siRNA转染对大鼠髓核细胞TRAIL表达和细胞行为的影响

[目的]探讨siRNA转染对大鼠髓核细胞TRAIL表达和细胞行为的影响。[方法]采用弯曲鼠尾法建立椎间盘退变模型。处死动物。取退变椎间盘组织分离培养髓核细胞。P1髓核细胞分为4组,分别为空白对照组、TRAIL-siRNA转染组(siTRAIL组)、TNF-α处理组(TNF-α组)和TNF-α处理+TRAIL-siRNA转染组(TNF-α+siTRAIL组)。采用MTT法检测P1髓核细胞增殖,流式细胞仪检测细胞凋亡,Western blot法检测髓核细胞Caspase-3的活性和表达。[结果]相较于空白对照细胞,TRAIL siRNA转染对细胞增殖、凋亡、Caspase-3的表达无明显影响(P0.05);TNF-α处理引发髓核细胞增殖显著下降(P0.05),而凋亡率显著升高(P0.05),Caspase-3的表达显著升高(P0.05)。TNF-α处理后再用TRAIL-siRNA转染可显著逆转TNF-α对细胞增殖、凋亡和Caspase-3表达的影响(P0.05)。[结论] TRAIL siRNA转染可沉默TRAIL表达,从而逆转TNF-α诱导大鼠髓核细胞增殖抑制、细胞凋亡和Caspase-3表达。     

A20介导TNF-α炎症微环境下髓核细胞衰老的机制研究

目的 :探讨锌指蛋白A20[也称为肿瘤坏死因子诱导蛋白3(tumor necrosis factor-induced protein 3,TNFAIP3)]在肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factorα,TNF-α)炎症微环境下髓核细胞(nucleus pulposus cells,NPCs)衰老发生机制。方法:体外分离培养SD大鼠髓核细胞。实验分为三组:正常对照组(只加入正常培养基)、TNF-α干预组(加入不同浓度的TNF-α,10ng/ml、50ng/ml、100ng/ml)和自然衰老组(在体外通过细胞不断增长传代至P20代)。应用CCK-8细胞增殖实验﹑β半乳糖苷酶染色﹑Western blot(WB)、QT-PCR、immunofluorescence(IF)从基因、蛋白及细胞功能水平评估髓核细胞衰老变化。应用WB、QT-PCR和IF检测锌指蛋白A20﹑NF-κB(p65)﹑NF-k B(p-p65/phospho S536)表达情况。结果 :与正常对照组相比,TNF-α干预48h、72h后髓核细胞的增殖能力明显降低;TNF-α干预组和衰老组β半乳糖染色阳性率较对照组明显增高;QT-PCR结果提示,与对照组比,TNF-α干预组p53表达增加(P0.05),而A20表达随着TNF-α浓度增高而降低;衰老组A20表达较对照组减少,而p53扩增升高。WB检测显示:TNF-α可以诱导p53﹑A20、p-p65表达上调,而A20表达随着TNF-α浓度增加而降低;同时衰老组A20表达较对照组减少,而p-p65和p53表达增加(P0.05);IF显示:与对照组对比,TNF-α处理下A20﹑p-p65表达增加,但是A20的表达随着TNF-α增加而降低,衰老组A20较对照组也明显降低,p-p65表达增加。结论:髓核细胞衰老程度与TNF-α干预存在剂量关系,TNF-α可以刺激髓核细胞A20表达升高,并激活NF-κB信号通路。而A20表达情况受细胞衰老程度影响,随着髓核细胞衰老A20所参与的作用效能逐渐减低。     

