瓜氨酸化波形蛋白对类风湿关节炎患者外周血来源树突状细胞的干预作用

目的 探讨波形蛋白瓜氨酸化前后在体外对类风湿关节炎(RA)患者外周血来源树突状细胞( DCs)的细胞形态、表型和功能的影响.方法 分离外周血单个核细胞(PBMCs),粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和白细胞介素(IL)-4体外培养制备未成熟DCs(imDCs),分别用脂多糖、瓜氨酸化波形蛋白(cVim)和波形蛋白刺激培养的imDCs,磷酸盐缓冲液(PBS)作为阴性对照,流式细胞仪检测DCs表面标志CD14、CD80、CD83、CD86、主要组织相容性复合体(MHC)Ⅰ、MHCⅡ表达变化.将实验组获得的DCs和同种异体T细胞进行混合淋巴细胞反应,通过单溶液细胞增殖分析(MTS)法检测T细胞的增殖情况.采用t检验.结果 以阴性对照组imDCs的各个免疫表型阳性率作为1,脂多糖能显著诱导RAimDCs表面MHCⅡ、CD80、CD83、CD86表达(1.07±0.14,1.25±0.13,1.90±1.08,2.44±0.65,P均＜0.05);cVim诱导MHCⅡ(1.18±0.09)、CD83( 1.97±0.99)表达水平上调(P＜0.05,P＜0.01);波形蛋白对MHCⅡ及CD83、CD86表达无影响(0.950.11,0.90±0.29,1.04±0.06),仅抑制CD80表达(0.82±0.18,P＜0.01).与脂多糖组相比,cVim组的MHCⅡ表达水平显著增高(P＜0.05),而CD80、CD86(0.83±0.36、1.32±0.15)的表达水平则低于脂多糖组(P＜0.01,P＜0.05);cVim组MHCⅡ和CD83的表达水平显著高于波形蛋白组(P均＜0.05).混合淋巴细胞反应显示经脂多糖和cVim诱生的DCs对同种异体T细胞具有明显刺激增殖作用,且随着DCs细胞浓度的增加而作用增强;波形蛋白诱生的DCs则无刺激增殖作用.结论cVim可诱导imDCs成熟,并且能够提高细胞表面共刺激分子的表达.     

贝氏柯克斯体重组膜蛋白抗原激活树突状细胞诱导特异性免疫应答

目的分析贝氏柯克斯体(Coxiella burnetii,Cb)膜蛋白抗原对树突状细胞(dendritic cells,DCs)的激活作用,筛选能有效激活DCs的蛋白抗原,探讨该蛋白抗原间接激活T细胞的作用。方法从健康成年人外周血中分离单核细胞,加入GM-CSF和IL-4体外培养单核细胞成未成熟DCs;分别用Cb的5种重组膜蛋白IcmO、EnhA、SecB、Lo1A、HspB刺激DCs;用流式细胞仪(fluorescence activated cell sorter,FACS)检测刺激后DCs表面分子表达。结果 SecB刺激的DCs表达CD83,CD86,CD80,CD54,CD58,和CD40水平显著高于其它4种蛋白;将SecB激活DCs或SecB激活DCs培养上清刺激T淋巴细胞,FACS检测显示刺激后CD4+和CD8+细胞高水平表达的T淋巴细胞活化标志CD69以及细胞因子IFN-γ和TNF-α。结论 SecB膜蛋白抗原能有效激活DCs和它所激活DCs能够诱导特异性细胞免疫应答,为贝氏柯克斯体潜在保护性抗原。     

外周血树突细胞功能与银屑病发病的关系

目的检测银屑病患者外周血树突细胞(DCs)功能,探讨外周血DCs功能与银屑病发病的关系。方法抽取银屑病患者及正常健康人外周血,分离单个核细胞,体外诱导培养DCs。流式细胞术(FCM)方法检测DCs上CD80、CD83表达率,酶联免疫吸附实验(ELISA)方法检测细胞培养液中白介素(IL)-12表达水平。结果体外成功培养出DCs,FCM检测银屑病患者DCs上CD80、CD83表达率分别为(75.15±2.76)%、(72.43±1.94)%,显著高于正常健康人DCs上CD80、CD83表达率(57.88±3.21)%、(41.86±2.54)%(P<0.01)。银屑病患者DCs分泌到细胞培养液中的IL-12表达水平(282.80±23.26)显著高于正常健康人组(191.64±15.55)(P<0.01)。结论银屑病患者外周血中DCs上CD80、CD83表达率异常增高,DCs活化增强,且IL-12因子的分泌量增高,可能导致了银屑病的发病,调控DCs的功能将有助于银屑病治疗。     

