MoPn沙眼衣原体致小鼠生殖道感染模型的初步研究

目的 探讨建立沙眼衣原体(Ct)生殖道感染小鼠模型的接种剂量，观察感染小鼠阴道的排菌规律和小鼠输卵管病交。方法 不同数量的鼠肺炎型沙眼衣原体(MoPn)阴道内接种雌性小鼠，每只小鼠感染后3d及每周取阴道拭子作细胞培养分离病原体，并进行包涵体形成单位(IFU)记数和统计小鼠培养阳性率。观察小鼠输卵管病交并用电镜检测。结果 阴道内接种MoPn可致小鼠感染，取阴道宫颈拭子可分离到Ct，5～6W后停止排菌。实验中发现用10^5 IFU以下Ct阴道内接种，不能使感染组小鼠出现明显发病，而用10^6和10^7 IFU接种小鼠，小鼠出现明显发病，电镜直接观察到Ct存在于输卵管病交组织。结论 阴道接种Ct可逆行感染上生殖道感染，导致小鼠输卵管阻塞和输卵管积水，10^6 IFU是建立上生殖道感染小鼠模型的适合感染IFU。     

肽聚糖识别蛋白1抗鼠衣原体生殖道感染的初步研究北大核心CSCD

目的探讨肽聚糖识别蛋白1(peptidoglycan recognition protein 1,PGLYRP-1)抗鼠衣原体(Chlamydia muridarum,Cm)生殖道感染作用,为衣原体感染性疾病的治疗提供实验依据。方法构建pET-28a(+)/PGLYRP-1原核表达重组体,IPTG诱导表达PGLYRP-1重组蛋白,重组蛋白经Ni^(2+)-NTA纯化后进行Western blot鉴定。将5×10^(5)包涵体形成单位(IFU)的Cm和不同剂量的PGLYRP-1(50、100、200μg)分别接种于BALB/c小鼠阴道后穹隆,PBS和Cm感染分别作为阴性和阳性对照。收集感染后不同时间(3、7、10、14、21、28、35d)小鼠生殖道分泌物进行衣原体包涵体计数;第21d处死小鼠,无菌分离小鼠脾脏,制备脾淋巴细胞,PGLYRP-1刺激后测定IFN-γ含量;第63d分离小鼠生殖道组织,观察组织病理学变化。结果PGLYRP-1可降低Cm在小鼠生殖道组织的定植并促进Cm的清除,Cm感染阳性对照组及50、100、200μg PGLYRP-1接种组小鼠生殖道Cm清除时间分别是第35、21、14、10d;IFN-γ含量分别为(959.6±104.6)、(1025.4±112.5)、(1537.8±118.6)、(2131.2±196.7)pg/ml,PBS阴性对照组为(224.0±23.5)pg/ml;83.3%的小鼠在Cm感染后第63d存在单侧或双侧输卵管积水现象,PGLYRP-1接种组有22.2%的小鼠存在类似情况。与阳性对照组相比,PGLYRP-1接种组小鼠生殖道组织炎症反应程度显著减轻,且与PGLYRP-1蛋白剂量呈正比(P<0.05)。结论PGLYRP-1具有抗Cm生殖道感染的作用,其作用机制可能与促进IFN-γ表达上调有关。     

IFN-γ抗鹦鹉热衣原体急性感染保护作用研究

目的探讨IFN-γ对鹦鹉热衣原体(Chlamydia psittaci,Cps)的抗感染作用,为进一步阐明机体抗衣原体免疫机制提供参考数据。方法不同浓度的重组人IFN-γ(5ng/mL、25ng/mL和50ng/mL)作用于感染Cps 6BC的HeLa细胞,48h后计数包涵体数量,并观察包涵体形态的改变。2×10~6 IFUs Cps 6BC滴鼻感染C57BL/6J小鼠,于感染前、后24h腹腔内注射10μg重组鼠IFN-γ,观察小鼠体重、活动状态、生存率等一般指标,分别于感染后5d和10d处死小鼠,取肝、肺组织进行HE染色检测其病理变化;并取感染后5d的肺组织,匀浆,计数其中Cps包涵体数量。结果感染48h后,Cps 6BC在5ng/mL、25ng/mL、50ng/mL重组人IFN-γ处理的HeLa细胞中包涵体数量低于对照组(包涵体数分别为(23.8±5.1)×10~6,(10±3.58)×10~6,(8.0±2.22)×10~6,(43.3±11.05)×10~6,衣原体包涵体形状不规则,体积变小。小鼠实验显示,腹腔注射IFN-γ可明显提高Cps 6BC感染小鼠生存率,并减轻急性临床表现及脏器病变。结论 IFN-γ可发挥早期抗Cps感染的保护作用。     