腰退行性病变与TRALL基因之间关系的研究

[目的]探讨腰椎间盘退行性病变与肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand, TRAIL)基因之间的相关性及临床意义。[方法]取60例腰椎间盘突出症患者(退变组)和同期60例因创伤手术患者(未退变组)髓核组织。行组织化学染色。体外实验方面,分离细胞培养后,分为4组,分别为空白对照、TRAIL siRNA转染、TNF-α处理和TNF-α处理+TRAIL-siRNA转染组。采用MTT法检测细胞增殖,流式细胞仪检测细胞凋亡,Western blot法检测髓核细胞Caspase-3的活性和表达。[结果]Tunel染色显示凋亡阳性细胞率退变组为48.92%,未退变组为5.23%;TRAIL蛋白表达阳性率退变组为49.11%,未退变组为12.25%,两组间的差异均有统计学意义(P0.05)。体外试验方面,相较于空白对照细胞,TNF-α处理细胞的增殖显著下降(P0.05),而凋亡率显著升高(P0.05),Caspase-3的表达显著升高(P0.05)。TRAIL siRNA转染对细胞增殖、凋亡、Caspase-3的表达无明显影响(P0.05),TNF-α处理后再用TRAIL-siRNA转染可显著逆转TNF-α对细胞增殖、凋亡和Caspase-3表现的影响(P0.05)。[结论]髓核TRAIL阳性表达细胞率与凋亡细胞率呈正相关,TRAIL沉默能显著逆转TNF-α诱导的髓核细胞增殖抑制、细胞凋亡及Caspase-3的表达。     

SDF1/CXCR4轴通过PI3K/AKT通路对退变椎间盘血管长入发挥作用

[目的]观察SDF1/CXCR4对髓核细胞(NPCs)诱导血管内皮细胞(VECs)成血管能力的影响。[方法]通过病毒转染上调原代髓核细胞中基质细胞衍生因子1(SDF1)表达,并根据表达量分为D组和UP组,将不同分组的髓核细胞(或条件培养基)与血管内皮细胞进行共培养,分别进行细胞计数试剂盒8(CCK8)、细胞迁移实验、管腔形成实验,以观察髓核细胞对于血管内皮细胞成血管能力的影响。[结果]在mRNA和蛋白水平检验证实SDF1表达在UP组上调成功。NPCs和VECs共培养后,UP组VECs中pAKT水平较D组显著升高,PTEN水平较D组下降,差异均具有统计学意义。后续的共培养体系中,UP组的VECs在细胞活力、迁移能力、形成管腔样结构能力上较D组均显著增强,差异具有统计学意义。加入MK-2206后,UP+MK-2206组在细胞活力、迁移能力、管腔样结构形成能力上较UP组均显著下降,差异具有统计学意义。加入SF1670后,UP+SF1670组的细胞活力、迁移能力、管腔样结构形成能力均较UP组进一步增强,差异具有统计学意义。[结论]本实验通过体外培养证明退变髓核细胞可通过SDF1/CXCR4信号轴来诱导血管内皮细胞成血管活动,并且这一活动在内皮细胞内通过PI3K/AKT通路调控。     

肿瘤坏死因子-α对人髓核间充质干细胞衰老的影响

[目的]探索肿瘤坏死因子-α (tumor necrosis factor-α, TNF-α)对人髓核间充质干细胞的衰老的影响。[方法]分离培养第三代正常人髓核间充质干细胞（human nucleus pulposus mesenchymal stem cells, HNPMSCs）,分为空白对照组和TNF-α组,分别加入无血清培养基与TNF-α浓度为100 ng/ml的无血清培养基干预48 h。镜下观察细胞形态,并用细胞衰老β半乳糖苷酶试剂盒染色,对细胞衰老情况进行观察;CCK-8检测第1、3、5、7、9、11、13、15 d后的细胞增殖活性;Western Blot检测衰老相关蛋白P53、P16表达情况。[结果]镜下观察及β半乳糖苷酶染色均可见TNF-α组细胞呈衰老状态。CCK-8检测,随时间推移两组细胞CCK-8检测光密度（optimal density, OD）值均显著增加（P<0.05）。相应时间点两组间比较,第1～7d,两组间的人NPMSCs增殖活性OD值的差异无统计学意义（P>0.05）;而第9～15 d,TNF-α组的人NPMSCs的OD值均显著低于空白对照...     

