成年大鼠和新生大鼠大脑和海马神经元缺氧耐受性比较

成年大鼠和新生大鼠大脑和海马神经元缺氧耐受性比较张留保王丽娟孙克娅＊刘平（海军医学高等专科学校＊南京红十字会医院）ＳＤ成年大鼠和新生５天大鼠各６只，均分为缺氧组和正常组，缺氧时间为１ｈ。实验结果表明：正常组成年鼠和新生鼠大脑皮质和海马神经元、神经胶质...     

宫内缺氧对幼年大鼠大脑皮质神经元的影响

目的探讨宫内缺氧对幼年大鼠大脑皮质神经元的影响。方法将孕14d的SD孕大鼠10只随机分为对照组和缺氧组，各5只。缺氧组大鼠置于三气培养箱内缺氧，制造宫内缺氧模型，对照组不进行缺氧处理；两组孕鼠的幼鼠在生后40d取脑、固定、常规石蜡切片（片厚4μm），行NSE免疫组化染色。结果缺氧组幼鼠大脑皮质NSE阳性细胞数和阳性细胞光密度均较对照组明显减少（P〈0．05）。结论一定时间、一定浓度的宫内缺氧可致胎鼠生后大脑皮质神经元减少。     

PGRN阳性神经细胞在新生大鼠大脑皮层内的分布

目的:观察颗粒蛋白(progranulin,PGRN)阳性细胞在新生大鼠大脑皮层内的分布和PGRN在新生鼠大脑皮层神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞中的表达情况,探讨PGRN在新生鼠早期神经发育中的作用。方法:制备新生SD大鼠(1、7 d)脑组织切片,采用PGRN多克隆抗体进行免疫荧光组织化学染色法检测PGRN在新生鼠脑内的表达部位,免疫荧光组织化学双标法检测PGRN在新生鼠皮层内不同细胞中的定位。结果:新生鼠大脑皮质、侧脑室周围、胼胝体及海马中均表达PGRN。PGRN主要在新生鼠皮层内神经元中表达,而在星形胶质细胞和少突胶质细胞中几乎不表达。结论:新生鼠脑内表达PGRN,在大脑皮层内不同细胞表达模式有所不同,提示PGRN可能参与大鼠神经发育早期过程。     

一种神经元体外缺氧诱导凋亡模型的建立

目的： 在不改变细胞生长环境条件下，建立一种体外培养大鼠皮层神经元缺氧诱导细胞凋亡模型。方法：取新生鼠培养第 8 d 的皮层神经元，采用不改变原培养基成分，将细胞置于缺氧环境(密闭容器内，抽取成真空并维持 30 min，然后充95%N2、5%CO2)中分别培养0.5、1.0、2.0、4.0、8.0、12.0和 24 h 后，于不同时间取出， Hochest33258神经元核染色观察凋亡小体及凋亡细胞核，抽提DNA琼脂糖电泳检测DNA梯形条带，以明确导致皮层神经元凋亡的缺氧时间。结果和结论：缺氧 0.5 h 后即可见DNA梯形条带形成，缺氧 1 h 后即可见神经元细胞核固缩、细胞核凋亡小体形成。在不改变细胞培养基及其它成分的条件下，平均缺氧 1 h 即可诱导体外培养的神经元细胞凋亡，成功地建立起一种体外培养大鼠皮层神经元缺氧诱导神经元凋亡模型，而且重复性好，可以作为体外缺氧/缺血诱导神经元凋亡的良好平台。     

幼年及成年SD大鼠Barrel脑区的变化

目的 研究幼年和成年SD大鼠Barrel脑区的发育及变化.方法 应用细胞色素氧化酶组织化学法研究成年SD鼠Barrel脑区的精确定位,及不同年龄段SD大鼠(出生后20d及3月龄成年SD大鼠)Barrel脑区的发育情况.结果 成年SD大鼠的Barrel脑区面积明显小于年轻鼠(P<0.01);发育过程中,Barrel脑区各列之间的间距缩小,尤其是D和E列之间的间距;应用Nissl复染后发现.分隔各个Barrel桶之间的问距缩小,且神经元数目减少;成年SD大鼠的Barrel桶中高活性细胞色素氧化酶细胞比例明显高于年轻鼠(P<0.01).结论 啮齿类动物躯体感觉皮层Barrel脑区神经网络的排布精细,其构筑在发育过程中存在着微妙的变化.     