肽聚糖识别蛋白1抗鼠衣原体生殖道感染的初步研究

目的探讨肽聚糖识别蛋白1(peptidoglycan recognition protein 1,PGLYRP-1)抗鼠衣原体(Chlamydia muridarum,Cm)生殖道感染作用,为衣原体感染性疾病的治疗提供实验依据。方法构建pET-28a(+)/PGLYRP-1原核表达重组体,IPTG诱导表达PGLYRP-1重组蛋白,重组蛋白经Ni~(2+)-NTA纯化后进行Western blot鉴定。将5×10~5包涵体形成单位(IFU)的Cm和不同剂量的PGLYRP-1(50、100、200μg)分别接种于BALB/c小鼠阴道后穹隆,PBS和Cm感染分别作为阴性和阳性对照。收集感染后不同时间(3、7、10、14、21、28、35 d)小鼠生殖道分泌物进行衣原体包涵体计数;第21 d处死小鼠,无菌分离小鼠脾脏,制备脾淋巴细胞,PGLYRP-1刺激后测定IFN-γ含量;第63 d分离小鼠生殖道组织,观察组织病理学变化。结果 PGLYRP-1可降低Cm在小鼠生殖道组织的定植并促进Cm的清除,Cm感染阳性对照组及50、100、200μg PGLYRP-1接种组小鼠生殖道Cm清除时间分别是第35、21、14、10 d; IFN-γ含量分别为(959.6±104.6)、(1 025.4±112.5)、(1 537.8±118.6)、(2131.2±196.7)pg/ml, PBS阴性对照组为(224.0±23.5)pg/ml; 83.3%的小鼠在Cm感染后第63 d存在单侧或双侧输卵管积水现象,PGLYRP-1接种组有22.2%的小鼠存在类似情况。与阳性对照组相比,PGLYRP-1接种组小鼠生殖道组织炎症反应程度显著减轻,且与PGLYRP-1蛋白剂量呈正比(P0.05)。结论 PGLYRP-1具有抗Cm生殖道感染的作用,其作用机制可能与促进IFN-γ表达上调有关。     

沙眼衣原体初次和再次感染小鼠生殖道的初步研究

目的 观察小鼠初次和再次生殖道感染沙眼衣原体后对病原体的清除情况,抗体产生规律及病理表现。方法 将小鼠生物型沙眼衣原体C. muridarum 1×10⁴ IFU阴道接种于C57B6背景雌性小鼠,分别取初次和再次感染后阴道拭子做沙眼衣原体培养,计算IFU,监测小鼠清除病原体情况;同时取小鼠尾静脉血,监测初次和再次感染后抗体产生情况;处死小鼠,检测子宫输卵管病理改变。结果 初次感染,小鼠生殖道感染病原体多,病程长,再次感染病原体明显减少,病程明显缩短;小鼠于初次感染2周后检测到抗体,之后迅速升高并维持在较高水平,再次感染后抗体维持高水平无明显改变;小鼠子宫输卵有明显病理改变,表现为炎症、官腔扩张积水,狭窄等。结论 成功建立沙眼衣原体初次再次感染小鼠生殖道模型,再次感染抗体水平无明显升高,但能有效控制感染,清除病原体,对炎症反应无明显改善。     