胰腺癌MiaPaCa-2细胞总RNA体外转染树突细胞的方法探讨

目的 探讨将胰腺癌MiaPaCa-2细胞总RNA转染树突细胞(DCs)最优化的方法.方法 以rhGM-CSF、rhIL-4和TNF-α联合诱导外周血单核细胞以获得DCs,观察DCs的形态变化,流式细胞术检测DCs表面标志CD40、HLA-DR、CD83和CD86表达,混合淋巴细胞反应(MLR)测定DCs刺激异体T细胞增殖的能力.采用脂质体转染、电穿孔及被动转染三种方法将MiaPaCa-2总RNA转染DCs,应用实时定量PCR法检测MUC1 mRNA表达,MTT法测定DCs存活率.结果 所获细胞具有典型的成熟DCs形态特征,CD40、HLA-DR、CD83和CD86阳性表达率分别为34.3%、50.2%、89.2%和73.6%,对同种异体T淋巴细胞具有极强的刺激增殖作用.电穿孔法DCs转染48 h后,DCs的MUC1 mRNA表达量为45.39±9.33,明显高于脂质体法的31.68±7.25和被动转染法的18.53±3.26;DCs存活率为(80.36±2.43)%,较被动转染法的(91.48±5.42)%略低,但高于脂质体法的(67.44±2.51)%,且基本稳定在80%左右.结论 采用电穿孔法将胰腺癌MiaPaCa-2细胞总RNA体外转染DCs的效率较高,且较安全.     

幼年类风湿关节炎血清对小鼠树突状细胞LTB4-BLT2通路的影响与探讨

目的 探讨幼年类风湿关节炎(JRA)血清对成熟小鼠树突状细胞(DCs)白三烯B4(LTB4)及其受体2(BLT2)信号通路(LTB4-BLT2)的影响.方法 分离正常小鼠骨髓细胞,体外用细胞因子重组小鼠白细胞介素4[(rmIL-4),重组小鼠粒细胞巨噬细胞集落因子(rmGM-CSF)]诱导、分化培养成幼稚DCs,细菌脂多糖(LPS)刺激其成熟.光学显微镜观察其形态,流式细胞术对其进行鉴定;酶联免疫吸附试验(ELISA)测定树突状细胞分化成熟过程中培养上清、正常血清组、JRA活动期血清组和BLT2阻断剂(LY255283)作用组中LTB4含量;免疫细胞化学方法和免疫荧光抗体法检测成熟DCs BLT2的定位表达、反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测其mRNA表达;流式细胞术检测正常血清组、JRA活动期血清组和BLT2阻断剂作用于成熟DCs 18 h后BLT2的表达.结果 成熟DCs存在LTB4-BLT2信号通路表达;DCs不仅存在BLT2的基因mRNA表达,而且存在蛋白表达,蛋白表达于DCs细胞膜和胞质,以胞质细胞器表达最强;正常血清组、JRA活动期血清组、BLT2阻断剂组作用于成熟DC 18 h前后LTB4含量分别为(17±3)pg/ml、(82±20)pg/ml、(82±20)pg/ml和(24±6)pg/ml、(115±20)pg/ml、(91±11)pg/ml,JRA活动期血清组与正常血清组比较LTB4含量明显增高(P＜0.01),BLT2阻断剂组与JRA活动期血清组比较LTB4含量下降(P<0.05).同时,正常血清组、JRA活动期血清组和BLT2阻断剂组DCs BLT2表达分别为27.7±2.9、46.3±8.7和30.3±5.5,JRA活动期血清组与正常血清组比较,BLT2表达明显增强(P<0.05);当JRA活动期血清中加入BLT2阻断剂后,与JRA活动期血清组比较BLT2表达则下降(P<0.05).结论 DCs可能通过其BLT2与自分泌和(或)外在的:LTB4建立LTB4-BLT2炎症信号通路联系,该信号通路增强可能参与了JRA的发生及活动过程.     

