小鼠白介素-10真核表达载体的构建及表达

目的构建小鼠白介素-10(murineinterleukin-10,mIL-10)的真核表达载体,并研究其在293T细胞中的表达。方法 RT-PCR扩增小鼠脾脏IL-10基因后,克隆到真核表达载体pcDNA3.0上,酶切和测序鉴定重组质粒的大小、序列。采用脂质体转染法将重组质粒pcDNA3.0-mIL-10瞬时转染293T细胞,用Westernblot法检测IL-10表达。结果重组质粒pcDNA3.0-mIL-10构建成功,而且转染了293T细胞中提取的蛋白可检测到活性蛋白。结论经酶切和测序鉴定重组质粒pcDNA3.0-mIL-10构建成功,并在293T细胞中成功表达活性蛋白,为进一步研究其生物学功能奠定了基础。     

GFP示踪FLAG抗原表位标记BMP2转基因腺病毒穿梭质粒的构建

目的构建同时表达具有抗原表位FLAG标记的重组人骨形态发生蛋白2（rhBMP2）目的蛋白和示踪绿色荧光蛋白（GFP）报告分子的腺病毒穿梭质粒pShuttle CMV-BMP2＋-IRES-hrGFP-1。方法采用PCR技术对pcDNA3-BMP2携带的BMP2基因诱变,去除翻译终止密码子后的基因序列并添加新的酶切识别位点XhoⅠ。测序检测诱变情况,将诱变后的BMP2基因定向导入pShuttle CMV-IRES-hrGFP-1,将质粒分别转染人胚肾细胞HEK293A和兔骨髓间充质干细胞（MSCs）。通过限制性内切酶酶切图谱分析该质粒;采用荧光显微镜检查和免疫组化SP法测定HEK293A中的GFP和MSCs中的BMP2,行重组腺病毒穿梭质粒鉴定。结果质粒pShuttle CMV-BMP2＋-IRES-hrGFP-1经双酶切鉴定图谱分析构建正确,HEK293A、MSCs中均有GFP和BMP2表达。结论 pShuttle CMV-BMP2＋-IRES-hrGFP-1构建成功。     

人Ⅱ型大麻受体真核表达体系构建及其在 HEK293细胞中的表达

目的：构建人Ⅱ型大麻受体（ hCB2）基因GV230真核表达质粒,并检测hCB2基因在HEK293细胞中的表达。方法利用人脑皮质细胞的总RNA为模板,RT-PCR获得cDNA,通过酶切、连接及测序鉴定正确后,再将目的片段插入真核表达载体GV230,构建重组表达质粒GV230-hCB2,阳性克隆用脂质体瞬时转染HEK293细胞。激光共聚焦扫描显微镜和Western blotting法检测hCB2基因表达产物在细胞的表达情况。结果扩增出hCB2基因片段,成功构建了重组表达质粒,并检测到目的蛋白在转染细胞中表达,观察到hCB2受体在胞膜分布和表达。结论成功构建GV230-hCB2质粒,该质粒在HEK293细胞中能表达hCB2蛋白,此为进一步研究hCB2生物学功能奠定了实验基础。     

BTBD10基因的真核表达载体构建和亚细胞定位

目的构建BTBD10重组真核表达载体,观察BTBD10在HEK293细胞中的定位。方法利用PCR方法扩增BTBD10全长,经HindIII和BamHI酶切后连接入pGFP-C3真核表达载体,构建pGFP—C3-BTBD10重组表达质粒,转染HEK293细胞,利用激光共聚焦显微镜观察BTBD10在细胞中的定位。结果经双酶切和核酸序列分析证实重组质粒包含有正确编码的BTBD10读码框。激光共聚焦显微镜观察到空质粒pGFP—C3转染后,整个细胞内弥散绿色荧光,而转染pGFP-C3-BTBD10重组载体后,可见绿色荧光分布于HEK293细胞膜一侧的细胞浆中,提示BTBD10定位于细胞浆中。结论成功构建人BTBD10真核表达载体,BTBD10定位于哺乳细胞的细胞浆中,可能发挥蛋白之间的相互作用。     