IL-12缺失雌鼠经泌尿生殖道衣原体上行感染致肾脏病变观察

目的了解在Il-12缺失小鼠中衣原体经外生殖道进入肾脏导致肾脏病变情况。方法试验用野生型(wildtype,wt)、IL-12p35KO及IL-12p40KO小鼠,每组10只,经阴道分别接种1×104 IFUs鼠衣原体(MoPn),于感染后第45、87和100d处死小鼠。分离其肾脏、尿道、膀胱、肺、肝、脾、心脏组织,分别加入预冷的SPG,经组织匀浆器匀浆、超声破碎后做倍比稀释。取稀释液感染Hela细胞,培养24h后进行间接免疫荧光试验,计数各组织中衣原体包涵体数量。其余5只小鼠的组织进行HE染色,检测其病理变化。结果感染后第45、87和100d,3种小鼠肝、肺、心脏和脾脏组织中均未检出活的衣原体;而在肾脏、尿道、膀胱组织中除wt小鼠未检出活的衣原体外,IL-12p35KO和IL-12p40KO小鼠均检出衣原体。其中,感染后45d,IL-12p35KO和IL-12p40KO小鼠的肾脏、尿道、膀胱组织中检出的衣原体数量分别为4.12×104、4.30×104、2.88×104和4.54×105、3.48×105、1.21×105;且在87和100d,IL-12p40KO小鼠3种组织的衣原体检出数量为6.92×103、3.0×103、105和2.16×104、30、23,显著高于IL-12p35KO小鼠的35、20、13和32、12、2。对各组小鼠肾脏、尿道、膀胱组织进行病理检测,盲法判断组织病变程度,wt小鼠肾脏几乎无明显病变,IL-12p35KO和IL-12p40KO小鼠肾脏均发生严重积水和脓肿,且各组小鼠膀胱、尿道组织病变程度与肾脏病变程度成正相关。结论雌性小鼠在IL-12缺失情况下,衣原体经生殖道感染后可经泌尿生殖道组织上行感染导致肾脏病变。     

IL-12缺失雌鼠经泌尿生殖道衣原体上行感染致肾脏病变观察北大核心CSCD

目的了解在Il-12缺失小鼠中衣原体经外生殖道进入肾脏导致肾脏病变情况。方法试验用野生型(wildtype,wt)、IL-12p35KO及IL-12p40KO小鼠,每组10只,经阴道分别接种1×104 IFUs鼠衣原体(MoPn),于感染后第45、87和100d处死小鼠。分离其肾脏、尿道、膀胱、肺、肝、脾、心脏组织,分别加入预冷的SPG,经组织匀浆器匀浆、超声破碎后做倍比稀释。取稀释液感染Hela细胞,培养24h后进行间接免疫荧光试验,计数各组织中衣原体包涵体数量。其余5只小鼠的组织进行HE染色,检测其病理变化。结果感染后第45、87和100d,3种小鼠肝、肺、心脏和脾脏组织中均未检出活的衣原体;而在肾脏、尿道、膀胱组织中除wt小鼠未检出活的衣原体外,IL-12p35KO和IL-12p40KO小鼠均检出衣原体。其中,感染后45d,IL-12p35KO和IL-12p40KO小鼠的肾脏、尿道、膀胱组织中检出的衣原体数量分别为4.12×104、4.30×104、2.88×104和4.54×105、3.48×105、1.21×105;且在87和100d,IL-12p40KO小鼠3种组织的衣原体检出数量为6.92×103、3.0×103、105和2.16×104、30、23,显著高于IL-12p35KO小鼠的35、20、13和32、12、2。对各组小鼠肾脏、尿道、膀胱组织进行病理检测,盲法判断组织病变程度,wt小鼠肾脏几乎无明显病变,IL-12p35KO和IL-12p40KO小鼠肾脏均发生严重积水和脓肿,且各组小鼠膀胱、尿道组织病变程度与肾脏病变程度成正相关。结论雌性小鼠在IL-12缺失情况下,衣原体经生殖道感染后可经泌尿生殖道组织上行感染导致肾脏病变。     

沙眼衣原体感染小鼠生殖道模型的初步研究

目的建立沙眼衣原体（C￡）小鼠生殖道感染模型。方法分别用10。、10‘、10。数量IFU的CtE型株阴道内接种雌性BALB／c小鼠,观察外阴炎症反应,检测排菌情况,PCR检测分泌物及对组织进行病理观察。结果接种后第5d,实验组小鼠即出现感染迹象;在接种后的5～20d均可在小鼠生殖道分离得到具感染性的c≠,但其持续排菌时期与接种的IFU数量成正比;且小鼠生殖道排菌量（IFU）与接种的IFU数量亦成正比,以10。剂量组为高;小鼠生殖道分泌物PCR扩增后电泳,可见与CtMOMP分子量相当的产物;小鼠生殖道组织切片观察证实,c￡E型株感染小鼠生殖道可产生生殖道炎症。结论成功建立了小鼠生殖道E型c￡感染模型;10。IFU是建立模型的适宜感染量。     