阿维A对正常人外周血树突细胞的影响

目的研究阿维A对正常人外周血树突细胞(DCs)功能的影响。方法抽取健康人外周血,分离单个核细胞,体外诱导培养DCs。不同浓度阿维A(1 nmol/L和10 nmol/L)作用DCs 12 h,对照组只加培养基,流式细胞术(FCM)检测DCs中CD83及CD86表达水平,酶联免疫吸附试验(ELISA)检测细胞培养上清液中白介素(IL)-12表达水平。结果体外成功培养出DCs,FCM检测到1、10 nmol/L阿维A作用DCs 12 h后,CD83表达率分别为(56.65±7.09)%、(63.82±5.81)%,显著高于阴性对照组〔(43.55±4.32)%〕(P<0.05);CD86表达率分别为(65.43±1.79)%、(73.73±2.10)%,显著高于阴性对照组〔(52.96±1.10)%〕(P<0.05)。ELISA检测到1、10 nmol/L阿维A作用DCs 12 h后,DCs分泌到细胞培养液中的IL-12表达水平分别为(51.377±4.527)、(60.659±4.973)pg/ml,显著高于对照组〔(39.927±2.809)pg/ml〕(P<0.05)。结论阿维A可提高正常人外周血DCs表面标志CD83、CD86的表达率及细胞因子IL-12的分泌量,增强正常人外周血DCs的抗原提呈能力并可促进DCs向成熟方向分化,从而起到调控机体免疫功能的作用。     

间充质干细胞在成人隐匿性自身免疫性糖尿病患者中免疫抑制作用的研究

目的探讨脐带间充质干细胞(MSCs)对LADA患者单核细胞衍生的树突状细胞(DCs)的免疫调节作用。方法选取5例LADA患者外周血DCs与MSCs进行共培养(MSCs+DCs组),之后刺激自体T细胞。流式细胞术检测DCs组成熟和活化水平、CD3+T、Treg、Th17细胞比例,ELISA法检测细胞培养上清中TGF-β、前列腺素E2(PGE-2)、IL-10和IL-6水平,流式多因子检测法测定细胞培养上清T细胞因子水平,全转录组测序分析筛选新的治疗靶点。结果 MSCs与DCs共培养后,调节性DCs(regDC)增加,同时TGF-β、PGE-2、IL-10和IL-6数量显著增加。两组与T细胞共培养结果显示,MSCs+DCs组IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-10、IL-13和TGF-β表达水平升高(P0.05),INF-γ、TNF-α和IL-17A表达水平降低(P0.05);MSCs+DCs组T细胞增殖活化水平显著降低,MSCs+DCs组Th17细胞比例降低(P0.05),Treg细胞比例增加(P0.05)。结论在LADA中,MSCs能在体外诱导未成熟DCs(imDCs)分化生成CD11b~(high)1a~(low)CD11c~(low)regDCs,表现出免疫抑制作用,这些DCs有助于抑制T细胞介导对胰岛β细胞的破坏,促进MSC发挥抗炎作用。     

Flt3L刺激体外培养小鼠骨髓源CD8α~+树突状细胞及其成熟状态分析

目的建立体外快速制备大量具有免疫活性的小鼠骨髓来源不成熟CD8α+DCs方法。方法实验分2组。Flt3L组:将小鼠骨髓前体细胞用含终浓度为100ng/ml Flt3L的BMDC培养基混悬后接种于细胞培养皿中,每平皿10ml,37℃培养至第7d收集细胞;GM-CSF+IL-4组:将骨髓前体细胞用含终浓度为20ng/ml GM-CSF、5ng/ml IL-4的BMDC培养基混悬后接种于细胞培养皿中,每平皿10ml,分别于37℃培养第3d和第5d半量换液,培养第7d收集细胞,采用磁选法分离CD11c+BMDCs,用流式细胞仪检测。结果 Flt3L刺激组CD11c+BMDCs得率为(95.07±0.09)%,GM-CSF+IL-4刺激组为(83.97±0.43)%,差异有统计学意义(P<0.01)。Flt3L刺激组CD11c+CD8α+BMDCs得率为(9.83±0.33)%,GM-CSF+IL-4刺激组刺激组为(4.06±0.17)%,差异有统计学意义(P<0.01)。Flt3L刺激组CD11c+CD8α+BMDCs表面几乎不表达CD40、CD80、CD86,仅低表达MHCI、MHCII,处于未成熟阶段。结论采用Flt3L刺激小鼠骨髓前体细胞的方法可获得大量未成熟的CD11c+CD8α+BMDCs,方法简单,得率较高,为开展CD8α+DCs相关基础和临床研究奠定了基础。     