人Dact2基因真核表达载体的构建及其在结肠癌细胞中的表达

目的构建人Dact2基因真核表达载体。方法以人胎肝cDNA文库为模板,利用RT—PcR方法获得Dact2编码序列,构建并鉴定表达Dact2的pcMV6-Entry—GFP真核表达载体。Lipofectamine 2000转染结肠癌细胞株HT29,荧光显微镜和流式细胞仪观察和分析转染效率,westernblot检测Dact2蛋白表达。结果通过PcR扩增获得了2322bp的Dac￡2编码序列,通过酶切及测序证实Dact2序列正确插入真核表达载体pcMV6-Entry—GFP;转染空载体和Dact2表达质粒48h后,荧光显微镜下观察,可见两组细胞均表达绿色荧光蛋白,流式细胞仪分析结果显示瞬时转染效率分别为41．36％和39．88％。Western blot检测证实转染表达质粒组的细胞Dact2蛋白呈阳性表达。结论成功构建了人Dact2真核表达载体,为其功能研究奠定了基础。     

Mef2c真核表达载体的构建及其在HEK293T细胞中的表达

目的构建小鼠Mef2c基因真核表达质粒并转染HEK293T细胞。方法采用RT-PCR方法从小鼠心脏组织的总cDNA中扩增出小鼠的Mef2c的基因,采用基因重组技术将Mef2c的cDNA片段插入真核表达载体peD—NA3．1（＋）,构建小鼠Mef2c真核表达质粒,脂质体转染HEK293T细胞进行表达。结果酶切和测序结果证实Mef2c真核表达质粒构建成功,经脂质体转染293T细胞后,Western blot检测证明Mef2c蛋白在真核细胞中成功表达。结论成功构建真核表达质粒pcDNA3．1（＋）．Mef2c,为进一步研究小鼠Mef2c在心肌分化过程中的作用及其调控机制奠定了实验基础。     

BHRF1基因与绿色荧光蛋白融合基因慢病毒载体的构建

目的 构建BHRF1基因与绿色荧光蛋白融合基因慢病毒表达载体及获得稳定表达BHRF1的慢病毒的方法.方法 通过实时定量聚合酶链反应(RT-PCR)方法从鼻咽癌组织中扩增获得BHRF1的基因全长CDS序列,并克隆于带GFP荧光报告基因慢病毒表达载体中,酶切验证测序正确后,将质粒pWPXL-hBHRF1-IR ES-GFP与慢病毒包装质粒共转染293T细胞,将浓缩纯化后的病毒上清感染293T细胞,荧光显微镜观察下293T细胞的绿色荧光表达及转染效率.结果 电泳鉴定与目的基因表达条带完全吻合,测序结果显示扩增得到的BHRF1序列与GenBank公布的参考序列完全一致,双酶切和测序结果证明BHRF1已正确地克隆到慢病毒表达载体中,包装后慢病毒颗粒可高效转染293T细胞,荧光显微镜下可观察到大量绿色荧光表达,转染效率＞90％.结论 成功构建了BHRF1与GFP融合基因慢病毒表达载体,为进一步研究BHRF1基因的相关功能提供了适合的稳定转染载体.     

HIV-1B亚型核心蛋白gag基因真核表达载体的构建及其在HepG2细胞中的表达

目的克隆人类免疫缺陷病毒Ⅰ型B亚型核心蛋白gag基因,构建真核表达载体,并在真核细胞中表达,为进一步制备自行设计的以λ噬菌体作为载体的HIV核酸疫苗奠定基础。方法以克隆好的HIV1B亚型U26942全基因质粒DNA作为模板,根据Genbank中gag基因的核苷酸序列设计引物,并在引物的5’端分别引入BamHⅠ及XhoⅠ酶切位点,特异性的扩增gag基因。TA克隆后经双酶切、测序等鉴定重组质粒,再经双酶切、连接构建含gag编码基因的真核表达载体,并进行酶切鉴定分析pcDNA3.1(+)/gag。在脂质体介导下转染HepG2细胞,经G418压力筛选建立稳定转染gag基因的细胞系,用RT PCR及Western印迹检测其在HepG2细胞中的表达。结果重组质粒经BamHⅠ、XhoⅠ双酶切成5.4kb与1.5kb的片断,表明表达载体pcDNA3.1(+)中插入了gag基因片断,测序结果表明编码框正确。RT PCR及Western印迹证实稳定转染gag基因的HepG2细胞系中有该基因的表达。结论成功构建了HIV1B亚型核心蛋白gag基因的真核表达载体pcDNA3.1(+)/gag,并在HepG2细胞中获得稳定表达。     