低浓度TNF-α对大鼠髓核间充质干细胞增殖及迁移的影响

[目的]探讨低浓度TNF-α对大鼠髓核间充质干细胞(nucleus pulposus derivedstem cells,NPSCs)增殖及迁移特性的影响。[方法]差速贴壁法从SD大鼠尾椎髓核组织中分离NPSCs,体外培养,镜下观察细胞形态和生长状况;取P3代细胞利用流式细胞仪鉴定干细胞表面抗原;使用诱导培养基进行三系诱导分化,3周后分别用茜素红、油红O、阿利辛蓝染色观察成脂、成骨、成软骨能力。用含不同浓度(0、0.1、1、10 ng/ml)TNF-α的血清培养液培养P3代细胞,0、1、3、5、7 d后CCK-8法检测细胞增殖活力(OD值),划痕实验及Transwell迁移实验比较各组细胞迁移能力。[结果]P0代细胞呈集落样生长,细胞形态呈纺锤状。P3代细胞免疫表型鉴定MSCs表面分子标记CD90、CD29、CD44表达比例分别高达96%、99%、97%以上,低表达CD45、CD34(低于5%和4%)。茜素红、油红O及阿利新蓝染色证实分离的细胞可向骨、脂肪及软骨分化。按照ISCT有关MSCs的判定标准,分离的细胞即NPSCs。用含TNF-α培养液培养髓核间充质干细胞1、3、5、7 d后,与对照组相比,低浓度的TNF-α均促进了NPSCs的增殖。Transwell及划痕实验表明随着TNF-α浓度的增加,NPSCs的迁移能力上升。[结论]低浓度的TNF-α(0.1~10 ng/ml)能促进NPSCs增殖及迁移能力。     

过表达NDRG2基因促进人髓核细胞衰老的体外实验研究

[目的]研究NDRG2(N-Myc downstream-regulated gene 2)对人髓核细胞衰老的影响,进而探讨NDRG2在椎间盘退变中的作用。[方法]通过慢病毒过表达NDRG2基因稳定感染髓核细胞。设立正常髓核细胞组(空白组)、红色荧光蛋白标记的慢病毒感染髓核细胞组(对照组)及过表达NDRG2慢病毒感染髓核细胞组(实验组)。Western blot检测NDRG2蛋白表达水平,细胞衰老相关β半乳糖苷酶(senescence associated-β-galactosidase,SA-β-ga1)染色检测髓核细胞衰老变化,流式细胞仪检测髓核细胞周期变化,MTT法绘制生长曲线,并分析髓核细胞的增殖情况。[结果]正常髓核细胞感染过表达NDRG2慢病毒48 h后荧光显微镜下观察基因感染效率在95%以上;感染72 h后Western blot检测示NDRG2表达明显升高(P0.01);实验组SA-β-gal染色阳性率明显高于对照组和空白组(P0.01);MTT生长曲线显示慢病毒感染后髓核细胞增殖速度较对照组和空白组均减慢,潜伏期延长,缓慢进入对数期;细胞周期结果示实验组G0/G1期百分比明显高于对照组和空白组,S期明显低于对照组和空白组,差异有统计学意义(P0.05)。[结论]NDRG2基因过表达的髓核细胞衰老速度明显加快,提示NDRG2可能通过调控髓核细胞的衰老参与椎间盘退变过程,为椎间盘的退变生物学治疗提供依据。     