缺少NK细胞小鼠能产生有效的Th1型免疫反应并控制皮肤硕大利什曼原虫感染[英]

不同种系小鼠对硕大利什曼原虫(Leishmania major)的敏感性不同。敏感株BALB/c小鼠感染硕大利什曼原虫后,产生重症非自愈性病理损害;而C3H、CBA/J和C57BL/6等非敏感小鼠感染后只产生轻微病变并可自愈。有学者认为其机制是,敏感鼠对硕大利什曼原虫感染免疫为Th2型反     

伯氏疟原虫感染CBA小鼠所患脑型疟与血清内TNF水平或组织病理学变化强度无明显关系

脑型疟(CM)是人体恶性疟原虫感染常见的致死性并发症。CM的鼠模型用CBA小鼠感染伯氏疟原虫ANKA株,已广泛应用,它具有某些人体CM的特点。通过这种模型,阐明了CM发病的多方面情况,但是对于原虫血症的动力学与CM发生的关系,感染后的病理学,持续性变化等均未详细地叙述。因而作者对感染伯氏疟原虫的动物模型进行了一系列深入的研究。     

弓形虫ROP16_(Ⅰ/Ⅲ)DNA疫苗不能诱导小鼠有效的保护性免疫

目的利用ROP16I/III基因真核表达重组质粒免疫BALB/c雌性小鼠,检测小鼠体液免疫和细胞免疫,评估ROP16I/III作为潜在的分子疫苗的价值。方法克隆Chinese 1型弓形虫ROP16I/III,将其插入真核表达载体pEGFP-C2中构建重组质粒pEGFP-ROP16I/III,脂质体法转染T293细胞并观察体外表达。Western blotting分析鉴定。将36只SPF级小鼠随机均分为:1PBS组;2空质粒组;3pEGFP-ROP16I/III组。每2周肌注免疫1次(100μg/只),共3次;于免疫前及每次肌注前1d和末次免疫后2周收集小鼠血清,间接ELISA法检测血清抗弓形虫IgG。于末次免疫2周后取小鼠脾脏,分离淋巴细胞培养测细胞因子。剩余小鼠腹腔注射Chinese 1型弓形虫Wh3株速殖子1 000个/只,观察小鼠攻击感染后的存活时间和存活率。结果真核表达载体构建成功,体外见到重组质粒pEGFP-ROP16I/III在T293细胞的表达;pEGFP-ROP16I/III末次免疫后血清中IgG水平及脾淋巴细胞细胞因子均无明显升高(P0.05);攻击感染后,免疫组小鼠比对照组的存活时间无延长(P0.05);生物信息学分析发现ROP16I/III缺乏线性B细胞表位。结论 Chinese1型弓形虫的ROP16I/III由于其分泌的定位和结构特点,不能诱导小鼠产生有效的抗Wh3株攻击感染的免疫保护。     

尿路致病性大肠埃希菌Ⅰ型菌毛fimH基因核酸疫苗免疫效果评价

目的研究尿路致病性大肠埃希菌Ⅰ型菌毛fimH基因核酸疫苗产生的免疫反应及其对小鼠的免疫保护作用,并比较不同免疫途径产生的免疫效果。方法选取BALB/c小鼠40只,随机分为4组(PBS组、空质粒组、pcD-NA3.0-fimH肌肉注射组、pcDNA3.0-fimH滴鼻组),用构建的fimH基因真核表达载体pcDNA3.0重组质粒分别通过肌肉注射和滴鼻(粘膜)免疫BALB/c小鼠,同时分别以载体质粒(pcDNA3.0)和PBS液为空质粒对照和空白对照,经股四头肌注射免疫小鼠,于第3周和第5周加强免疫。每次免疫前及末次免疫后2周采血检测特异IgG抗体。末次免疫后第10 d,以UPEC分离株菌液进行尿道上行攻击,攻击后第5 d进行尿液细菌培养和计数。结果免疫后,肌注组与滴鼻组小鼠血清特异性IgG抗体水平与对照组及空质粒组比较显著升高(P<0.05);UPEC分离株菌液攻击小鼠后,pcDNA3.0-fimH肌注组与滴鼻组小鼠尿液菌落数较对照组及空质粒组显著减少(P<0.05)。结论 pcDNA3.0-fimH基因疫苗可诱导BALB/c小鼠产生特异性体液免疫,对小鼠尿道上行感染具有一定的免疫保护作用,且不同的免疫途径免疫...     