GFP基因真核表达质粒的构建及其在人胚肾293细胞中的表达

目的 克隆绿色荧光蛋白（GFP）基因并构建真核表达载体，观察其在人胚肾293（下称293细胞）细胞中的表达和分布，为制备自行设计的以λ噬菌体为载体的人类免疫缺陷病毒（HIV）核酸疫苗的阳性对照奠定基础。方法 以克隆好的pUC18／GFP为模板，根据Genbank中GFP的核苷酸序列设计引物，并在引物的5′端分别引入BamHⅠ及XhoⅠ酶切位点，特异性扩增GFP基因。TA克隆后经双酶切、测序等鉴定重组质粒，再经双酶切、连接构建含GFP编码基因的真核表达载体，酶切鉴定分析后，将该重组质粒通过脂质体介导，转染293细胞。荧光显微镜观察GFP在细胞内的表达和分布。结果重组质粒经Barn HⅠ、XhoⅠ双酶切成5．4kb与0．7kb的片断，表明表达载体pcDNA3．1（＋）中插入了GFP基因片断，测序结果表明编码框正确，并在293细胞中获得了表达，分布均匀。结论 pcDNA3．1（＋）／GFP真核表达载体已成功构建，并可在293细胞中表达。     

C-端截短变异的HBx真核表达质粒的构建及表达

目的构建羧基端缺失30个氨基酸的HBx蛋白的真核表达质粒,并在真核细胞内稳定表达。方法提取HBV-DNA阳性血清总DNA,PCR扩增截短变异的HBx基因(HBx),克隆到真核质粒pEGFP-N3中,酶切及测序鉴定。利用脂质体将重组质粒转染HepG2细胞,通过W estern blot方法检测细胞内截短变异的HBx蛋白的表达。结果构建的重组质粒pEGFP-N3/x经酶切及测序鉴定结果正确。质粒pEGFP-N3/x转染细胞后可检测到目的蛋白。结论成功构建在真核细胞内稳定表达的重组质粒pEGFP-N3/x。     

pEGFP-hApelin-R重组真核表达载体的构建及在HEK293细胞中的表达

目的构建与增强型绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein,EGEP）融合的人apelin受体（Apelin receptor,apelin-R）真核表达载体。方法以质粒pcDNA3.1-hApelin-R为模板,PCR方法扩增人apelin受体。扩增的人apelin受体用EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切,同时用这两种酶双酶切质粒peGFP-C1。然后将两种酶切产物按常规方法连接、转化大肠杆菌Top10。挑取菌落培养,提取质粒,然后进行酶切鉴定,最后进行测序。将测序正确的重组载体用脂质体法转染人胚胎肾（human embryonic kidney293,HEK293）细胞,共聚焦显微镜观察。提取转染细胞的总蛋白,进行Westernblot检测。结果扩增出一条约1200bp的片段,与预期的apelin受体大小相符。酶切结果显示,重组质粒pEGFP-hApelin-R被切成两条片段,其中一条为peGFP-C1载体大小,另一条为目的片段大小。经测序鉴定,序列与GenBank（NM_005161）中的序列高度同源。共聚焦显微镜观察显示,人apelin受体主要在细胞膜上表达。Westernblot结果显示在相对分子质量69000处有一蛋白条带,与预期大小相符。结论构建成功pEGFP-hApelin-R重组表达载体,此表达载体可用于检测apelin受体和κ型阿片受体（kappa opioid receptor,KOR）或与其他受体间的相互作用。     

