蛋白质与蛋白质相互作用研究技术

蛋白质-蛋白质相互作用的研究是蛋白质组学的重要内容，随着研究的深入，促进了研究技术的发展和完善。本文将对研究蛋白质相互作用的技术-酵母双杂交、化学能量共振能量转移、双分子荧光互补技术、荧光能量转移技术、生物分子相互作用分析技术、蛋白质芯片等技术的特点及应用做一综述。     

酵母双杂交系统在痘病毒与宿主相互作用中的研究进展

痘病毒全基因组序列分析为痘病毒的研究提供了丰富的信息。近年来,一些痘病毒编码的蛋白之间,以及病毒蛋白与宿主蛋白之间的相互作用的研究证明其在痘病毒复制、感染、致病及传播过程中起关键作用,因此受到了广泛的关注。酵母双杂交系统是研究蛋白质之间相互作用的重要工具,该技术可以发现新蛋白之间的相互作用,确定蛋白相互作用的区域,从而为研究各蛋白质的生物学功能以及蛋白质之间相互作用的分子机制奠定基础。本文综述了酵母双杂交系统在痘病毒蛋白之间及病毒-宿主相互作用的研究现状及优缺点。     

乙型肝炎病毒全S蛋白结合蛋白基因的筛选

HBV与肝硬化、肝细胞癌的发生发展密切相关[1],通过其表达的病毒蛋白与肝细胞蛋白相互作用导致疾病进展.本研究中,我们对全S基因编码产物功能进行了探讨,并以其为靶蛋白,利用酵母双杂交技术寻找其与肝细胞相互作用的蛋白质,以进一步探讨HBV致病机制.     

酵母双杂交系统的原理及应用

0 引言蛋白质和蛋白质的相互作用是很多生命现象的基础。随着分子生物学技术的发展,特别是人类基因组计划的完成,使人类对基因的结构和功能的认识不断加深,但基因编码的蛋白质的功能研究尚是一个难题。酵母双杂交(yeast two hybrid)技术是利用酵母遗传学方法分析蛋白质之间的相互作用,该方法建立以来,经过不断的完善和发展,不但可以检测已知蛋白质之间的相互作用,更重要的在于发现新的与已知蛋白相互作用的未知蛋白。     

双杂交技术在HIV-1研究中的应用进展

随着蛋白组学和基因组学研究的进一步深化,双杂交技术也迅猛发展,在研究细胞内蛋白质分子之间或病毒-宿主之间的相互作用等方面发挥重要作用。本文简述双杂交技术的基本原理、主要类型及其在逆转录病毒HIV-1研究中的应用进展。     

乙型肝炎病毒前S1蛋白反式调节基因2的克隆、表达及功能

目的 应用原核表达系统表达HBV前S1蛋白反式调节基因2(PS1TP2),酵母双杂交技术筛选白细胞文库中与之结合的蛋白质,了解该基因产物在肝癌细胞系中的亚细胞定位.方法 应用生物信息学初步探讨PS1TP2结构及功能.PCR扩增PS1TP2基因,构建pET32a(+)-PS1TP2表达载体,在大肠埃希菌Rosettap中进行诱导表达.构建pGBKT7-PS1TP2重组载体,应用酵母双杂交技术,在营养缺陷型培养基上筛选白细胞cDNA文库中与之结合的蛋白质.构建pEGFP-C1-PS1TP2表达质粒,转染肝癌细胞株HepG2,利用荧光显微镜和共聚焦显微镜观察PS1TP2的亚细胞分布.结果 PS1TP2基因位于6q24.1,疏水指数较高.PS1TP2能在原核系统中表达,表达产物相对分子质量约4.1×104.酵母双杂交技术筛选出白细胞cDNA文库中与之结合的蛋白质26个.PS1TP2亚细胞定位于细胞质中.结论 在原核表达系统中成功表达了PS1TP2,为抗体的制备奠定了基础.PS1TP2可与白细胞表达的某些蛋白质相互作用,在肝癌细胞系中定位于细胞质,为进一步探究HBV感染的发病机制提供了新线索.     