宫内缺氧对新生小鼠额叶皮质神经元内nNOS表达及对成年小鼠学习记忆能力的影响

为探讨孕鼠宫内缺氧对新生小鼠发育时期额叶皮质神经元内nNOS表达及对成年小鼠学习记忆能力的影响,本研究采用Tapanainen建立的缺氧模型致胎龄13、15、17d小鼠宫内缺氧,然后采用Nissl染色观察新生鼠发育时期P1、P7、P14、P28、P90额叶皮质内神经元的数量和形态变化;免疫组织化学染色方法观察新生鼠发育时期P1、P7、P14、P28、P90脑组织内nNOS阳性神经元的表达;Morris水迷宫实验检测P90小鼠的学习和记忆能力。结果显示:与正常组比较,宫内缺氧组小鼠额叶皮质神经元数量明显减少,额叶皮质神经元内nNOS的表达明显减弱。宫内缺氧组小鼠逃避潜伏期延长及穿环次数明显减少。以上结果提示宫内缺氧可导致新生鼠额叶皮质神经元数量明显减少及nNOS的表达也明显减弱,并引起成年小鼠学习记忆能力降低。     

宫内缺氧对胎鼠大脑皮质神经元c-Fos和NOS表达的影响

目的探讨宫内缺氧对胚胎大鼠大脑皮质神经元内c-Fos和一氧化氮合酶(nitric oxide syntbase,NOS)表达的影响。方法将8只孕期15天的孕鼠随机分为对照组和缺氧组各4只,缺氧组孕鼠采用低张性缺氧模型致鼠胚宫内缺氧1小时,两组鼠胚大脑组织经c-Fos和NOS免疫组化双标染色后,进行观察分析。结果缺氧组大脑皮质c-Fos阳性细胞、NOS阳性细胞和c-Fos/NOS双染阳性细胞均比对照组明显增多(P<0.05)。结论缺氧可刺激鼠胚大脑神经元内c-Fos和NOS的表达。     

小鼠诱导性多能干细胞移植治疗宫内缺氧新生鼠脑损伤

目的:研究小鼠诱导性多能干细胞(iPSCs)移植对宫内缺氧新生鼠脑损伤的治疗作用及机制。方法:于孕14 d开始孕鼠置于动物缺氧培养箱中,制作胎鼠宫内缺氧模型。孕鼠分娩后新生鼠经侧脑室注入BrdU标记的iPSCs悬液移植组和PBS缺氧组,对照组不治疗,H-E染色观察脑组织形态学变化、八臂迷宫测试动物记忆功能、免疫组织化学检测脑BrdU阳性细胞和神经颗粒素(Ng)和神经元烯醇化酶(NSE)的表达、原位杂交检测血管内皮生长因子mRNA(VEGF mRNA)的表达。结果:移植组小鼠的学习记忆能力和脑皮质区细胞结构较缺氧组均明显改善;脑切片检出BrdU阳性细胞存在,缺氧组Ng和NSE阳性细胞表达较对照组显著减少,而VEGF mRNA的表达较对照组显著增加;移植组Ng、NSE和VEGF mRNA表达均较缺氧组显著增加。结论:小鼠iPSCs移植于宫内缺氧的新生小鼠脑中,可减轻缺氧神经元的损伤和提高学习能力,其机制可能通过上调VEGF mRNA和Ng的表达有关。     

复方猪脑肽节苷脂减轻宫内缺氧后新生小鼠脑损伤并促进小脑肽4(CBLN4)表达

目的研究复方猪脑肽节苷脂(CPCGI)对宫内缺氧后新生小鼠脑损伤及小脑肽4(CBLN4)表达的影响。方法 15只健康成年昆明鼠孕鼠随机分为3组:对照组3只,模型组和CPCGI处理组各6只。自孕14 d开始,CPCGI处理组和模型组的孕鼠置入动物缺氧箱内,制作宫内缺氧动物模型。待孕鼠分娩后,CPCGI处理组和模型组的新生小鼠经腹腔分别注射CPCGI(1 mL/kg)和PBS治疗,对照组不进行任何处理。产后40 d开始,采用小鼠跳台实验检测其记忆能力。小鼠跳台测试结束后,取出小鼠的脑组织,免疫荧光组织化学染色法检测小鼠大脑皮质神经元特异性烯醇化酶(NSE)、白细胞介素1β(IL-1β)、 CBLN4和突触素(SYN)的表达; Western blot法检测海马组织CBLN4蛋白表达。结果与对照组比较,缺氧导致新生小鼠学习记忆能力明显下降,CPCGI能明显改善鼠的记忆力。缺氧后新生小鼠脑NSE、 CBLN4和SYN表达明显减少,IL-1β表达明显增多; CPCGI处理组NSE、 CBLN4和SYN表达明显高于模型组,IL-1β表达明显低于模型组。结论 CPCGI可减轻缺氧后新生小鼠神经元的损伤,可能与减弱IL-1β的表达,促进突触的重建相关。     

