DFU对骨肉瘤细胞增殖和侵袭能力的影响

目的 观察选择性环氧合酶-2抑制剂DFU对人骨肉瘤细胞株MG-63增殖和侵袭能力的影响及其对Ang-2基因表达的调控.方法 体外培养骨肉瘤细胞株MG-63,免疫荧光法检测Ang-2在MG-63细胞中的表达,应用噻唑蓝(MTT)比色法和形态学检测研究不同浓度DFU对骨肉瘤细胞株MG-63的生长抑制作用,Boyden小室体外侵袭实验检测其对骨肉瘤细胞侵袭能力的影响,RT-PCR法分析DFU对骨肉瘤细胞株MG-63中Ang-2基因表达的影响.结果 免疫荧光染色结果显示Ang-2在骨肉瘤细胞株MG-63中呈阳性染色,MTT法和形态学检测提示DFU可抑制骨肉瘤细胞株MG-63的增殖,并具有剂量依赖性,在DFU浓度为200 μmol/L时,对细胞生长有明显的抑制作用.Boyden小室体外侵袭实验显示DFU可降低骨肉瘤细胞的侵袭能力,在DFU浓度为200 μmol/L时,作用最显著.逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)分析显示经DFU作用后的骨肉瘤细胞株MG-63表达Ang-2较用药前明显下降.结论 DFU对骨肉瘤细胞株MG-63的增殖有抑制作用,其可能通过抑制Ang-2的表达,降低其侵袭能力.     

miR-100对骨肉瘤细胞增殖、侵袭、迁移能力的影响

[目的]观察miR-100对不同骨肉瘤细胞系的表达差异,研究miR-100对骨肉瘤细胞MG-63增殖、侵袭迁移能力的影响。[方法]采用qRT-PCR检测miR-100在骨肉瘤细胞系中的表达差异。通过脂质体2000转染说明对骨肉瘤细胞MG-63进行转染操作,分别构建miR-100过表达和miR-100阴性对照组。转染骨肉瘤成功后,通过CCK-8实验检测miR-100对骨肉瘤细胞增殖能力的影响,同时Transwell实验检测骨肉瘤细胞侵袭、迁移能力变化。[结果]miR-100在骨肉瘤细胞系中表达差异显著(P0.05),且差异具有统计学意义;相比miR-100NC组,过表达miR-100增殖、侵袭、迁移能力明显下降(P0.05),且差异具有统计学意义。[结论]miR-100在骨肉瘤中呈现低表达;过表达miR-100抑制骨肉瘤细胞增殖、侵袭、迁移能力。miR-100可能会成为未来骨肉瘤治疗的潜在靶点。     

二硫代氨基甲酸吡咯烷提高甲氨蝶呤对人骨肉瘤MG-63细胞增殖活性和凋亡的影响

目的 观察二硫代氨基甲酸吡咯烷(PDTC)和甲氨蝶呤(MTX)对人骨肉瘤MG-63细胞凋亡和Livin表达的影响.方法 体外培养骨肉瘤MG-63细胞株,用0、50、100、200和400μmol/L的PDTC和MTX作用于骨肉瘤MG-63细胞24、48和72 h后,用噻唑蓝(MTT)比色法检测骨肉瘤MG-63细胞的增殖活性,用流式细胞仪测细胞的凋亡率,用Western blot检测各组细胞的Livin蛋白表达水平.结果 各组骨肉瘤MG-63细胞的增殖活性随着时间增加降低,同时细胞的凋亡率随着时间增加(P＜0.05),各组细胞中Livin蛋白的表达明显降低(P＜0.05).结论 PDTC能提高MTX对骨肉瘤MG-63细胞的凋亡,其机制可能与下调Livin表达,阻断了Livin介导的抗凋亡途径有关.

Abstract：

Objective To detect the effect of pyirolidine dithiocarbamate (PDTC) and methotrexate (MTX) on apoptosis and expression of livin of human osteosarcoma MG-63 cells. Methods MG-63 cells were cultured in vitro. At 24, 48 and 72 h after treatment of PDTC and MTX at different concentrations (0, 50, 100, 200 and 400 μmol/L) , MTT assay was used to observe the growth inhibition of MG-63 cells. The apoptosis was assessed by flow cytometry. The protein expression of livin was detected by Westem blotting. Results When PDTC and MTX were added, growth inhibition and increased apoptosis of MG-63 cells were detected. The protein expression level of livin was down-regulated obviously ( P ＜0. 05). Conclusion PDTC can promote the apoptosis of MTX-treated MG-63 cells, which may be correlated with down-regulation of the livin expression.     