蛋白酪氨酸磷酸酶非受体型12与心脏HERG钾通道相互作用

目的鉴定HERG钾通道的相互作用蛋白,并进一步研究该相互作用蛋白对HERG钾通道的功能调控。方法 (1)应用酵母双杂交技术,构建含有HERG氨基末端的诱饵载体,将转染有诱饵载体的酵母菌AH109与预转染有人类cDNA文库的Y187酵母菌进行双杂交,初步筛选出HERG的相互作用蛋白;(2)应用免疫共沉淀技术进一步验证酵母双杂交所筛选蛋白与HERG之间的相互作用;(3)GSTpull-down分析:应用GST-HERGT-NT融合蛋白和谷光苷肽-琼脂糖4B小球从大鼠心肌裂解物中沉淀蛋白质,应用抗PTPN12抗体对沉淀物进行WesternBlot分析;(4)免疫荧光组织化学分析:应用抗PTPN12和抗HERG的抗体和荧光标记二抗显示PTPN12及HERG的亚细胞定位,应用激光共聚焦显微镜观察。结果 (1)酵母双杂交筛选发现蛋白酪氨酸磷酸酶非受体型12(Proteintyrosinephosphatasenonreceptortype12,PTPN12)与HERG氨基末端存在相互作用;(2)免疫共沉淀分析发现抗HERG的抗体能够沉淀HERG和PTPN12复合物;(3)GSTpull-down分析发现GST-HERG-NT能够将PTPN12沉淀,而GST蛋白则不能沉淀PTPN12;(4)免疫荧光组织化学分析发现PTPN12和HERG两个蛋白共定位的地方主要出现在细胞膜。结论 PTPN12与HERG氨基末端相互作用,这一发现将有助于更加透彻地理解HERG通道特性多样性的分子基础和LQTS的发病机理。     

酵母双杂交诱饵蛋白LASS1融合表达质粒的构建及鉴定

目的 构建酵母双杂交系统诱饵蛋白大鼠LASS1融合表达质粒,为进一步筛选大鼠脑神经元内与LASS1p相互作用的蛋白奠定基础.方法 应用PCR方法获得大鼠LASS1基因2个片段,分别克隆入酵母双杂交系统诱饵蛋白质粒载体pGBKT7,转染酵母菌AH109并检测重组质粒的自激活现象及毒性.利用Western印迹检测重组质粒在AH109的表达情况.结果 LASS1基因的PCR产物片段大小分别为Flag(111 bp)、Slag(109 bp);Western印迹结果表明2个重组质粒表达的蛋白均可以与抗c-Myc抗体在22 kU处特异性反应;重组质粒转化酵母后无自激活作用.结论 重组质粒pGBKT7-Flag、pGBKT7-Slag均能够在AH109内正确表达,可作为酵母双杂交系统诱饵蛋白使用.     

酵母双杂交诱饵蛋白LASS1合表达质粒的构建及鉴定

目的构建酵母双杂交系统诱饵蛋白大鼠LASS1融合表达质粒，为进一步筛选大鼠脑神经元内与LASS1p相互作用的蛋白奠定基础。方法应用PCR方法获得大鼠LASS1基因2个片段，分别克隆人酵母双杂交系统诱饵蛋白质粒载体pGBKT7，转染酵母菌AH109并检测重组质粒的自激活现象及毒性。利用Western印迹检测重组质粒在AH109的表达情况。结果LASS1基因的PCR产物片段大小分别为Flag（111bp）、Slag（109bp）；Western印迹结果表明2个重组质粒表达的蛋白均可以与抗c-Myc抗体在22ku处特异性反应；重组质粒转化酵母后无自激活作用。结论重组质粒pGBKT7-Flag、pGBKT7-Slag均能够存AH109内正确表达，可作为酵母双杂交系统诱饵蛋白使用。     

NS5A-TP5蛋白结合蛋白1的基因克隆化研究

目的 :应用酵母双杂交技术及生物信息学 (bioinformatics)技术筛选并克隆NS5A TP5蛋白结合蛋白基因1(NBP1)。方法 :应用酵母双杂交系统 3 ,构建NS5A TP5诱饵质粒 ,转化酵母AH10 9,与含人肝细胞cDNA文库质粒的酵母Y 187进行配合 ,于涂有x α gal营养缺陷型培养基 (SD/Trp Leu His Ade)上筛选生长。 结果 :挑选蓝色克隆 ,提取此酵母克隆的质粒转化大肠杆菌提取质粒DNA后进行测序 ,然后进行生物信息学分析 ,新基因的开放读码框架长度为 2 40个核苷酸 (nt) ,编码产物由 79个氨基酸残基 (aa)组成 ,命名为NBP1,GenBank注册号为AY 45 92 91。结论 :NBP1的筛选与克隆 ,可为进一步研究HCVNS5A TP5蛋白相互作用的分子生物学机制和探索新型治疗技术奠定基础     