当归补血汤对大鼠局灶性脑缺血再灌注后大脑皮质神经元的保护作用

目的探讨大鼠局灶性脑缺血再灌注后当归补血汤对大脑皮质神经元的保护作用。方法雄性SD大鼠48只随机分为假手术组、大脑中动脉阻塞再灌注组、生理盐水对照组、当归补血汤治疗组。治疗组术前连续6d灌胃,每日2次(早、晚各1次),术后4h再灌胃2次,每次2.5ml,次日取材。观察各组大鼠神经行为学缺陷;脑梗死体积和梗死率变化;血脑屏障通透性变化;大脑皮质神经元的形态和数量;大脑皮质神经元p53和天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3(Caspase-3)的表达情况以及大脑皮质凋亡神经元的形态和数量。结果与缺血再灌注组、生理盐水对照组比较,当归补血汤治疗组2,3,5-氯化三苯四氮唑(TTC)染色显示大脑皮质梗死区体积减少(P0.05);荧光显微镜观察脑组织中伊文斯蓝的含量减少(P0.05),Nissl染色显示大脑皮质神经元数量增加(P0.05);免疫组织化学方法显示大脑皮质神经元Caspase-3、p53的阳性细胞数减少(P0.05);TUNEL染色法显示大脑皮质神经元凋亡细胞减少(P0.05)。结论当归补血汤治疗组能减少大脑皮质神经元的死亡,这与其减少大脑皮质神经元Caspase-3、p53的表达,并通过减少细胞凋亡起保护作用有关。     

当归对宫内缺氧新生大鼠神经干细胞增殖、分化的影响

背景:实验小组前期研究发现孕鼠宫内缺氧可刺激胎鼠神经干细胞的增殖,缺氧6h时增殖达高峰,在9h也表现增殖,但能力开始下降。而缺氧达12h时即表现为坏死或凋亡,但随缺氧天数的延长及时段的不同,对神经干细胞的影响又如何?目的:进一步探讨宫内缺氧对新生大鼠神经干细胞增殖、分化的影响及当归注射液的保护作用。方法:孕SD大鼠随机分为对照组、缺氧组和当归治疗组。孕14d开始将当归组与缺氧组孕鼠置于三气培养箱中,制作缺氧性脑损伤新生鼠模型,此前1h分别给于当归注射液和生理盐水尾静脉注射,对照组不缺氧,余同缺氧组。孕鼠分娩后立即取新生鼠大脑组织,经胶质纤维酸性蛋白、神经元特异性烯醇化酶免疫组织化学染色后行图像分析。结果与结论:①缺氧组新生鼠海马胶质纤维酸性蛋白免疫组织化学阳性细胞的表达较相应对照组增加;而神经元特异性烯醇化酶免疫组织化学阳性细胞的表达较对照组减小。②当归治疗组新生鼠海马胶质纤维酸性蛋白免疫组织化学阳性细胞的表达较相应缺氧组减少;而神经元特异性烯醇化酶免疫组织化学阳性细胞的表达较对照组增大。结果表明,一定程度的缺氧可刺激神经干细胞增殖,并可刺激神经干细胞向神经胶质细胞分化,以及导致神经元的减少;当归注射液可减弱由于缺氧导致的神经干细胞的增殖和向胶质细胞分化的能力,并可缓解神经元的减少,提示当归可能对缺氧大鼠神经系统有一定的保护作用。     

6-姜酚改善新生小鼠缺氧、缺血性脑损伤后认知行为及其机制

目的 探讨6-姜酚对新生鼠缺氧、缺血性脑损伤(HIE)后认知行为的作用，通过观察对突触可塑性、神经元存活、神经干细胞增殖的影响，探讨6-姜酚对新生小鼠HIE脑损伤保护的作用机制。方法 利用出生后第7天昆明小鼠幼仔(78只)进行右侧颈总动脉结扎，然后进行90 min的缺氧处理，构建新生小鼠、缺氧缺血性脑病模型，并通过腹腔注射6-姜酚，利用水迷宫行为学方法检测认知行为；采用2,3,5-三苯基氟化四氮唑(TTC)染色观察脑损伤变化情况；利用透射电子显微镜检测突触结构和数目的改变；采用HE染色、尼氏染色、二氢乙锭(DHE)染色观察各组小鼠脑海马组织病理形态学变化；利用免疫荧光和Real-time PCR检测各组神经干细胞增殖情况和相关转录因子的表达水平；利用Western blotting检测增殖相关信号通路Akt信号通路的变化。结果 6-姜酚早期处理可改善小鼠HIE后成年学习记忆能力，减轻新生小鼠HIE后脑损伤和增加突触数目和结构完整性。6-姜酚处理组HIE病变侧海马细胞排列紊乱现象有所改善，坏死细胞数目减少，海马神经干细胞增殖能力及神经干细胞增殖相关转录因子Nestin和性别决定区转录因子...     