γ-干扰素及外源性吲哚对泌尿生殖道沙眼衣原体生长影响的探讨

目的探讨外源性吲哚及γ-干扰素对国内沙眼衣原体优势株E-UW-5/Cx型标准株及临床株生长的影响,并与国外优势株D-UW-5/Cx进行比较。方法分别用DMEM-10、DMEM-10加5ng/mL重组人γ-干扰素和DMEM-10加5ng/mL重组人γ-干扰素及50μmol外源性吲哚三种细胞培养液培养沙眼衣原体至48h,甲醇固定后计数包涵体,观察γ-干扰素及外源性吲哚对E型、D型沙眼衣原体标准株及临床株生长的影响。结果 DMEM-10+IFN组衣原体包涵体计数明显低于DMEM-10组和DMEM-10+IFN+IND组,差异有统计学意义,P0.05;DMEM-10组和DMEM-10+IFN+IND组包涵体计数差异无统计学意义;E型标准株、临床株与D型标准株、临床株之间差异无统计学意义,P0.05。结论在IFN-γ作用下,沙眼衣原体的生长繁殖受到明显抑制,加入外源性吲哚后,泌尿生殖道沙眼衣原体可以逃逸IFN-γ介导的清除作用,恢复其感染活力。     

特异性p38蛋白激酶抑制剂SB203580对小鼠感染肺炎衣原体后细胞因子变化的影响

目的 探讨特异性p38蛋白激酶(p38 MAPK)抑制剂SB203580对小鼠感染肺炎衣原体后细胞因子变化.方法 使用TLR4基因缺失(C3H/HeJ)小鼠90只,随机分为正常组、感染组和SB203580组,每组再分别按0、1、4、7、14 d分成5小组.正常组鼻内接种二磷酸蔗糖缓冲液,感染组鼻内接种肺炎衣原体约4.0×106 IFU/ml,SB203580组在感染肺炎衣原体后腹腔注射SB203580(100 mg/kg).分别在接种后第0天,第1天、第4天、第7天、第14天预定的时间处死小鼠,取肺组织分别采用Western blot法测p38 MAPK蛋白的表达,用酶联免疫吸附法检测肺组织中肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白介素1(IL-1)的表达,同时观察各组小鼠肺组织病理变化.结果 感染组肺组织中TNF-α、IL-1的表达水平在各时间点均高于正常组(P＜0.05或P＜0.01),并在第4天出现高峰,14天以后开始下降.SB203580组肺组织中细胞因子TNF-α、IL-1的表达水平在各时间点均低于感染组(P＜0.05或P＜0.01).同时,SB203580组p38 MAPK蛋白表达强度弱于感染组.结论 p38 MAPK参与小鼠感染肺炎衣原体的炎症反应,特异性p38 MAPK抑制剂SB203580能抑制小鼠感染肺炎衣原体后的细胞因子表达,减轻炎症反应.     

广东和海南暗娼人群生殖道沙眼衣原体新型变种流行状况调查

2006年发现了一个可引起生殖道感染的沙眼衣原体（Chlamydia trachomatis,CT）新变种（New variant of CT,nvCT）。该菌株是菌株质粒中缺失了377个碱基对（base pair,bp）长片段,该缺失的片段是当时的罗氏和雅培诊断试剂目标片段区域。该缺失导致了许多假阴性诊断的nvCT能够在人群中迅速传播。尽管许多核酸诊断试剂公司已经研发了新的能够检测nvCT的试剂,但目前我国国内nvCT的主要经性传播，有研究显示年轻女性更易感染。因此，探讨暗娼对其生殖道感染nvCT的可能情况，为进一步制定控制CT感染及其检测诊断方法提供依据。     