禽流感病毒NP基因的酵母双杂交饵载体表达及自激活检测

目的构建H5N1亚型禽流感病毒NP基因的酵母双杂交诱饵载体,验证其在酵母中的表达并检测其自激活作用。方法以PCR法从pGEMT/H5NP扩增NP基因编码区序列,将其定向克隆到PGBKT7载体,经测序鉴定后,PEG/Li-Ac法转化酵母菌株AH109,用表型筛选法及颜色筛选法检测其自激活作用同时Westernblot验证诱饵蛋白的表达。结果获得NP编码区基因,并成功构建酵母双杂交系统中的诱饵载体pGBKT7-NP,对宿主细胞酵母菌株AH109无毒性和自激活作用,并能在酵母细胞中稳定表达。结论诱饵载体pGBKT7-NP可用于GAL4酵母双杂交系统钓取与禽流感病毒核蛋白相互作用的蛋白。     

酵母双杂交技术筛选乙型肝炎e抗原反式激活蛋白结合蛋白的基因

目的筛选并克隆人肝细胞cDNA文库中与乙型肝炎e抗原反式激活蛋白(HBeAgTP)相互作用蛋白的基因。方法应用抑制性消减杂交技术及生物信息学技术筛选并克隆HBeAg反式激活的新型靶基因HBeAgTP。用聚合酶链反应(PCR)法扩增HBeAgTP基因,连接人酵母表达载体pGBKT7中构建诱饵质粒,转化酵母细胞AH109并在其内表达,然后与转化了人肝cDNA文库质粒pACT2的酵母细胞Y187进行配合,在营养缺陷型培养基和X-α-半乳糖(X-α gal)上进行双重筛选阳性菌落,PCR从中扩增出目的片段并测序,进行生物信息学分析。结果成功克隆出HBeAgTP基因并在酵母细胞中表达,应用酵母双杂交筛选出阳性菌落24个,经生物信息学分析为15种已知基因。结论成功克隆出HBeAgTP的结合蛋白,包括一些与细胞内蛋白质的转录、翻译、免疫调节及物贡和能量代谢相关的基因。     

与HERG钾通道相互作用的FHL2蛋白对该通道功能的调控

目的 筛选与心脏人类果蝇相关基因（HERG）的编码蛋白钾通道存在相互作用的蛋白质,并进一步研究该相互作用蛋白对HERG钾通道的调控作用。方法 ①以带有编码人类心脏HERG钾通道的cDNA为模板,通过PCR方法得到编码人类心脏HERG钾通道氨基末端（404个氨基酸）的DNA片段。将该片段克隆入pGBKT7载体, 构建“诱饵”质粒pGBKT7-HERG-NT。②应用酵母双杂交技术筛选人类心脏cDNA文库。③以PCR法扩增4个半LIM结构域（FHL2）基因的开放读框片段(ORF),并克隆入pcDNA3.0载体。④以pcDNA3.0-herg转染HEK293细胞,应用G418筛选得到HEK293/HERG细胞株。以pcDNA3.0-FHL2转染HEK293细胞,筛选得到HEK293/FHL2细胞株后,再将pcDNA3.0-herg转染入该细胞株。⑤应用膜片钳技术,研究FHL2对HERG通道功能的影响。结果 ①用酵母双杂交技术筛选得到37个阳性克隆,其中含有表达FHL2蛋白的克隆。②膜片钳检测发现,FHL2蛋白在增加HERG电流幅度的同时并调节其激活过程。 结论 FHL2蛋白能与HERG氨基末端相互作用而影响HERG钾通道的功能。     

弓形虫ROP21诱饵质粒的构建与自激活鉴定

目的筛选与弓形虫ROP21相互作用的宿主蛋白。方法构建弓形虫ROP21基因的三个诱饵载体,通过酵母双杂交技术分别对其在Y2H Gold酵母菌中的毒性和自激活进行鉴定。提取弓形虫RNA并进行反转录,采用RT-PCR方法扩增得到弓形虫ROP21全长序列,根据其不同功能区构建全长或部分序列诱饵质粒,测序后分别命名为pGBKT7-ROP21、pGBKT7-LC和pGBKT7-ST。将重组的诱饵载体转化到Y2H酿酒酵母菌,在营养缺陷型培养基上观察该重组诱饵载体的毒性和自激活现象。结果发现三个质粒转化酵母菌后,pGBKT7-ROP21和pGBKT7-ST存在自激活现象,而pGBKT7-LC转化酵母菌不存在,因此其可以作为酵母双杂交筛选的诱饵质粒。结论为进一步运用酵母双杂交技术筛选与弓形虫ROP21互作的宿主蛋白奠定了基础。     