甲氨蝶呤对人骨肉瘤MG-63细胞凋亡及28Livin和Caspase-3表达的影响

目的 观察甲氨蝶呤(MTx)对人骨肉瘤MG-63细胞凋亡及Livin和Caspase-3表达的影响.方法 体外培养骨肉瘤MG-63细胞株,用0、50、100、200和400μmol/L的MTX作用于骨肉瘤MG-63细胞24、48、72 h后,用噻唑蓝(MTT)比色法检测骨肉瘤MG-63细胞的增殖活性,用流式细胞仪测细胞的凋亡率,用Western blot检测不同浓度MTX作用于骨肉瘤MG-63细胞24 h后各组细胞的Livin和Caspase-3蛋白表达水平.结果 随MTX浓度增加骨肉瘤MG-63细胞的增殖活性降低,同时细胞的凋亡率增加(P＜0.05),随MTX浓度增加各组细胞中Livin蛋白的表达降低,Caspase-3蛋白表达增加(P＜0.05).结论 MTX诱导人骨肉瘤MG-63细胞凋亡,其机制可能与下调Livin表达继而上调Caspase-3表达有关.

Abstract：

Objective To observe the effect of Methotrexate (MTX) on apoptosis and expression of Livin and Caspase-3 in human osteosarcoma cell line MG-63. Methods After treatment of MG-63 cells with MTX at different concentrations (0, 50, 100,200,400 μmol/L) for 24, 48 and 72 h, methyl thiazol tetrazolium(MTT) assay was used to observe the growth inhibition of MG-63. The apoptosis was assessed by flow cytometry. The protein expression of Livin and Caspase-3 was detected by Western blotting. Results When MTX was added, growth inhibition and increased apoptosis of MG-63 cells were detected,which was showed in a dose- and time-dependent manner. MTX also down-regulated the level of the protein expression of Livin (P＜0.05), and elevated the protein expression of Caspase-3 (P＜0.05). Conclusion MTX can induce apoptosis of MG-63 cells, by down-regulating Livin expression and subsequently up-regulating Caspase-3 expression.     

miRNA-137在骨肉瘤中的作用及机制研究

[目的]通过转染miRNA-137至人骨肉瘤细胞MG-63,观察细胞内TWIST蛋白含量变化及其对细胞增殖活性的影响以探讨miRNA-137在骨肉瘤中的作用及机制。[方法]Target Scan预测miRNA-137与TWIST结合靶位;PCR扩增TWIST基因3’UTR区并克隆至荧光素酶报告基因表达载体;化学法合成miRNA-137 mimics,miRNA-137 inhibitor及NC序列,与荧光素酶报告基因表达载体共转染293细胞,48 h后检测荧光素酶活性;转染miRNA-137至MG-63细胞,转染后48 h,Real Time-PCR检测转染后细胞内miRNA-137含量,Western-blot检测细胞中TWIST蛋白含量变化;转染后0~72 h,CCK-8检测肿瘤细胞增殖活性。[结果]证实了miRNA-137与其靶基因TWIST的结合位点;miRNA-137 mimics转染MG-63细胞,可明显抑制细胞内TWIST蛋白表达,与对照组比较,差异有统计学意义(P0.05),而miRNA-137 inhibitor转染细胞后可明显增强胞内TWIST蛋白的表达,与对照组比较差异有统计学意义(P0.05));miRNA-137 mimics可明显抑制MG-63细胞对数期增殖活性,而miRNA-137 inhibitor则使细胞增殖活性进一步增强,相同时间点与对照相比较,均有差异(P0.05)。[结论]miRNA-137可以通过抑制其靶基因TWIST表达来抑制MG-63细胞增殖活性。     