弓形虫ROP16I/IIIDNA疫苗不能诱导小鼠有效的保护性免疫

目的利用ROP16_I/III基因真核表达重组质粒免疫BALB/c雌性小鼠,检测小鼠体液免疫和细胞免疫,评估ROP16_I/III作为潜在的分子疫苗的价值。方法克隆Chinese 1型弓形虫ROP16_I/III, 将其插入真核表达载体pEGFP-C2中构建重组质粒pEGFP-ROP16_I/III,脂质体法转染T293细胞并观察体外表达。Western blotting分析鉴定。将36只SPF级小鼠随机均分为:①PBS组;②空质粒组;③pEGFP-ROP16 _I/III组。每2周肌注免疫1次(100 μg/只),共3次;于免疫前及每次肌注前1 d和末次免疫后2周收集小鼠血清,间接ELISA法检测血清抗弓形虫IgG。于末次免疫2周后取小鼠脾脏,分离淋巴细胞培养测细胞因子。剩余小鼠腹腔注射Chinese 1型弓形虫 Wh3株速殖子1 000个/只,观察小鼠攻击感染后的存活时间和存活率。结果真核表达载体构建成功,体外见到重组质粒pEGFP-ROP16_I/III在T293细胞的表达;pEGFP-ROP16_I/III末次免疫后血清中IgG水平及脾淋巴细胞细胞因子均无明显升高(P>0.05);攻击感染后,免疫组小鼠比对照组的存活时间无延长(P>0.05);生物信息学分析发现ROP16_I/III缺乏线性B细胞表位。结论Chinese1 型弓形虫的ROP16_I/III由于其分泌的定位和结构特点,不能诱导小鼠产生有效的抗Wh3株攻击感染的免疫保护。     

血吸虫硫氧还蛋白免疫原性研究Ⅱ日本血吸虫硫氧还蛋白DNA疫苗小鼠保护性免疫研究

目的观察日本血吸虫(大陆株)硫氧还蛋白DNA疫苗(pcDNA3-SjcTrx)在小鼠诱导抗血吸虫感染的免疫保护作用。方法制备pcDNA3-SjcTrx重组质粒,将30只雌性C57BL/6小鼠随机分为3组,每组10只:pcDNA3-SjcTrx核酸疫苗免疫组、pcDNA3空质粒对照组和攻击感染对照组。核酸疫苗免疫组每只小鼠经股四头肌注射100μg核酸疫苗,共注射3次,间隔2周。空质粒对照组每只小鼠在相应时间经股四头肌注射100μgpcDNA3空质粒,感染对照组则不注射任何质粒。于末次免疫后3周,每只小鼠经腹部感染(30±1)条日本血吸虫尾蚴。小鼠于攻击感染后42天剖杀,门脉灌注收集成虫,计数成虫数和肝内虫卵数。分别在免疫前、攻击感染前和小鼠剖杀前采血并分离血清,用ELISA检测血清中特异性IgG抗体。另取6只雌性C57BL/6小鼠经股四头肌注射核酸疫苗,分别于注射后24、48小时和72小时取肌肉注射部位局部组织制备冰冻切片,用免疫酶染色试验(IEST)检测注射局部组织抗原的表达情况,以注射pcDNA3空质粒者为对照。结果IEST结果表明该DNA疫苗在小鼠肌肉组织内表达,ELISA检测表明DNA疫苗免疫小鼠后产生明显的抗体(IgG)免疫应答,并诱导出对攻击感染的45.7%的减虫率和41.4%的肝组织减卵率(P<0.05)。结论日本血吸虫(大陆株)硫氧还蛋白DNA疫苗具有较好的免疫原性,在小鼠诱导出明显的免疫保护作用,可作为疫苗候选分子作进一步的研究。     

弓形虫多表位抗原基因DNA疫苗对BALB/c小鼠的免疫保护性研究

目的以弓形虫多表位抗原基因DNA疫苗免疫小鼠,评价该疫苗对弓形虫感染产生的免疫保护作用。方法利用PCR技术和亚克隆技术,构建弓形虫多表位抗原基因真核表达重组质粒pcDNA3-MAG,以质粒纯化试剂盒大量制备质粒,同时分别以载体质粒pcDNA3和PBS液为空质粒对照和空白对照,与lipofectin按5∶2的比例混合后,经股四头肌注射免疫小鼠,间隔两周,连续免疫3次,通过检测小鼠血清中特异的IgG抗体、IFN-γ和IL-4含量,评价疫苗产生的体液免疫和细胞免疫水平。以强毒型RH株弓形虫感染免疫小鼠,统计小鼠的存活时间,评价疫苗产生的免疫保护性。结果经双酶切及DNA测序鉴定,所构建的重组质粒pcDNA3-MAG读码框架正确。与免疫前及载体质粒和空白对照组相比,小鼠免疫后产生特异性IgG抗体,并引发高水平IFN-γ。攻虫后,实验组较对照组小鼠存活时间明显延长。结论弓形虫多表位抗原基因DNA能诱导BALB/c系小鼠产生特异的细胞免疫和体液免疫,对弓形虫感染可产生一定的免疫保护性。     