人DC-SIGN基因表达质粒的构建及其表达

目的构建含有人DC-SIGN基因的真核表达载体,并在293T细胞中表达目的蛋白。方法人血培养获得树突状细胞（DC）,以DC的mRNA逆转录cDNA为模板,应用PCR体外扩增获得目的 DNA,用限制性内切酶SalⅠ和BamHⅠ分别酶切VRC4409载体和PCR产物,通过连接、转化及克隆的筛选将目的基因克隆入载体VRC4409,构建载体VRC4409-DC-SIGN,经PCR鉴定及测序分析证实,脂质体介导转染293T细胞,蛋白质印迹分析其表达DC-SIGN蛋白。结果重组质粒经双酶切和测序鉴定证实VRC4409-DC-SIGN构建成功,DC-SIGN蛋白在293T细胞中成功表达。结论成功构建质粒VRC4409-DC-SIGN并在293T细胞中表达目的蛋白,为进一步研究DC-SIGN的生物学功能奠定了基础。     

慢病毒载体PLKO．1-shHIF-2α的构建及鉴定

目的：构建绿色荧光蛋白（GFP）标记的干涉缺氧诱导因子（HIF）-2α表达的慢病毒载体,并对所得产物进行鉴定。方法体外合成的单链HIF-2α干涉片段经过退火后形成的双链片段和以质粒 PCDH为模板扩增出的EF1-EGFP 均与PLKO．1-puro连接,形成重组的慢病毒载体质粒PLKO．1-shHIF-2α,后者与pMD2G,pSAX2共转染293 FT细胞中进行包装,产生重组慢病毒颗粒。用其感染786-0细胞,检测细胞中GFP表达情况。结果成功扩增出干涉HIF-2α片段和EF1-EGFP片段,酶切鉴定及测序均证实PLKO．1-shHIF-2α质粒构建成功。转染293FT细胞产生的重组慢病毒颗粒感染786-0细胞后高表达绿色荧光。结论成功构建了高效的带GFP报告基因并稳定干涉HIF-2α表达的慢病毒载体。     

pEGFP?N1?HBsAg?ROP2多基因重组表达质粒的构建及表达鉴定

目的 构建pEGFP?N1?HBsAg?ROP2重组质粒,并转染HEK293T细胞进行表达鉴定,为弓形虫病核酸疫苗的研制奠定基础。 方法 根据HBsAg基因序列和pcDNA3?p30?ROP2重组质粒酶切位点设计引物,PCR扩增HBsAg基因,经酶切、连接、转化,利用HBsAg基因替换p30基因,构建pcDNA3?HBsAg?ROP2重组质粒;经HindⅢ和KpnⅠ双酶切,将HBsAg?ROP2片段与pEGFP?N1真核表达载体相连,构建pEGFP?N1?HBsAg?ROP2重组表达质粒,转染HEK293T细胞,观察其蛋白表达水平。结果 HBsAg片段PCR产物约700 bp,与理论值相符;构建pcDNA3?HBsAg?ROP2重组质粒,双酶切电泳后得到约5.4 kb和1.9 kb的两条带,与预期结果相符。pEGFP?N1?HBsAg?ROP2双酶切后产生约4.7 kb和1.9 kb的条带,经测序鉴定,与GenBank发表的序列同源性为99.84%。目的基因已成功转染入HEK293T细胞中,且正确表达,蛋白浓度为3.08 mg/ml。结论 成功构建pEGFP? N1?HBsAg?ROP2重组表达质粒,转染HEK293T细胞能正确表达。     