丹参酮ⅡA通过下调KLF-4抑制骨肉瘤细胞增殖迁移

目的研究丹参酮ⅡA(TanⅡA)是否可以抑制骨肉瘤细胞株MG-63及其机制。方法用不同浓度的TanⅡA干预骨肉瘤细胞,Western blot检测各组中细胞增殖相关蛋白(p21、PCNA、ki-67)和细胞迁移相关蛋白(COL1A1、COL1A5、MMP-2、MMP-9)及KLF-4的表达情况;MTT法测细胞增殖情况、划痕试验观察细胞迁移情况;转染过表达KLF-4或空白对照质粒至离体培养的骨肉瘤细胞中,再用TanⅡA干预,检测骨肉瘤细胞表型转化情况。结果相比于对照组,TanⅡA组中骨肉瘤细胞增殖能力降低(P0.01),迁移减少(P0.01),p21表达增多(P0.05),PCNA、ki-67、COL1A1、COL1A5、MMP-2、MMP-9、KLF-4表达减少(P0.01)。转染KLF-4过表达质粒后,相比于对照组,转染KLF-4过表达质粒可以增加骨肉瘤细胞的增殖和迁移(P0.05),逆转TanⅡA对骨肉瘤细胞增殖迁移的抑制作用。结论 TanⅡA通过下调KLF-4抑制骨肉瘤细胞的增殖和迁移。     

脊索瘤中microRNA的差异性表达及其RNA编辑

目的 :检测脊索瘤组织中micro RNA(mi RNA)的差异性表达情况,探讨其RNA编辑。方法 :使用RTq PCR(Real-time quantitative polymerase chain reaction)技术检测骶骨脊索瘤组织11种候选mi RNA的表达水平,将其与髓核组织中的表达水平进行比较,对表达异常的mi RNA前体(pri-mi RNAs)的DNA和c DNA序列进行对比,检测是否存在RNA编辑。使用蛋白印迹法(Western blot)检测脊索瘤组织中RNA编辑的关键酶RNA腺苷脱氨酶(adenosine deaminase acting on RNA,ADARs)的表达。构建ADAR的表达载体,同时构建ERBB2和HOXA1的3′-非翻译区报告载体并转染mi RNA模拟物和抑制物,将其和ADAR的表达载体共转染至人胚肾细胞293T(HEK293T细胞),用q RT-PCR检测mi RNA的表达水平,并通过荧光素酶报告基因活性分析法对已测得异常表达的mi RNA的靶基因ERBB2和HOXA1进行活性分析,检测ADAR与测得异常表达的mi RNA的靶基因的关系。结果:与髓核组织相比,脊索瘤组织中mi R-10a和mi R-125a的相对表达程度明显下调(P<0.05)。脊索瘤组织中mi R-10a和mi R-125a的前体c DNA序列中出现了腺苷酸向鸟苷酸(A-G)突变,而在髓核组织中mi R-10a和mi R-125a前体的c DNA序列中无此改变,mi R-10a和mi R-125a在成熟过程中出现了A-I RNA编辑。4组脊索瘤组织中有3组存在ADAR1过度表达,2组存在ADAR2过度表达。转染了mi RNA抑制物的HEK293T细胞中ADAR1表达出现上调,而mi R-10a和mi R-125a的表达出现下调,mi R-10a的靶基因ERBB2和mi R-125a的靶基因HOXA1的荧光素酶活性显著增高;相反,转染了mi RNA模拟物的HEK293T细胞中ADAR1表达出现下调,而mi R-10a和mi R-125a的表达出现上调,ERBB2和HOXA1的荧光素酶活性显著降低。结论:ADAR1的过度表达可能通过介导A-I RNA编辑影响mi R-10a和mi R-125a的成熟和表达,参与脊索瘤发生中的细胞异常增殖调控。     