酵母双杂交筛选Clathrin相互作用蛋白

目的 应用酵母双杂交技术从小鼠肺cDNA文库中筛选与Clathrin相互作用蛋白,进一步阐明Clathrin在急性肺损伤和急性呼吸窘迫症（ALI/ARDS）发生时肺泡上皮极性损伤中的具体作用机制。方法 首先构建酵母双杂交pSos-Clathrin诱饵载体,酶切鉴定,然后确定Clathrin诱饵蛋白无自激活特性并检测了Clathrin诱饵蛋白的表达;最后筛选小鼠肺cDNA文库并对筛选得到的阳性克隆进行回转验证,对回转验证结果为阳性的文库克隆质粒送检测序,分析克隆序列。结果 酵母双杂交筛选小鼠肺cDNA文库得到4个与Clathrin相互作用蛋白,分别是：腺苷酸环化酶关联蛋白1,细丝蛋白α,DAP凋亡诱导蛋白激酶2和G蛋白耦联受体激酶6。结论 Clathrin参与细胞极性调节、炎症损伤和细胞凋亡等过程。     

用酵母双杂交系统筛选人肝再生增强因子的相互作用蛋白

采用酵母双杂交系统,寻找人肝再生增强因子(hALR)相互作用蛋白,探讨hALR在肝再生过程中的分子生物学机制。 1.材料与方法:(1)主要材料:MATCHMAKER双杂交系统3试剂盒、预转化人肝脏cDNA文库、YEASTMAKERTM酵母转化系统、YEASTMAKERTM酵母质粒分离试剂盒、酵母菌培养基、X-α-Gal等均购自美国Clontech公司。(2)“诱饵”质粒的构建及鉴定:用RT-PCR技术从水囊引产的4月龄人胎肝     

乙型肝炎病毒蛋白结合蛋白的研究

0引言随着基因组测序工作的完成,后面就是研究基因的功能,其中基因表达蛋白质的功能的研究尤为重要,因为基因是通过蛋白质起作用的.蛋白质与蛋白质之间的相互作用揭示了蛋白质功能的物理基础之一,即蛋白质起作用是通过与另一蛋白质进行物理接触而完成.大家知道乙型肝炎病毒(HBV),对人体有着广泛的作用,如引起人免疫紊乱?慢性肝炎?肝硬化?肝肿瘤发生,治疗效果不佳[1-9],但是他们是如何作用的目前不是太清楚,但是可以肯定其中具有蛋白质-蛋白质之间的相互作用.1990年代以来一系列遗传?生化方法特别是酵母双杂交技术等进展,为研究HBV与人体…     

酵母双杂交技术筛选肝细胞中与羧基末端截短型乙型肝炎表面抗原中蛋白MHBst167蛋白结合蛋白的研究

目的应用酵母双杂交技术筛选人肝细胞cDNA文库中与羧基末端截短型乙型肝炎病毒表面抗原中蛋白（MHBs^t167）具有相互作用的肝细胞蛋白，以探讨MHBs^t167可能的生物学功能。方法用多聚酶链反应（PCR）法扩增MHBs^t167研基因，应用酵母双杂交系统3，连接人酵母表达载体pGBKT7中构建诱饵质粒，转染酵母细胞AH109并在其内表达，然后与转染了人肝cDNA文库质粒pACT2的酵母细胞Y187进行配合，于涂有X-α-gal营养缺陷型培养基（SD／-Trp-Leu-His-Ade）上进行双重筛选阳性菌落。挑选阳性克隆，提取此酵母克隆的质粒转化DH5a大肠杆菌并经氨苄青霉素抗性筛选，提取单克隆菌落质粒DNA，酶切鉴定后进行测序，然后进行生物信息学分析。结果成功构建MHBs^t167酵母表达载体pGBKT7-MHBs^t167.筛选出阳性菌落28个，经生物信息学分析，最后从肝细胞cDNA文库中筛选出7个与MHBs^t167特异性结合作用的克隆。其中包括人类核糖基化因子1、胎儿肝全长cDNA克隆、人类醛缩酶B果糖二磷酸（ALDOB）、补体3（C3）、人类血清扩散因子（生长调节素B）、人类BAC（细菌人工染色体）克隆GSI一306C12。结论成功克隆出MHBs^t167基因并在酵母细胞中表达，应用酵母双杂交技术筛选出7个能与MHBs^t167蛋白相互作用的肝细胞结合蛋白基因，根据所克隆到的基因，对以后研究MHBs^t167的生物学功能及乙型肝炎病毒致癌的分子生物学机制奠定了理论基础。     