血红素氧合酶1对TNF-α诱导的人退变椎间盘髓核细胞凋亡的作用研究

目的探讨血红素氧合酶1(heme oxygenase 1,HO-1)对TNF-α诱导的人退变椎间盘髓核细胞凋亡的作用及其可能的分子机制。方法取腰椎间盘突出症患者自愿捐赠的椎间盘组织,体外培养人退变髓核细胞并传代,取第3代细胞进行实验。采用细胞计数试剂盒8测定不同浓度(10、20、50、100和200 ng/mL)TNF-α对髓核细胞活性的影响,筛选最佳刺激浓度进行下一步实验。将髓核细胞分成4组,分别采用单纯基础培养液(对照组)、TNF-α刺激(TNF-α组)、TNF-α和CoPP 10μmol/L刺激(CoPP组)、TNF-α和ZnPP 15μmol/L刺激(ZnPP组)培养,24 h后采用Hoechst染色以及流式细胞仪检测细胞凋亡;Western blot检测凋亡相关蛋白活化型Caspase-3(cleaved Caspase-3)、上皮膜蛋白1(epithelial membrane protein 1,EMP-1)以及HO-1、p-P65的表达。为进一步探讨HO-1对髓核细胞凋亡的潜在分子机制,取髓核细胞分别采用TNF-α刺激(TNF-α刺激组)以及TNF-α和吡咯烷二硫基甲酸(pyrrolidine dithiocarbamate,PDTC)5μmol/L刺激(TNF-α+PDTC刺激组)培养24 h,采用流式细胞仪检测髓核细胞凋亡率。结果经检测确定TNF-α最佳抑制浓度为100 ng/mL。Hoechst染色示,对照组和CoPP组凋亡细胞较少;TNF-α组和ZnPP组可见凋亡样改变细胞核,其中ZnPP组最显著。流式细胞仪检测示,与对照组相比,TNF-α组、CoPP组及ZnPP组细胞凋亡率均显著提高(P0.05);与TNF-α组相比,CoPP组细胞凋亡率显著降低(P0.05),而ZnPP组显著提高(P0.05)。Western blot检测示,与对照组相比,TNF-α组HO-1蛋白表达降低,cleaved Caspase-3、EMP-1及p-P65蛋白表达升高(P0.05)。与TNF-α组相比,CoPP组HO-1蛋白表达明显升高,cleaved Caspase-3、EMP-1、p-P65蛋白表达明显降低(P0.05);而ZnPP组HO-1蛋白表达明显降低(P0.05),cleaved Caspase-3、EMP-1蛋白表达增高(P0.05),p-P65蛋白表达无明显变化(P0.05)。与TNF-α刺激组相比,TNF-α+PDTC刺激组细胞凋亡率明显降低(t=3.076,P=0.031)。结论 HO-1能够抑制TNF-α诱导的人椎间盘髓核细胞凋亡,其机制可能是通过调控NF-кB通路得以实现。     

脂联素对人髓核细胞增殖凋亡的调控作用

目的探讨脂联素在人髓核细胞增殖和凋亡中发挥的作用,并且研究其初步机制。方法提取并培养人髓核细胞、构建脂联素受体慢病毒(LV-sh Adipo R1和LV-sh Adipo R2)和对照空载体病毒,将病毒转染至人髓核细胞。肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-alpha,TNF-α)诱导髓核细胞凋亡模型,采用流式细胞仪、TUNEL实验和CCK8试剂盒检测脂联素调控髓核细胞增殖凋亡的作用。结果 TNF-α能抑制髓核细胞增殖并诱导其凋亡,脂联素能逆转TNF-α对髓核细胞增殖和凋亡的调控作用(P0.05)。Adipo R1/2沉默后,髓核细胞增殖受到抑制、凋亡升高,以Adipo R2为著(P0.05)。结论脂联素能够通过两个受体(Adipo R1、Adipo R2)调控髓核细胞增殖和凋亡。     

维生素C对TNF-α及血清剥夺诱导的人髓核细胞凋亡的作用

目的探讨维生素C(Vitamin C,Vit C)在TNF-α及血清剥夺诱导人椎间盘髓核细胞凋亡中的作用及机制。方法取脊柱矫形手术患者的髓核组织,消化法获得正常髓核细胞,取第3代细胞按不同处理因素分为Vit C作用组(A组)、TNF-α诱导组(B组)和血清剥夺组(C组),每组再分为以下亚组:A组分为A1组(基础培养液)、A2组(100μg/m L Vit C)、A3组(200μg/m L Vit C);B组分为B0组(对照组)、B1组(100 ng/m L TNF-α)、B2组(100μg/m L Vit C+100 ng/m L TNF-α)、B3组(200μg/m L Vit C+100 ng/m L TNF-α);C组分为C0组(对照组)、C1组(FBS浓度由8%降低为2%)、C2组(2%FBS+100μg/m L Vit C)、C3组(2%FBS+200μg/m L Vit C)。各组作用24 h后,采用流式细胞术检测各组膜联蛋白V、碘化丙啶双染后髓核细胞凋亡率;实时荧光定量PCR检测p53(基因编码相对分子质量为53×103的蛋白质)、脂肪酸合成酶(fatty acid synthase,FAS)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(Caspase3)、Ⅰ型胶原、Ⅱ型胶原、Sox9和糖胺多糖(Aggrecan)m RNA表达。结果 A组:与A1组比较,A2、A3组的Vit C均能降低髓核细胞凋亡及p53、FAS、Caspase 3 m RNA表达(P0.05),但A2、A3组间比较差异无统计学意义(P0.05);A2、A3组的Vit C可促进髓核细胞Ⅰ型胶原、Ⅱ型胶原、Aggrecan、Sox9 m RNA表达,且A3组促进作用显著大于A2组(P0.05)。B组:与B0组比较,B1组TNF-α促进了髓核细胞凋亡,增加了髓核细胞p53、FAS、Caspase 3 m RNA表达(P0.05);与B1组比较,B3组的Vit C能降低髓核细胞凋亡及p53、FAS、Caspase 3 m RNA表达,而B2组的Vit C则增加其凋亡及p53、FAS、Caspase 3 m RNA表达,差异均有统计学意义(P0.05)。C组:与C0组比较,C1组2%FBS能诱导髓核细胞凋亡,但降低了髓核细胞p53、FAS、Caspase 3 m RNA表达(P0.05);与C1组比较,C3组的Vit C能降低髓核细胞凋亡及p53、FAS、Caspase 3 m RNA表达,而C2组的Vit C则增加其凋亡及p53、FAS m RNA表达,差异有统计学意义(P0.05)。结论 Vit C能延缓或降低髓核细胞凋亡、促进细胞外基质合成与分泌,200μg/m L Vit C可延缓或降低100 ng/m L TNF-α和2%FBS诱导的凋亡,而100μg/m L Vit C则促进其诱导的凋亡。     