microRNA-616在肝癌中的表达及临床意义

目的:探讨micro RNA-616(mi R-616)在肝细胞癌(HCC)中的表达及临床意义。方法:应用实时定量PCR检测80例HCC患者的肿瘤组织与癌旁组织标本,以及正常肝细胞与不同分化程度的HCC细胞mi R-616表达;分析mi R-616表达与HCC患者临床病理因素及预后的关系;观察HCC细胞过表达或抑制mi R-616表达后侵袭及转移能力的变化。结果:与癌旁组织比较,HCC组织中mi R-616的表达明显升高,且复发患者明显高于非复发患者,有转移患者明显高于无转移患者(均P0.05);所有HCC细胞株的mi R-616表达均明显高于正常肝细胞,且在高侵袭性HCC细胞株中的表达明显高于低侵袭性HCC细胞株(均P0.05);mi R-616表达与HCC患者是否存在门静脉癌栓、Edmondson-Steiner分级、TNM分期有关(均P0.05);mi R-616表达是影响HCC患者生存的独立危险因素(P0.05),mi R-616高表达患者的总生存率和无病生存率均明显低于mi R-616低表达患者(均P0.05)。HCC细胞过表达mi R-616后侵袭迁移能力明显增强,mi R-616表达抑制后侵袭迁移能力明显减弱(均P0.05)。结论:mi R-616在HCC中表达升高,且mi R-616高表达与HCC不良预后密切相关。     

circPLOD2调节miR-217/ANLN轴对结肠癌细胞增殖、凋亡和免疫逃逸的影响

目的：探讨circ PLOD2对结肠癌细胞增殖、凋亡和免疫逃逸的影响以及对mi R-217/ANLN轴的调节机制。方法：将HT-29细胞分为NC组、si-NC组、si-circ PLOD2组、si-circ PLOD2+anti-mi R-NC组、si-circ PLOD2+anti-mi R-217组。q RT-PCR检测细胞中circ PLOD2、mi R-217、ANLN m RNA的表达；CCK-8法检测细胞增殖活性；流式细胞仪检测细胞凋亡；Western blot检测凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax及PD-L1的表达；ELISA检测免疫逃逸相关因子TNF-α、IL-2、IFN-γ的水平；双荧光素酶报告基因实验验证circ PLOD2、mi R-217、ANLN三者的靶向关系。结果：与si-NC组相比，si-circ PLOD2组HT-29细胞中circ PLOD2、ANLN水平、细胞增殖活性、Bcl-2、PD-L1表达降低（P<0.05）,mi R-217水平、细胞凋亡率、Bax表达以及TNF-α、IL-2、IFN-γ水平升高（P<0.05），且双荧光素酶基因报告实...     

染料木黄酮对骨肉瘤细胞增殖及侵袭的影响及作用机制

目的 探讨染料木黄酮对人骨肉瘤MG-63细胞增殖、侵袭的影响及其作用机制.方法 用染料木黄酮处理MG-63细胞,CCK-8法检测细胞增殖;Transwell小室体外侵袭实验法检测MG-63细胞侵袭能力;实时定量聚合酶链反应(PCR)和蛋白印迹法(Western blot)分别检测MG-63细胞基质金属蛋白酶(MMP)-2／MMP-9的mRNA及蛋白水平.结果CCK-8法表明染料木黄酮处理组MG-63细胞增殖被明显抑制,抑制率最高(85.3±5.1)％(P＜0.05);染料木黄酮在0、12.5、25.0、50.0 μmol/L时穿膜细胞数分别为(96.5±5.5)、(88.4±3.2)、(53.8±4.4)、(36.6±3.8)个,可明显降低MG-63细胞的侵袭能力(P＜0.05);染料木黄酮处理后MMP-2及MMP-9的mRNA表达水平明显下降(P＜0.05);MMP-2/MMP-9蛋白表达水平也明显下降,且具有时间依赖性.结论染料木黄酮抑制骨肉瘤MG-63细胞增殖及侵袭转移能力,这种作用与MMP-2及MMP-9表达变化有关.     