Tet-on慢病毒系统表达弓形虫ROP18的研究

目的用Tet-on慢病毒载体系统构建稳定表达弓形虫棒状体蛋白18(ROP18)的293T细胞株。方法PCR扩增ROP18基因序列插入慢病毒载体p LVCT-t TR-KRAB中,构建带有ROP18活性片段的慢病毒载体p LVCT-t TRKRAB-ROP18。经鉴定后将该重组载体(6μg)与辅助质粒ps PAX2(4μg)和p MD2.G(2μg)共同转染293T细胞,荧光显微镜下观察细胞荧光。于转染后48和72 h收集含有慢病毒颗粒上清液,感染293T细胞。以1μg/ml强力霉素(DOX)诱导293T细胞表达ROP18,荧光显微镜下观察细胞荧光,RT-PCR法检测293T细胞中的ROP18表达情况。结果 PCR扩增rop18片段为960 bp,与预期大小一致。经PCR和酶切鉴定重组慢病素载体构建成功。转染48 h后,293T细胞于荧光显微镜下可见绿色荧光。经DOX诱导24 h即可观察到293T细胞中明亮绿色荧光。RT-PCR检测结果显示,293T细胞ROP18可产生960 bp特异条带,与预期结果一致。结论采用Tet-on慢病毒载体系统构建了稳定表达弓形虫ROP18的293T细胞株。     

荧光蛋白Venus载体构建及在哺乳动物细胞中的表达

目的 构建黄色荧光蛋白Venus重组载体,并观察其在哺乳动物细胞中表达情况.方法 将Venus克隆至限制性内切酶处理的pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro载体上,转染293T细胞,荧光显微镜下观察结果.48 h后收集细胞蛋白,应用Western blot技术印证荧光蛋白Venus表达情况.结果 重组载体经限制性内切酶鉴定及测序比对正确,转染293T细胞后可见明亮荧光,弥漫分布于细胞质中,Western blot证明荧光蛋白Venus高量表达.结论 成功构建了Venus重组载体,荧光蛋白Venus在哺乳动物细胞中高表达,此为分子与细胞生物学提供了一种重要的研究工具.     

pEGFP-N1-HBsAg-p30-ROP2真核表达载体的构建及其在293T细胞中的表达

目的构建pEGFP-N1-HBsAg-p30-ROP2重组表达载体并进行293T细胞的转染表达。方法根据pcDNA3-HBsAg-p30-ROP2重组质粒设计引物,进行PCR扩增,获得HBsAg-p30-ROP2融合基因并进行酶切,酶切片段与pEGFP-N1载体连接,构建pEGFP-N1-HBsAg-p30-ROP2真核表达载体,酶切和测序鉴定后转染293T细胞,采用荧光、Western blot和ELISA检测其蛋白表达效率;分别用P30单抗腹水、ROP2鼠源多抗、乙肝患者血清进行ELISA,检测融合蛋白的免疫反应性。结果 PCR扩增HBsAg-p30-ROP2基因片段约2 600bp,与理论值相符。构建的重组质粒pEGFP-N1-HBsAg-p30-ROP2经双酶切获到约4 700bp和约2 600bp的两条片段,与预期相符。对重组载体测序,HBsAg基因的252位C→A,345位T→C,ROP2基因的695位A→T,且3个碱基突变均为同义突变。免疫荧光法检测pEGFP-N1-HBsAg-p30-ROP2转染成功并正确表达,细胞蛋白浓度2.40mg/ml。提取的融合蛋白能被弓形虫p30单抗腹水、ROP2鼠源多抗和乙肝患者血清识别。结论成功构建pEGFP-N1-HBsAg-p30-ROP2重组表达载体,并在293T细胞中过表达,表达蛋白具有免疫反应性,为乙肝和弓形虫联合疫苗的研制奠定了基础。     

不同片段的NPM1-EGFP融合表达载体的构建和表达

目的构建不同片段的NPM1与绿色荧光蛋白(EGFP)的真核融合表达质粒,检测其在人乳腺癌MDA-MB-231细胞中的表达和定位。方法 RT-PCR法从人乳腺癌MDA-MB-231细胞cDNA中扩增不同片段的NPM1,产物经电泳分离、切胶纯化后,分别采用XhoⅠ和EcoRⅠ进行酶切,然后与同样酶切后的pEGFP-C3载体进行连接反应,将连接产物转化大肠杆菌感受态细胞,挑取克隆,提取质粒并酶切鉴定。将酶切及测序鉴定后的pEGFP/NPM1质粒采用脂质体介导后将其转入MDA-MB-231细胞中,通过Western blot技术检测其蛋白的表达。倒置荧光显微镜观察其亚细胞定位。结果酶切鉴定和基因测序结果显示不同片段的pEGFP-NPM1融合表达质粒构建成功,并可在MDA-MB-231细胞内表达,倒置荧光显微镜下可以清晰显见融合蛋白的亚细胞定位。结论 NPM1及其不同结构域的真核重组质粒构建成功,在细胞中成功表达,并可以用于分析其亚细胞定位,从而为进一步研究NPM1在乳腺癌发生发展中的作用奠定基础。     