DNT细胞对肿瘤细胞作用的研究进展

DNT细胞(CD4-CD8-double-negative T cells)是新发现的一种免疫细胞,其特点是细胞表而既不表达CD4分子同时也不表达CD8分子.近年来,通过免疫疗法可以使肿瘤患者的愈后及生存质量得到很大的改善和提高.免疫细胞可以通过免疫调节或直接杀伤的途径作用于肿瘤细胞,因此研究DNT细胞对肿瘤细胞的作用将有重要意义.     

干细胞诱导分化为雄激素分泌细胞的研究进展

睾丸间质细胞是男性体内产生雄激素的主要细胞。干细胞可被诱导分化为具有雄激素分泌功能的睾丸间质样细胞,从而使其功能受到下丘脑与垂体调控,精确分泌维持生理功能需要的激素。故建立一套可靠高效的将干细胞诱导为雄激素分泌细胞的方法,对于治疗由于睾丸间质细胞异常引起的性腺功能低下意义重大。本文对近年来关于干细胞诱导分化为雄激素分泌细胞的研究进展予以综述。     

骨髓间充质干细胞定向肝细胞样分化的研究

目的探讨骨髓间充质干细胞定向肝细胞样分化的诱导条件，为肝组织工程提供新的种子细胞来源。方法分离小鼠骨髓间充质干细胞，在特定肝细胞培养液中用肝细胞生长因子(HGF)和表皮细胞生长因子(EGF)定向诱导。在倒置显微镜下观察细胞形态。应用免疫荧光法鉴定细胞性质。结果骨髓间充质干细胞经HGF和EGF诱导7d后变为肝细胞样圆形；2周后免疫荧光染色可见分化后细胞表达肝细胞标志物CK18和白蛋白。结论骨髓间充质干细胞在特定条件诱导下可以向肝细胞方向分化。有可能作为肝组织工程的种子细胞来源。     

干细胞向生殖细胞分化的研究进展

干细胞(SCs)具有在体外分化为生殖细胞的潜能,为研究生殖细胞(GCs)早期发育提供了良好的模型,并将为干细胞移植修复生殖功能提供细胞资源。本文综述了胚胎干细胞/诱导多能干细胞(ESCs/iPSCs)、新生儿附属物来源干细胞(NDSCs)以及成体干细胞(ASCs)向生殖细胞分化所取得的研究进展,同时总结了各类干细胞向生殖细胞分化时所遇到的障碍及所面临的挑战,为干细胞在生殖医学领域的应用提供理论依据。     