塞来昔布抑制骨肉瘤细胞黏附侵袭及其机制

目的 观察环氧合酶2(COX-2)抑制剂塞来昔布对骨肉瘤MG-63和U2-OS细胞增殖、黏附和侵袭的抑制作用,探讨其分子机制.方法 采用噻唑蓝(MTF)比色法、黏附实验、侵袭实验、流式细胞术和Western blot研究25、50、100 μmol/L 3种浓度塞来昔布对两种细胞株增殖、黏附、侵袭能力及CD44和基质金属酶(MMP)-9表达的影响.结果 3种浓度的塞来昔布作用48 h后MG-63细胞增殖抑制率分别为9.35%、42.68%、60.29%(P＜0.05),对U2-OS细胞的抑制率分别为2.59%、8.95%、29.36%(P＜0.05).对MG-63的黏附抑制率分别为8.6%、21. 5%、52.8%(P＜0.05);对U2-OS的黏附抑制率分别为1.6%、3.8%、19.0%(P＜0.05);对两种骨肉瘤细胞的侵袭能力、CD44和MMP-9的表达均有抑制作用,对高表达COX-2的MG-63的抑制效应更加显著.结论 塞来昔布可抑制骨肉瘤细胞的增殖、黏附和侵袭,这种作用与下调CD44和MMP-9的表达有关,此种效应具有COX-2依耐性.     

反义pEGFP-C1-Survivin对骨肉瘤细胞生物学行为的影响

目的 观察Survivin反义核酸载体对人骨肉瘤细胞株MG-63生物学行为的抑制效应,并探讨其机制.方法 MTY检测转染前后MG-63细胞增殖抑制率的变化,Boyden小室体外侵袭实验测定转染前后侵袭能力变化.逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测转染前后Ang-2基因mRNA表达的变化.结果 噻唑蓝(MTT)检测显示转染后骨肉瘤细胞增殖明显受抑制,转染组抑制率达到23.4%,与各对照组之间差异有统计学意义(P<0.01),脂质体组、空质粒组和空白组之间差异无统计学意义(P>0.05).RT-PCR分析显示转染组MG-63中Ang-2基因mRNA的表达较转染前明显下降,与其他组之间差异有统计学意义(P<0.01),而另3组之间差异无统计学意义(P>0.05).Boyden小室体外侵袭实验测定显示转染组侵袭百分数为17.9%,与其他各组间差异有统计学意义(P<0.01).结论 Survivin反义核酸可以显著抑制人骨肉瘤细胞株MG-63的增殖、侵袭能力,部分逆转其恶性表型,这可能与其下调Ang-2的表达有关.     

miR-96干扰NKD2表达对骨肉瘤MG63细胞株的增殖、凋亡的影响

目的探究miR-96通过干扰裸露角质蛋白同源物2(naked cuticle homolog 2,NKD2)的表达对骨肉瘤MG63细胞株的增殖、凋亡的影响。方法回顾性分析我院2013年9月至2018年2月收集的骨肉瘤标本57例临床资料作为研究组,同时收集距肿瘤边界5 cm的癌旁组织作为对照组,其中男39例,女18例;年龄21～49岁,平均(28.16±6.73)岁。将骨肉瘤MG63细胞株分为miR-96抑制组与空白对照组,其中miR-96抑制组细胞给予miR-96抑制剂转染,空白对照组细胞不作任何处理。培养48h后,采用实时荧光定量聚合酶链式反应(real time quantitative polymerase chain reaction, RT-qPCR)法与Western blot法检测各组人骨肉瘤MG63细胞中miR-96与NKD2蛋白表达水平;采用四甲基偶氮唑盐(methyl thiazolyltetrazolium assay, MTT)法检测各组细胞增殖情况;采用流式细胞仪检测各组细胞凋亡情况与细胞周期分布情况。结果骨肉瘤组织中miR-96表达水平明显高于正常骨组织(P0.05);骨肉瘤组织中NKD2蛋白表达水平明显低于正常骨组织(P0.05);miR-96抑制组骨肉瘤细胞中miR-96表达水平明显低于空白对照组(P0.05);miR-96抑制组骨肉瘤细胞中NKD2表达水平明显高于空白对照组(P0.05);miR-96抑制组骨肉瘤MG63细胞株经miR-96抑制剂转染48h后细胞相对吸光度明显低于空白对照组细胞(P0.05);miR-96抑制组骨肉瘤MG63细胞株细胞凋亡率明显大于空白对照组(P0.05);miR-96抑制组与空白对照组骨肉瘤MG63细胞株细胞周期情况差异明显(P0.05)。结论 miR-96在骨肉瘤组织中呈高表达,NKD2在骨肉瘤组织中呈低表达;miR-96通过抑制NKD2表达而促进骨肉瘤MG63细胞株生长,并抑制骨肉瘤MG63细胞株早期凋亡。     