刚地弓形虫排泄-分泌抗原体外诱导的IFN-γ促CD4~+CD25~+调节性T细胞凋亡作用

目的研究刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)RH株和Tg Ctwh3株排泄-分泌抗原(ESA)体外诱导小鼠CD4~+CD25~+调节性T细胞凋亡和IFN-γ分泌方面的差异。方法分别制备刚地弓形虫RH株和Tg Ctwh3株的ESA。将分离的野生型C57BL/6小鼠脾单个核细胞随机分为3组(每孔2×10~6细胞),分别加入RH株ESA、Tg Ctwh3株ESA(均为10μg/ml)和鸡卵清蛋白(OVA)进行诱导刺激,流式细胞术检测各组诱导刺激48 h和72 h的CD4~+CD25~+调节性T细胞的早期凋亡情况,ELISA检测各组诱导刺激72 h细胞培养上清中的γ干扰素(IFN-γ)分泌水平。另外,将分离的野生型C57BL/6小鼠脾单个核细胞随机分为2大组(每孔2×10~6细胞),其中一大组在分别加入两株ESA(10μg/ml)和OVA的同时加入抗IFN-γ中和抗体(10μg/ml)进行诱导刺激72 h,流式细胞术检测各组CD4~+CD25~+调节性T细胞早期凋亡情况。用两虫株ESA(10μg/ml)及OVA分别诱导刺激IFN-γ基因敲除型和野生型C57BL/6小鼠的脾单个核细胞(每孔2×10~6细胞)72 h后,流式细胞术检测各组CD4~+CD25~+调节性T细胞早期凋亡情况。结果制备的刚地弓形虫RH株和Tg Ctwh3株ESA抗原蛋白浓度分别为0.54 mg/ml和2.14 mg/ml。流式细胞术检测结果显示,RH株和Tg Ctwh3株ESA组诱导刺激48 h后,CD4~+CD25~+调节性T细胞的早期凋亡率分别为(12.90±1.26)%和(9.71±1.04)%,均显著高于OVA对照组(4.48±0.48)%(P0.01);诱导刺激72 h后,RH株ESA组诱导CD4~+CD25~+调节性T细胞的凋亡率为(15.21±1.11)%,仍明显高于Tg Ctwh3株ESA组(11.02±0.92)%(P0.05)和OVA对照组(10.10±1.49)%(P0.01)。ELISA检测结果显示,RH株和Tg Ctwh3株ESA组诱导刺激脾单个核细胞72 h的培养上清中分泌的IFN-γ水平分别为(4 764.0±118.7)pg/ml和(3 629.0±33.6)pg/ml(P0.01),均显著高于OVA对照组的(679.4±30.6)pg/ml(P0.01)。流式细胞术检测结果显示,RH株ESA加抗IFN-γ中和抗体组诱导CD4~+CD25~+调节性T细胞的早期凋亡率为(10.44±1.44)%,明显低于未加抗IFN-γ中和抗体组(14.96±0.83)%(P0.05);但Tg Ctwh3株ESA加抗IFN-γ中和抗体与否诱导CD4~+CD25~+调节性T细胞的早期凋亡率变化不大(P0.05)。RH株ESA诱导IFN-γ基因敲除小鼠的CD4~+CD25~+调节性T细胞凋亡率为(10.64±0.55)%,明显低于野生型小鼠的(15.21±1.11)%(P0.01);Tg Ctwh3株ESA诱导两组小鼠的CD4~+CD25~+调节性T细胞凋亡率的差异无统计学意义(P0.05)。结论刚地弓形虫RH株ESA在体外诱导CD4~+CD25~+调节性T细胞凋亡及促IFN-γ分泌强于Tg Ctwh3株ESA。弓形虫ESA诱导机体产生IFN-γ可通过介导调节性T细胞凋亡来促进弓形虫感染早期抗感染免疫力的形成。     