细粒棘球蚴MAPKK样激酶及其下游成员ERK和P38酵母双杂交载体的构建与自激活鉴定

目的构建细粒棘球蚴(Echinococcus granulosus,Eg)丝裂原活化蛋白激酶激酶(EgMKK1)及其下游成员ERK、P38酵母双杂交载体,并检测融合蛋白对酵母菌生长的毒性作用及自激活活性。方法采集绵羊肝脏感染的Eg原头蚴,生理盐水冲洗5次,TRIzol法提取原头蚴总RNA,取1μg RNA反转录cDNA。以cDNA为模板,PCR分别扩增EgMKK1、EgERK和EgP38基因片段,分别经限制性内切酶EcoRⅠ和BamHⅠ、EcoRⅠ和BamHⅠ、EcoRⅠ和SalⅠ双酶切,酶切片段连接至酵母双杂交载体pGADT7或pGBKT7,经酶切及测序鉴定正确后,应用PEG/LiAc法将重组载体转化入感受态酵母菌株Y2HGold,利用固体培养基筛选,检测融合蛋白对酵母菌株生长的毒性作用及自激活活性。结果经PCR扩增,分别获得目的基因EgMKK1、EgERK和EgP38。构建的重组酵母双杂交载体pGADT7-EgMKK1、pGBKT7-EgERK及pGBKT7-EgP38经双酶切,分别得到1 017bp、1 086bp和1 107bp目的基因片段,大小与预测值相符。重组酵母双杂交载体转化Y2HGold酵母菌在SD/-Trp平板上形成直径为1.5~2.0mm的菌落,与原始载体pGADT7或pGBKT7转化酵母菌菌落大小一致;重组酵母双杂交载体转化酵母菌在SD/-Trp和SD/-Leu平板均有直径约2mm白色菌落生长,而SDO/X/A和DDO/X/A固体培养基平板上无蓝色菌落生长。结论成功构建了酵母双杂交载体pGADT7-EgMKK1、pGBKT7-EgERK和pGBKT7-EgP38,其表达蛋白对酵母菌Y2HGold无毒性和自激活作用,为进一步研究EgMKK1与其下游成员EgERK、EgP38之间的相互作用奠定了基础。     

乙型肝炎病毒前-X融合蛋白结合蛋白的筛选

目的利用酵母双杂交技术自肝细胞cDNA文库中筛选HBV前-X(pre-X)融合蛋白结合蛋白,探讨pre-X融合蛋白的生物学功能。方法 PCR扩增HBV pre-X基因序列,根据酵母双杂合体系构建诱饵质粒pDEST32-pre-X,并测定DNA序列验证。将质粒pDEST32-pre-X转化为酵母细胞MaV203,应用Western blot验证pre-X融合蛋白在酵母细胞中正确表达,再与转化为人肝细胞cDNA文库质粒的酵母细胞pDEST22配合,在营养缺陷型培养基和X-gal上三重筛选阳性菌落,提取阳性酵母菌落的猎物质粒进行DNA测序。利用核苷酸数据库及生物信息学技术,对筛选结果进行分析。结果成功构建pDEST32-pre-X诱饵质粒,Western blot证实转化诱饵质粒的酵母细胞能正确表达pre-X融合蛋白,pDEST32-pre-X及正常成人肝细胞cDNA文库共转化酵母细胞后,选择性培养出45个菌落,经缺陷培养基分离及X-gal检测后筛选出3个阳性克隆,测序结果为一种蛋白,即TCP1蛋白。结论用酵母双杂交技术筛选出1个与pre-X融合蛋白相互作用的肝细胞结合蛋白,为进一步研究HBV pre-X融合蛋白的作用提供了新线索。