miR-93-5p靶向调控Smad5表达抑制小鼠C3H10T1/2细胞成骨分化的研究

目的探讨mi R-93-5p是否通过靶向调控其预测靶基因Smad5的表达,从而抑制小鼠MSCs C3H10T1/2细胞的成骨分化。方法构建Smad5 3’-UTR-荧光素酶报告载体(pmi R-RB-REPORTTM),通过双荧光素酶报告基因检测,观察mi R-93-5p对Smad5 3’-UTR荧光素酶活性的影响,鉴定Smad5是否为mi R-93-5p的靶基因。将mi R-93-5p mimics(M组)与mi R-93-5p inhibitor(In组)及其对应的阴性对照组mi R-93-5p mimics阴性对照(MC组)与mi R-93-5p inhibitor阴性对照(In C组)分别转染至C3H10T1/2细胞中,并进行成骨诱导培养,48 h后分别采用实时荧光定量PCR(real-time fluorescent quantitative PCR,q RT-PCR)及Western blot检测各组细胞Smad5在m RNA及蛋白水平的相对表达量;14 d后通过茜素红染色检测各组细胞外钙盐的沉积情况,了解mi R-93-5p对C3H10T1/2细胞成骨分化的调控效应。结果双荧光素酶报告基因检测结果显示,mi R-93-5p能与Smad5 m RNA3’-UTR特异性结合,抑制其荧光素酶活性(P0.05)。q RT-PCR检测示,M组及In组Smad5的m RNA相对表达量与对应阴性对照组MC组及In C组比较差异均无统计学意义(P0.05);Western blot检测示,M组及In组Smad5蛋白相对表达量与对应阴性对照组比较差异均有统计学意义(P0.05),其中M组较MC组表达量下调,而In组则较In C组表达量上调。茜素红染色示,M组钙盐沉积较MC组明显减少,而In组则较In C组钙盐沉积明显增多。结论Smad5是mi R-93-5p的靶基因,mi R-93-5p可通过靶向调控Smad5的表达,抑制小鼠C3H10T1/2细胞成骨分化。     

全反式维甲酸联合干扰素-β对人骨肉瘤细胞株MG-63的生长抑制作用

目的 观察全反式维甲酸(ARTA)联合干扰素(IFN)-β对人骨肉瘤细胞株MG-63的生长抑制试验以及对干扰素/维甲酸联合应用诱导凋亡的相关基因19( GRIM-19)和原癌基因信号转导与转录激活因子-3( STAT3)的表达的影响.方法 噻唑蓝(MTT)比色法检测不同药物浓度的ATRA/IFN-β,单用或联合应用对MG-63的增殖抑制率；流式细胞仪AnnexinV-FITC/PI法检测MG-63的凋亡；逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测MG-63中STAT3与GRIM-19基因的扩增情况；Western blot检测MG-63中STAT3与GRIM-19蛋白的表达.结果 ARTA和IFN-β单用或联合应用均可抑制MG-63的增殖,呈浓度依赖性并与作用时间有关；联合应用抑制作用明显增强,与其他组比较差异有统计学意义(P＜0.05).ARTA、IFN-β单独作用,可诱导MG-63凋亡；联合应用时,诱导凋亡作用显著增强.ARTA联合IFN-β作用,GRIM-19 mRNA的表达明显增强(1.620±0.095),GRIM-19蛋白明显升高(1.850±0.060),与其他组比较差异有统计学意义(P＜0.01).STAT3 mRNA的表达明显降低(0.120 ±0.032),STAT3蛋白明显降低(0.540±0.075),与其他组比较差异有统计学意义(P＜0.01).结论 ARTA/IFN-β作用,可明显抑制MG-63的增殖并诱导其凋亡,其机制可能是诱导GRIM-19高表达,特异性结合于STAT3的转录活性区域,使原癌基因STAT3的表达降低.     