多房棘球蚴病患者血源树突状细胞形态观察和表型检测

目的了解多房棘球蚴病患者血源树突状细胞(DCs)形态和表型特点。方法分别收集多房棘球蚴病病例(AE组) 10例、汉族健康志愿者(HH组) 10人、藏族健康志愿者(TH组) 10人的外周血,分离单核细胞贴壁培养,应用重组人集落刺激因子和重组人白细胞介素-4诱导获得DCs。分别收集各组培养第1、 3、 5和7天的DCs,采用倒置显微镜和扫描电镜观察细胞形态。3组DCs诱导培养至第7天时,流式细胞术检测细胞表面标志分子的阳性表达率,采用SPSS 22.0统计学软件进行分析。结果体外诱导培养第1天, AE组、 HH组和TH组DCs大部分呈单个圆形、边界清晰、细胞质透亮、体积较小,浮于细胞液中。诱导培养第3天, 3组DCs聚集呈半悬浮状,细胞变大呈不规则形态。诱导培养第5天, 3组DCs形成集落,多数DCs边缘不光滑呈毛刺状。诱导培养至第7天, 3组DCs呈半悬浮生长,边缘具有丝状刺突; AE组中诱导分化的DCs与HH组和TH组相比所形成的集落数量相对较少,细胞胞体所形成的不规则突起不明显且细胞表面树突状突起较少,呈非典型的DCs形态; AE组诱导分化的DCs表面协同共刺激分子CD1a、 CD80和CD86阳性表达率分别为12.73%±1.73%、 12.41%±2.83%和16.34%±3.59%,与HH组和TH组相比差异有统计学意义(P 0.05),而HH组(18.40%±1.20%、 20.77%±3.40%、 31.78%±5.02%)和TH组(17.50%±1.44%、 23.75%±5.33%、 33.20%±2.47%)相比差异无统计学意义(P 0.05)。结论AE组诱导分化的DCs形态不典型、其重要细胞表面标志分子阳性表达率降低,表现为成熟障碍。     

弓形虫GRA1基因核酸疫苗的实验研究

目的构建弓形虫致密颗粒蛋白GRA1基因的真核重组表达质粒,研究其在Hela细胞中的表达情况及其对动物弓形虫感染的免疫保护作用。方法以弓形虫总RNA为模板,利用设计合成的一对引物,通过RT-PCR方法体外扩增GRA1基因cDNA片段,构建pVAX1-GRA1重组真核表达质粒,并将其转染Hela细胞,验证其在真核细胞中的表达;用pVAX1-GRA1真核表达质粒注射免疫小鼠,通过检测血清特异IgG水平及血CD4+、CD8+细胞百分率并观察弓形虫感染小鼠的存活时间,评价其免疫保护力。结果 PCR扩增出573bp的GRA1开放阅读框,成功构建重组表达质粒pVAX1-GRA1。用间接免疫荧光方法在重组质粒转染后的Hela细胞中检测到特异蛋白,Western blot证实该蛋白具有反应原性,SDS-PAGE检测该蛋白分子质量单位为24ku。用构建的核酸疫苗免疫小鼠,随着免疫次数的增加血清特异性IgG抗体滴度逐渐增加,CD4+与CD8+T淋巴细胞百分率与对照组相比差异有统计学意义(P<0.01)。弓形虫RH速殖子攻击感染疫苗免疫组小鼠存活时间为(165±23.1)d,PBS对照组、pVAX1对照组分别为(144±16.3)d和(148±16.3)d,差异有统计学意义(P<0.05)。结论构建的真核表达质粒pVAX1-GRA1有一定的免疫保护性,为弓形虫基因疫苗的进一步研究奠定了基础。     