体外分层渗透共培养研究胆管癌细胞株QBC939对正常内皮细胞的作用

目的 在体外分层渗透共培养体系中研究胆管癌细胞对正常内皮细胞的作用.方法 建立胆管癌细胞株QBC939与正常内皮细胞的体外分层渗透共培养体系,以同期单独培养的正常内皮细胞为对照,用免疫荧光法检测内皮细胞与胆管癌细胞共培养后,内皮细胞F-actin,pp125FAK,蛋白水解酶MMP-2、MMP-9、uPA蛋白表达变化,用Realtime PCR,Western印迹检测内皮细胞共培养前后,ppl25FAK,MMP-2、MMP-9、uPA的mRNA及蛋白表达变化.结果 与同期单独培养的正常内皮细胞对照相比,内皮细胞F-actin表达增强,pp125FAK、MMP-2、MMP-9、uPA的mRNA及蛋白表达增加(P<0.01).结论 胆管癌细胞能通过旁分泌作用导致内皮细胞骨架系统改变,并能诱导内皮细胞蛋白水解酶的基因表达及蛋白合成,表明肿瘤细胞对邻近内皮细胞还可以通过肿瘤细胞的内分泌、旁分泌等作用分泌各种细胞因子,作用于内皮细胞上的特异性受体,发挥其对内皮细胞mRNA表达的调控作用,而导致内皮细胞发生形态、行为的改变.     

Isolation of hepatocyte-like cells from mouse embryoid body cells

We previously reported that embryoid body (EB) cells derived from embryonic stem (ES) cells are capable of differentiating into functional hepatocyte-like cells both in vitro and in vivo. Because transplantation of EB-derived cells into the liver via the spleen resulted in a low incidence of teratoma formation, purification of hepatocyte-like cells is required to prevent teratoma formation. The aim of this study was to purify hepatocyte-like cells from cultured EBs. For the isolation of hepatocyte-like cells, EBs cultured for 15 days were treated with trypsin-EDTA. The disaggregated cells were plated on a gelatin-coated dish as a monolayer. These cells were separated by Percoll gradient centrifugation, enriched by magnetic cell sorting, and purified by FACS. The purified hepatocyte-like cells in monolayer cultures were positive for immunostaining for albumin and expressed albumin mRNA, but not Oct3/4 mRNA. Transplantation of the purified hepatocyte-like cells derived from mouse ES cells might be an effective treatment for liver failure.     

Neuroblastoma cells inhibit the immunostimulatory function of dendritic cells

Purpose

Dendritic cells (DC) are critical for induction of antitumor immunity. Recent studies suggest that tumors may avoid immune destruction by inhibiting DC function. The authors investigated the effect of neuroblastoma (NB) on surface antigen expression and T cell activation by DCs.

Methods

DCs were generated in the presence of granulocyte and macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) and interleukin 4 (IL-4) from peripheral blood of healthy donors. On day 6 of culture, DCs were exposed to human NB cells and were analyzed by flow cytometry.

Results

The proinflammatory cytokine tumor necrosis factor alpha (TNF-α) failed to upregulate the expression of HLA-DR and costimulatory molecule CD86 by DCs that were cultured with NB. Conversely, upregulation was preserved when DCs were cultured in the absence of NB. Exposure to NB also led to apoptosis of DCs as shown by 2-fold increase in surface phosphatidylserine. It appears that direct contact was required to inhibit DC maturation, because DCs separated from NB cells using a transwell insert did not suppress surface antigen expression. Finally, DCs exposed to NB inhibited the proliferation of allogeneic T cells in mixed lymphocyte reactions.

Conclusions

These findings have significant implications for tumor-pulsed DC vaccines in the treatment of NB and suggest a mechanism by which NB escape rejection.     

骨髓间质干细胞体外转化为肌细胞的研究

目的 采用骨髓间质干细胞（MSCs)体外转化为肌细胞，为心衰的干细胞移植治疗提供新的细胞材料，方法 抽取贵州香猪骨髓液3ml，按照Wakitani的方法培养骨髓间质干细胞，经5-氮胞苷（5-azacytidine)刺激24h后，进行结蛋白（desmin)，肌球蛋白重链（MHC）免疫组织化学，透射电镜鉴定。结果 骨髓间质干细胞经5-aza刺激后，部分细胞呈梭形，结蛋白，肌球蛋白重链阳性，有多核肌管形成，透射电镜可见明显的肌丝形成，结论 骨髓间质干细胞可在体外的环境下向肌细胞转化。有望成为心衰干细胞移植的较理想细胞材料。