GenBank数据库中卵形疟原虫wallikeri亚种部分序列的一致性为99%。结论该患者经巢式PCR和序列分析确诊为湖北省首例卵形疟原虫wallikeri亚种感染。