刚地弓形虫棒状体蛋白17激活活化蛋白1信号抑制小鼠巨噬细胞凋亡

目的检测刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)棒状体蛋白17(rhoptry protein 17,ROP17)对γ干扰素(IFN-γ)诱导的小鼠单核巨噬细胞(J774A.1)凋亡的调控作用。方法将重组质粒p3×Flag-CMV-14/Tg ROP17和p3×Flag-CMV-14空质粒(对照组)转染J774A.1细胞后,加入重组IFN-γ诱导细胞凋亡,通过流式细胞术和蛋白质印迹(Western blotting)检测ROP17对细胞凋亡的调控作用,检测c-Jun磷酸化水平及活化形式的半胱天冬酶3(Caspase 3)、Bcl-2、Bcl-x L和Bcl-3等凋亡相关蛋白的表达情况。J774A.1细胞共转染p3×FlagCMV-14/Tg ROP17和c-Jun sh RNA,加入重组IFN-γ诱导细胞凋亡,Western blotting检测ROP17对凋亡的调控作用及凋亡相关蛋白Bcl-3的表达。结果流式细胞术显示,过表达ROP17组细胞凋亡率为(3.73±0.51)%,明显低于对照组的(7.78±1.10)%(P0.05)。Western blotting结果显示,过表达ROP17组磷酸化c-Jun蛋白相对表达量为0.196±0.028,对照组为0.075±0.010(P0.05);Bcl-3相对表达量为0.461±0.063,对照组为0.108±0.013(P0.05)。活化形式的Caspase 3相对表达量为0.015±0.004,对照组为0.174±0.026(P0.05)。Bcl-2在过表达ROP17组和对照组中的相对表达量分别为0.119±0.013和0.117±0.018,Bcl-x L则分别为0.124±0.015和0.121±0.023,差异均无统计学意义(P0.05)。在c-Jun sh RNA有效抑制c-Jun及其磷酸化表达的条件下,活化形式的Caspase 3在RNA干扰组和对照组的相对表达量分别为0.147±0.024和0.087±0.010(P0.05),Bcl-3则分别为0.085±0.010和0.162±0.011(P0.05)。结论ROP17抑制IFN-γ诱导的J774A.1细胞凋亡依赖于c-Jun的磷酸化及Bcl-3的表达。     

刚地弓形虫缓殖子期特异抗原BSR4的重组表达与免疫特性的初步研究

目的重组表达刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)Prugniaud(PRU)株缓殖子期特异抗原(BSR4)基因,并检测其免疫特性。方法将已构建的重组表达质粒pET28a(+)-BSR4转化至大肠埃希菌(E.coli)BL21中,经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达并纯化。分别以慢性感染PRU株刚地弓形虫小鼠血清和健康小鼠血清为一抗,用蛋白质印迹(Western blottting)鉴定BSR4重组蛋白的免疫反应性。用3H-TdR掺入法检测慢性感染PRU株刚地弓形虫小鼠脾淋巴细胞对不同浓度BSR4重组蛋白的特异性增殖水平,计算刺激指数(SI)。以BSR4重组蛋白为抗原,用ELISA法检测急性(抗弓形虫IgG-IgM+)和慢性(抗弓形虫IgG+IgM-)弓形虫病患者血清,以及健康人血清,各20份,评判该蛋白的免疫反应性。结果重组质粒pET28a(+)-BSR4经IPTG诱导后表达重组蛋白BSR4,经变性、复性和纯化后获得相对分子质量(Mr)45 000的可溶性蛋白。Western blotting分析结果显示,该蛋白能被慢性弓形虫感染小鼠血清识别。脾淋巴细胞增殖试验表明,1、5和25μg/ml重组蛋白BSR4刺激感染弓形虫小鼠脾淋巴细胞的SI分别为1.13、0.88和1.17,显著高于未感染组(分别为0.46、0.24和0.49,均P<0.01)。ELISA检测结果显示,BSR4抗原能被慢性弓形虫病患者血清(IgG+IgM-)特异性识别(20/20),而不能被急性弓形虫病患者血清(IgG-IgM+)识别(0/20)。结论重组BSR4蛋白具有特异的免疫原性和免疫反应性。     