新生乳鼠视网膜细胞诱导骨髓间质干细胞向视网膜神经样细胞分化

目的：探讨体外培养的新生乳鼠视网膜细胞对骨髓间质干细胞的诱导分化作用。方法： 取成年Wistar大鼠股骨全骨髓细胞体外培养，经多次传代后获得高纯度的骨髓间质干细胞。以新生乳鼠视网膜细胞作诱导条件，采用分层共培养的方法诱导骨髓间质干细胞。倒置相差显微镜观察骨髓间质干细胞与新生乳鼠视网膜细胞共培养后形态的改变；免疫组织化学法检测诱导后的细胞巢蛋白(nestin)、神经丝蛋白(NF)、神经元特异性烯醇化酶(NSE)、微丝微管相关蛋白-2(Map-2)、Thy 1.1、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)等特异性标记物的表达；RT-PCR进一步分析诱导后细胞表达nestin、NF、NSE、Thy 1.1及Ran等mRNA的情况。结果：新生乳鼠视网膜细胞作诱导剂，诱导48 h后可见部分细胞长出突起并向视网膜神经元特性样的细胞分化，最长可维持10 d。结论： 骨髓间质干细胞在体外培养的新生乳鼠视网膜细胞的诱导作用下可以向视网膜神经元样细胞分化。     

胎鼠大脑皮质神经元的体外培养及鉴定

为了建立SD大鼠大脑皮质神经元的分离、培养及免疫细胞化学鉴定技术,本研究通过分离孕15 d SD胎鼠大脑皮质组织,经机械吹打后,加入含有5％马血清、5％小牛血清的MEM培养基接种在24孔培养板中进行原代培养,并于第3 d在培养基中加入阿糖胞苷抑制胶质细胞的生长,于第9 d将细胞固定后采用免疫细胞化学技术检测神经元特异性烯醇化酶(NSE)的表达。结果表明从孕15 d SD胎鼠大脑皮质分离的神经元纯度高,生长旺盛,形态典型,90％以上表达NSE免疫阳性。该结果提示我们建立的培养大鼠大脑皮质神经元的方法易于标准化操作,结果稳定,值得推广应用。     

创伤后应激障碍模型大鼠杏仁核COX及Caspase 3 mRNA表达的变化

目的观察创伤后应激障碍(PTSD)大鼠杏仁核神经元细胞色素氧化酶(COX)及Caspase 3 mRNA的表达变化,进一步认识PTSD行为异常的神经生物学机制。方法采用国际认定的连续单一刺激(single prolonged stress,SPS)方法建立大鼠PTSD模型,取成年健康雄性Wister大鼠40只,随机均分为PTSD模型的1d、4d、7d组及正常对照组。应用酶组化检测COX的表达,采用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)技术检测细胞色素氧化酶II亚基(COII)及Caspase 3 mRNA在PTSD杏仁核神经元的表达。结果PTSD大鼠杏仁核神经元细胞质内COX活性和COII mRNA表达水平明显低于正常对照组,SPS7d时最低。Caspase 3 mRNA表达于SPS刺激后逐渐上调,于SPS7d时表达最高。结论创伤后应激障碍模型大鼠杏仁核COX,COII及Caspase 3可能与PTSD的发病机制有关。     

缺氧致新生小鼠脑发育异常的形态学研究

目的:建立新生小鼠缺氧模型,观察缺氧后大脑中认知相关脑区主要神经细胞类型在发育期的变化特征。方法:新生2 d的仔鼠在10%氧环境连续饲养5 d,之后放回正常氧环境,并在发育阶段不同时间点取材。利用免疫荧光组织化学比较小鼠缺氧后胼胝体(CC)和运动皮质(M1)中少突胶质细胞密度、成熟少突胶质细胞的比率、髓鞘蛋白水平的变化,以及前扣带回皮质(ACC)、海马(Hippo)、感觉皮质(S1)中兴奋性神经元、抑制性神经元的表达变化。进一步比较ACC中不同类型抑制性中间神经元、小胶质细胞、星形胶质细胞的密度变化特征。同时,还检测了缺氧对突触蛋白表达的影响。结果:免疫荧光定量检测结果显示：与对照组相比,缺氧小鼠CC、M1中髓鞘蛋白表达水平,成熟少突胶质细胞的比率均降低;ACC中兴奋性神经元的数量无显著差异,而ACC、Hippo以及S1的γ-氨基丁酸(GABA)标记的抑制性神经元的数量显著降低;ACC中小清蛋白阳性(PV⁺)神经元、生长抑素阳性(SST⁺)神经元和血管活性肠多肽阳性(VIP⁺)神经元的数量均显著减少;缺氧小鼠ACC中囊泡...     