长链非编码RNA RUSC1-AS1对肝细胞癌恶性生物学行的影响及其与微小RNA-326的关系

背景与目的:有研究表明长链非编码RNARUSC1-AS1(lnc RNARUSC1-AS1)与肿瘤的恶性生物学行为密切相关,但其对肝细胞癌(肝癌)的影响尚不清楚。笔者前期研究显示,lnc RNARUSC1-AS1与微小RNA-326(mi R-326)存在结合位点,因此本研究探讨lnc RNARUSC1-AS1在肝癌中的表达,以及是否通过靶向mi R-326调控肝癌细胞生物学行为。方法:用q RT-PCR检测41例肝癌组织和对应癌旁组织中lnc RNARUSC1-AS1与mi R-326的表达。以lnc RNARUSC1-AS1表达抑制质粒/阴性对照质粒、mi R-326模拟物/阴性对照序列、mi R-326抑制物/阴性对照序列为工具,采用MTT法、Transwell法、流式细胞术、Westernblot法观察接受不同转染处理的MHCC97-H细胞的增殖能力、迁移和侵袭能力、凋亡以及相关蛋白表达的变化。采用荧光素酶报告实验分析lnc RNARUSC1-AS1和mi R-326的靶向关系,并用q RT-PCR验证。结果:与癌旁组织比较,肝癌组织中lnc RNARUSC1-AS1表达水平明显升高,mi R-326表达水平明显降低(均P0.05)。转染lnc RNARUSC1-AS1表达抑制质粒或mi R-326模拟物后,肝癌MHCC97-H细胞的增殖能力以及迁移与侵袭能力明显降低,细胞凋亡率明显升高,cyclinD1、MMP-2、MMP-9、Bcl-2蛋白表达水平明显降低,P21、Bax蛋白表达水平明显升高(均P0.05)。MHCC97-H细胞转染lnc RNARUSC1-AS1表达抑制质粒的同时mi R-326抑制物,前者对MHCC97-H细胞以上作用被取消(均P0.05)。双荧光素酶报告实验及q RT-PCR验证结果显示,mi R-326为lnc RNARUSC1-AS1的靶分子。结论:lnc RNARUSC1-AS1在肝癌中表达上调,其可通过靶向调控mi R-326的表达促进肝癌细胞的恶性生物学行。     

靶向Survivin的小分子干扰RNA对骨肉瘤细胞的体内外抑制作用

目的 观察靶向Survivin基因的小分子干扰RNA(siRNA)表达载体对人骨肉瘤细胞MG-63的体内外抑制作用.方法 体外构建Survivin siRNA表达载体pSilence2.1-neo-Survivin,转染骨肉瘤细胞株MG-63、逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、免疫组织化学(SP)法检测转染前后Survivin mRNA及蛋白的表达,流式细胞仪检测细胞周期分布,吖啶橙荧光染色法观察细胞凋亡,建立裸鼠移植瘤模型,记录瘤体形成时间及肿瘤生长.结果 转染后MG-63细胞Survivin基因mRNA水平和蛋白表达显著下降,转染后mRAN表达抑制率为85.08%,增殖指数为空白组的28.20%;细胞周期分析显示:shRNA组G0/G1期细胞明显增多,而G2/M期、S期细胞数目减少;吖啶橙染色显示转染组细胞出现明显核碎裂等凋亡改变,转染组凋亡率为24.54%;稳定转染组细胞裸鼠体内致瘤能力降低,转染组成瘤时间为(13.2±2.0)d,空白组为(6.5±1.6)d,两者比较差异有统计学意义(P＜0.01).4周时同空白组相比转染组瘤体体积小62.89%(P＜0.01),重量轻59.07%(P＜0.01).结论 靶向Survivin基因的siRNA表达载体可以显著抑制骨肉瘤细胞MG-63增殖,促进细胞凋亡;明显抑制人骨肉瘤细胞的致瘤活性及裸鼠移植瘤的生长.     