温法干预对HBV相关慢加急性肝衰竭阳黄证患者外周血树突细胞功能的影响

目的:研究温法干预对HBV相关慢加急性肝衰竭(HBV-ACLF)阳黄证患者外周血树突状细胞(DC)功能的影响。方法:分别选取8例HBV-ACLF阳黄证患者作为阳黄组和8名健康对照者，收集两组人员外周抗凝血，体外诱导培养成成熟的DCs。将两组人员的DCs细胞分为5组：正常组、模型组、温法干预组、去温法干预组和空白组。并用大鼠温阳解毒化瘀方(温法)及温阳解毒化瘀方减附子、白术方(去温法)含药血清干预模型组(HBV-ACLF阳黄证患者)DCs。流式细胞仪分析DCs表面CD80、CD86、CD83、HLA-DR表达及平均荧光强度；ELISA法检测DCs分泌细胞因子IL-12、IL-6、IL-10水平；混合淋巴细胞反应(MLR)检测DCs对T淋巴细胞增殖的影响。结果:与正常组DCs比较，模型组DCs表面CD80、CD86、CD83、HLA-DR表达及平均荧光强度明显降低，DCs分泌细胞因子IL-12、IL-10显著减少，IL-6增多，促T淋巴细胞增殖功能下降(P<0.01);与模型组比较，温法干预组DCs表面CD80、CD86、CD83、HLA-DR表达及平均荧光强度显著升高，DCs分泌细...     

磷酸化转录激活因子5在胰腺癌细胞的表达及生长激素的干预作用

目的 检测磷酸化转录激活因子5(pSTAT5)在7株胰腺癌细胞株中的表达,观察生长激素(GH)处理SW1990细胞及其移植瘤后pSTAT5表达的变化,探讨GH的分子作用机制.方法 体外培养人胰腺癌细胞株SW1990、Cap-1、Colo、Mia、Aspc、P3、PANC1,Western blotting检测各株细胞的pSTAT5表达;收集指数生长期的SW1990细胞接种于BALB/C裸鼠,成瘤后随机分为GH组(瘤内注入GH 4 mg·kg-1·d-1,连续2周)和对照组(NS组),最后一次注射GH后1、2、24 h分批处死裸鼠,Western blotting检测SW1990细胞和移植瘤pSTAT5蛋白表达的变化.结果 所有胰腺癌细胞(SW1990、Cap-1、Colo、Mia、Aspc、P3、PANC1)均有pSTAT5表达.GH(50 ng/ml)刺激后5 min,SW1990细胞pSTAT5的表达量为0.57±0.05,较刺激前显著增高,10 min达到0.64±0.04,15 min很快下降至0.39±0.03,但直至1 h仍高于对照组(0.33±0.02对0.25±0.06),2 h后表达量为0.26±0.03,回落到基础水平.移植瘤pSTAT5表达无明显变化.结论 GH可迅速上调SW1990细胞的pSTAT5表达,但维持时间较短,而对胰腺癌移植瘤pSTAT5的表达无显著影响.     