携带融合基因穿梭质粒的构建及在人肝癌细胞中的表达

构建携带胸苷激酶(tk)与增强型绿色荧光蛋白(EGFP)融合基因穿梭质粒,并观察其在肝癌细胞系HepG2细胞中的表达。应用基因重组技术,构建EGFP与tk的融合表达穿梭质粒载体,经限制酶切鉴定和测序分析,脂质体转染将其导入HepG2中,48h后用荧光显微镜观察荧光的表达,RT-PCR法检测融合蛋白tk和EGFP的mRNA表达,四甲基偶氮唑蓝(MTT)实验检测转染融合蛋白载体后不同浓度的更昔洛韦(GCV)对HepG2细胞的细胞毒作用。酶切鉴定和测序分析证实重组质粒中插入融合目的基因片断及载体DNA大小、方向和插入位点正确,在转染此穿梭质粒的HepG2细胞中检测到绿色荧光蛋白的表达,RT-PCR检测到融合蛋白tk和EGFP的mRNA表达;GCV对转染了携带tk与EGFP融合基因穿梭质粒载体有明显的细胞毒作用。成功构建携带tk与EGFP融合基因穿梭质粒载体,转染人肝癌细胞株HepG2中tk和EGFP的独立表达没有受到影响,该载体可利用绿色荧光蛋白作为报告基因监测tk的表达并可用于肝癌的自杀基因治疗。     

刚地弓形虫棒状体蛋白ROP16对小鼠脑神经细胞凋亡的影响

目的构建带有Flag标签的刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)棒状体蛋白16(ROP16)的重组慢病毒表达质粒,并检测ROP16蛋白在神经细胞中的表达及其对小鼠脑神经细胞凋亡的影响。方法PCR扩增带Flag标签的ROP16基因,克隆至慢病毒载体,构建重组质粒p CDH-cop GFP-ROP16-Flag,转化至大肠埃希菌(Escherichia coli)DH5α感受态细胞,采用PCR、双酶切及测序验证。将重组质粒转染至人胚胎肾上皮细胞(293T细胞)中进行慢病毒包装,以p CDH-CMV-cop GFP空质粒对照组,荧光显微镜下观察绿色荧光表达情况,并计算慢病毒滴度。将包装后的慢病毒感染人神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y),采用蛋白质印迹(Western blotting)检测ROP16蛋白的表达情况。应用立体定位注射技术将慢病毒浓缩液注射至小鼠前额叶皮层M1区,2周后取小鼠脑组织,制备冰冻切片,TUNEL染色后,荧光显微镜下观察小鼠脑神经细胞凋亡情况。结果重组慢病毒表达质粒p CDH-cop GFP-ROP16-Flag经PCR和双酶切后均获得大小为2 200 bp的条带,与预期值相符;测序结果与刚地弓形虫RH株ROP16基因(Gen Bank登录号为GQ249093.1)序列比对完全一致。包装后的慢病毒在荧光显微镜下可见绿色荧光,滴度约为2E+8 TU/ml。Western blotting分析结果显示,在相对分子质量(Mr)120 000处有特异条带,重组慢病毒表达质粒能够在SH-SY5Y细胞内表达ROP16蛋白。感染慢病毒的小鼠脑组织冰冻切片经TUNEL染色后,荧光显微镜下可见实验组凋亡的细胞明显多于空质粒对照组。结论构建的慢病毒表达质粒p CDH-cop GFP-ROP16-Flag可在神经细胞内表达ROP16蛋白,并可导致小鼠脑神经细胞凋亡。