人参皂苷CK对人骨肉瘤细胞MG-63的凋亡诱导作用

[目的]探讨人参皂苷CK对人骨肉瘤细胞MG-63的凋亡诱导作用及其具体作用机制。[方法]MG-63细胞分为空白对照组和CK药物处理组。采用MTT法检测细胞活性及增殖能力,倒置显微镜下观察细胞凋亡形态。细胞凋亡形态检测、Hoechst细胞核染色及Annexin V/PI细胞凋亡实验检测药物CK对细胞的诱导凋亡作用;Western blotting检测凋亡相关蛋白Caspase-9、Bcl-2及BAX的表达,研究其具体凋亡机制。[结果]CK能够显著降低MG-63的体外活性及生存率(P<0.05);细胞凋亡形态检测、Hoechst细胞核染色及Annexin V/PI细胞凋亡实验证明CK可诱导MG-63凋亡(P<0.05);CK处理后MG-63细胞表达的Caspase-9及BAX表达上调,相反Bcl-2表达下调(P<0.05)。[结论]人参皂苷CK对人骨肉瘤细胞MG-63具有凋亡诱导作用,而以Caspase-9为关键因素的线粒体凋亡途径在此凋亡中起着决定性作用。     

Notch1 siRNA对乏氧环境骨肉瘤细胞MG-63增殖及周期的影响

[目的]探讨Notch1 siRNA对乏氧环境人骨肉瘤细胞MG-63细胞增殖和周期的影响。[方法]将骨肉瘤细胞株MG-63细胞置于乏氧(37℃、1%O2、5%CO2)环境下培养作为实验组,以正常氧环境(37℃、21%O2、5%CO2)下培养作为对照组,培养72 h,应用MTT方法检测不同时间乏氧培养对MG-63细胞增殖的影响;采用Notch siRNA转染乏氧环境中的MG-63细胞,MTT方法检测细胞增殖变化;流式细胞术检测细胞周期的变化;Western blot检测细胞HIF-1a、Notch1蛋白表达变化。[结果]乏氧培养可促进MG-63细胞增殖,48 h常氧及乏氧对细胞增殖的作用可见明显差异(2.164±0.075 vs 1.421±0.086)(P<0.01)。流式细胞分析显示实验组、对照组MG-63细胞培养48 h G1/G2期细胞比例分别为(41.79±3.25)%和(53.87±2.31)%(P<0.05),乏氧可以促进细胞周期进展,Notch1 siRNA有效下调乏氧MG-63细胞Notch1蛋白表达,Notchl siRNA作用48 h后乏氧环境MG-63细胞周期阻滞于G1/G2期。Western-blot结果显示乏氧环境下MG-63细胞HIF-1a、Notch1蛋白表达增高。[结论]乏氧环境能通过促进MG-63细胞周期进展,从而明显促进细胞增殖,阻断Notch可逆转乏氧对MG-63细胞促增殖作用,提示Notchl是治疗骨肉瘤的有效分子靶点。     

miR-526b在胰腺癌中的表达及作用

目的:探讨mi R-526b在胰腺癌中的表达与作用。方法:用q RT-PCR法检测mi R-526b在52例胰腺癌和癌旁组织,以及在4种胰腺癌细胞系(Bx PC-3、SW1990、PANC-1和As PC-1)和正常胰腺导管上皮细胞系(HPDE6-C7)中的表达。将胰腺癌细胞分别转染mi R-526b模拟物、mi R-526b抑制物及阴性对照序列后,采用CCK-8、Transwell实验和流式细胞术分别测定细胞增殖、侵袭与凋亡情况。生物软件和双荧光素酶报告基因法分析mi R-526b潜在靶基因,并用Western blot和q RT-PCR法及相关性分析验证。结果:mi R-526b在胰腺癌组织中表达量明显低于癌旁组织,在4种胰腺癌细胞系中的表达量均明显低于人正常胰腺导管上皮细胞(均P0.05)。胰腺癌细胞转染mi R-526b模拟物后,增殖能力明显降低、细胞凋亡率明显升高、侵袭能力明显减弱,而转染mi R-526b抑制物后则呈反向变化(均P0.05)。分析结果显示XRCC5是mi R-526b靶基因;胰腺癌细胞转染mi R-526b模拟物后,XRCC5的m RNA和蛋白表达均明显下调,mi R-526b抑制物后则均明显上调(均P0.05);胰腺癌组织中mi R-526b和XRCC5 m RNA表达水平呈显著负相关(r=-0.456,P0.05)。结论:mi R-526b在胰腺癌中下调表达,mi R-526b低表达可促进胰腺癌细胞增殖、侵袭并抑制凋亡,机制可能与上调其靶基因XRCC5的表达有关。