COX-2在缺氧新生鼠胼胝体阿米巴样小胶质细胞的表达

目的:探讨缺氧后新生鼠脑内阿米巴样小胶质细胞(amoeboid microglial cell,AMC)环氧合酶(cyclooxygenase-2,COX-2)的表达。方法:将新生鼠置于缺氧装置内(5%氧气,95%氮气)2 h复制缺氧模型,缺氧后随机分为3 h,24 h,3 d,7 d和14 d五个组(n=5)。每个时间点均设正常对照组(n=5)。采用绿色荧光lectin抗体标记AMC,红色荧光Cy3标记COX-2进行免疫荧光双标染色,同时也对体外培养的BV2小胶质细胞进行免疫荧光双标染色,观察正常新生鼠脑内AMC是否表达COX-2,以及缺氧后AMC表达COX-2的变化。结果:正常新生鼠脑内胼胝体的AMC表达COX-2,缺氧激活的AMC在不同时间点表达COX-2均较对照组增强。结论:缺氧激活后的AMC以前列腺素代谢途径参与了缺氧的病理变化。     

胚鼠大脑皮质一氧化氮合酶阳性神经元的体外生长发育研究

本文在体外培养条件下观察了孕 14 d SD胚鼠大脑皮质中一氧化氮合酶阳性神经元的形态和发育过程。将孕 14 d SD胚鼠大脑皮质细胞悬液接种于 2 4孔培养板 ,实验按培养龄分 4组 ,分别在接种后 5d、10 d、15d和 2 0 d终止培养 ,继而进行NA DPH - d组织化学染色 ,观察各组一氧化氮合酶阳性神经元的数量和形态。结果显示 :培养后 5d即有一定数量的一氧化氮合酶阳性神经元出现 ,在 4个实验组中 ,以 15d组的一氧化氮合酶阳性神经元的数量为最多、突起最长 ,深染细胞数量也最多 ,大部分一氧化氮合酶阳性神经元的胞体与突起均局限分布在细胞团块内 ,胞体大小不一 ,只有少量的一氧化氮合酶阳性细胞散在分布在细胞团块之间 ,其突起伸向或围绕团块。本研究结果表明 ,在胚鼠大脑皮质的神经元内即已有一氧化氮合酶存在 ,提示一氧化氮可能与胚脑的生长发育有关     

缺氧后幼鼠大脑内巢蛋白、神经元特异性烯醇化酶的表达及其对幼鼠学习记忆能力的影响

目的:探讨缺氧对新生大鼠海马区巢蛋白、神经元特异性烯醇化酶(NSE)的表达及幼年大鼠学习记忆能力的影响.方法:将48只7d龄SD大鼠随机分为缺氧组和对照组各24只,缺氧组通过低张性缺氧建立新生鼠缺氧模型.于缺氧24h后,两组各取16只幼鼠取其大脑组织进行巢蛋白、NSE免疫组织化学显色,两组剩余8只大鼠于生后30d Morris水迷宫测试后进行大脑NSE免疫组织化学显色.结果:缺氧组幼鼠海马巢蛋白阳性细胞的积分光密度(IOD)值明显高于对照组,而缺氧组NSE阳性细胞的IOD值明显低于对照组.Morris水迷宫检测中缺氧组幼鼠在目标象限内搜寻时间缩短.结论:缺氧引起新生鼠神经干细胞增殖,却导致神经元数量减少,幼鼠的学习记忆能力明显下降.     

胚鼠大脑皮层神经元培养方法的改进

目的建立一种简单、高效的胚鼠大脑皮层神经元原代培养的方法。方法17d胎鼠大脑皮质,直接机械切碎后经200目滤网研磨过滤,得到细胞悬液进行培养。结果神经元生长良好。相邻细胞的突起交错形成网络,鉴定神经元纯度为（94．7±5．6）％。结论本方法简单可行。可以获得高纯度的胚鼠大脑皮层神经元。