布鲁氏菌IV型分泌系统效应蛋白BPE043的功能和致病机制研究

目的 研究布鲁氏菌IV型分泌系统效应蛋白BPE043在布鲁氏菌感染和胞内生存过程中的作用。方法 以羊种布鲁氏菌104株为起始菌株,通过同源重组的方法构建布鲁氏菌BPE043基因缺失株。将布鲁氏菌野生株104和突变株104ΔBPE043在相同的起始浓度下培养,观察它们生长变化的趋势;用野生株和突变株分别感染小鼠,构建小鼠体内感染模型,测定小鼠脾重并计算脾脏细菌载量;利用免疫共沉淀技术筛选BPE043蛋白的宿主互作蛋白。结果 成功构建了布鲁氏菌BPE043基因缺失株。与野生株相比,突变株104ΔBPE043在体外培养的生长趋势和野生株基本相同;小鼠感染实验显示,在感染1周后,两组小鼠脾均肿大,但突变株104ΔBPE043感染组小鼠脾重低于野生株104感染组小鼠脾重;在感染后两周,两组小鼠脾肿大现象开始减轻。在细菌载量方面,在感染1周后,突变株104ΔBPE043感染小鼠的脾脏细菌载量低于野生株104感染小鼠;在感染后2周,突变株感染组的脾细菌载量下降趋势更明显。免疫共沉淀实验显示BPE043蛋白与鼠源小分子GTP结合蛋白Rab4和Rab11存在相互作用。结论 布鲁氏菌IV型分泌系统效应蛋白BPE043是布鲁氏菌重要的毒力因子。本研究为进一步探索BPE043基因在布鲁氏菌感染和胞内生存中的作用奠定了基础。     

迟缓爱德华菌T3SS转位因子EseC促炎反应

目的 Ⅲ型分泌系统(T3SS)是迟缓爱德华菌(Edwardsiella tarda,简称Et)一种重要的毒力因子, EseC是T3SS一个转位因子。通过缺失eseC基因,探索Et菌T3SS与该菌感染细胞和组织后,诱导宿主产生炎症反应的关系。方法 构建Et.CD菌eseC基因缺失株及其互补株;用菌落计数法比较两菌株在RAW264.7巨噬细胞胞内存活数目;用CCK-8法比较两菌株感染巨噬细胞后的细胞存活率;利用流式比较野生株和缺失株诱发巨噬细胞的细胞坏死。分别将野生株和缺失株注射小鼠腹腔,用菌落计数法比较两菌株在肝脏、脾脏、肺脏和肾脏中细菌CFU/mL,以及通过观察这些器官的大小和HE染色切片组织,比较两菌株对这些小鼠组织的炎症反应;用ELISA比较这些小鼠血清促炎性细胞因子IL-1β 和 TNF-α的浓度;用RT-PCR,比较野生株和缺失株效应蛋白基因转录水平。结果 eseC基因缺失后,Et感染巨噬细胞后,胞内细菌数目和细胞存活率均明显降低, 说明野生株感染细胞后,可通过其T3SS引起更多细胞的死亡,释放出更多细菌成份;野生株可通过其T3SS诱导更多巨噬细胞发生坏死,伴有大量促炎症因子的释放;T3SS有助于野生株在肝、肺、脾和肾中组织中的大量增殖;野生株感染小鼠后,和eseC基因缺失株相比,它们的肝脏,脾脏和肺脏外观明显肿大,肝、肺、脾和肾组织中有明显的急性炎症反应,野生株诱发产生的促炎性细胞因子TNF-α和IL-1β浓度明显高于缺失株;RT-PCR结果显示,eseC基因的缺失使得Et菌的T3SS效应蛋白的eseJ和eseE基因转录水平明显下降。结论 eseC基因可以通过T3SS影响Et在组织和细胞的致炎作用。