热休克蛋白47-shRNA调节肝星状细胞膜受体对日本血吸虫鼠肝纤维化的影响

目的了解热休克蛋白47-短发夹RNA(HSP47-sh RNA)调节肝星状细胞(HSCs)膜受体对日本血吸虫鼠肝纤维化的影响。方法建立日本血吸虫鼠肝纤维化模型,感染前(健康对照组)和感染后第4、9、14周,分别随机取5只小鼠,提取肝脏组织总RNA,采用RT-PCR检测HSP47 mRNA相对表达水平,蛋白质印迹(Western blotting)检测HSP47蛋白表达情况,用RM-6240BD型多道生理信号系统动态检测模型鼠门静脉压力,流式细胞术检测HSCs膜内皮素受体(ETAR和ETBR)的平均荧光强度(MFI),免疫组织化学法检测感染前和感染后14周的模型鼠肝组织膜受体表达情况,采用线性相关分析方法分析各时间点的HSP47 mRNA相对表达水平与门静脉压力、ETAR和ETBR相对表达量的关系。用HSP47-sh RNA质粒转染小鼠成纤维细胞NIH/3T3细胞和血吸虫肝纤维化模型鼠,并设阴性对照组(空质粒)和空白对照组(PBS),每组12只血吸虫感染模型鼠。采用RT-PCR检测NIH/3T3细胞转染0、24、48 h及模型鼠干预至第14周的HSP47 mRNA、Ⅰ型和Ⅲ型胶原mRNA相对表达水平,Western blotting检测对应蛋白的表达情况,流式细胞术检测膜受体(ET、TGF-β及PDGF的受体)的MFI。两组间均数的比较采用Student-t检验,多组间采用单因素方差分析。结果模型鼠感染日本血吸虫后第4、9、14周,RT-PCR结果显示,HSP47 mRNA相对表达水平分别为0.592±1.031、1.253±2.101和0.651±1.532,较感染前(0.253±0.120)均升高(P0.01);Western blotting结果显示,HSP47蛋白表达情况与mRNA变化一致;门静脉压力分别为(3.010±0.250)、(8.850±0.63)和(12.390±0.830)mm Hg,感染后第14周与感染前的(2.350±0.180)mm Hg比较,差异有统计学意义(P0.01)。流式细胞术检测结果显示,ETAR的MFI分别为3 245±186、6 108±213和8 784±257,高于感染前的2 104±232(P0.01);ETBR的MFI分别为3 812±158、4 524±197和5 554±156,高于感染前的2 091±237(P0.01)。相关性分析结果显示,HSP47 mRNA相对表达水平与门静脉压力、ETAR和ETBR的MFI均呈正相关(r=0.750、0.750、0.508,P0.05)。免疫组织化学结果显示,感染后第14周,ETB、TGF-β和PDGF的受体在肝纤维聚集部位呈强阳性表达。HSP47-sh RNA转染NIH/3T3细胞48 h后,RT-PCR结果显示,转染组HSP47 mRNA相对表达水平为0.254±2.358,低于阴性对照组的0.911±1.391(P0.01);Western blotting结果显示,HSP47蛋白表达情况与mRNA变化一致;Ⅰ型和Ⅲ型前胶原mRNA相对表达水平分别为0.656±0.061、1.330±0.155,较阴性对照组的1.521±0.314、2.243±0.142均下调(P0.01);流式细胞术检测结果显示,ETBR的MFI为53.433±5.243,高于转染前的30.825±5.460(P0.05),TGF-β及PDGF受体转染前后差异无统计学意义(P0.05)。转染组小鼠体内干预至第14周后,RT-PCR结果显示,HSP47 mRNA相对表达水平为2.686±0.711,低于阴性对照组的6.001±0.458(P0.01);Western blotting结果显示,HSP47蛋白表达情况与mRNA变化一致;Ⅰ型、Ⅲ型前胶原mRNA相对表达水平分别为10.956±2.079和14.071±1.915,均较空白对照组的22.687±1.478和29.065±2.537下降(P0.01);流式细胞术检测结果显示,转染组ETAR表达阳性率为(51.48±4.27)%,低于空白对照组的(81.60±6.07)%(P0.05);转染组小鼠HSC膜受体ETAR、ETBR的MFI分别为4 249±344和3 706±194,均低于空白对照组的8 538±494和5 052±213(P0.05),TGF-β和PDGF受体转染前后差异无统计学意义(P0.05)。结论HSP47-sh RNA可干预活化的HSC和血吸虫肝纤维化鼠,ETR变化为影响肝纤维化尤其门静脉高压的因素。     

瑞舒伐他汀预处理对外周血树突状细胞的影响

目的探讨瑞舒伐他汀对树突状细胞(dendritic cells,DCs)成熟程度及其功能的影响。方法体外分离培养外周血单核来源的DCs,第一部分给予不同剂量的瑞舒伐他汀预处理24 h,依次分为他汀1摩组、他汀5摩组、他汀10摩组和他汀15摩组;第二部分不同时间给予10 μmol/L瑞舒伐他汀预处理依次为他汀1 h组、他汀12 h组、他汀24 h组、他汀36 h组;第三部分选用10 μmol/L瑞舒伐他汀作用36 h为预处理组;各组均用TNF-α诱导DCs成熟的方式,三部分实验中,PBS预处理为空白组,仅加TNF-α处理为对照组,用流式细胞仪检测各组DCs表面分子CD86、CD83、CD40、HLA DR、CD80的表达,用ELISA法检测DCs分泌的趋化因子,~3H胸腺嘧啶核苷掺入法检测DCs诱导自体T淋巴细胞增殖反应。Western blot法检测DCs细胞质NF-κB抑制蛋白(IκBα)、NF-κB表达。结果与对照组比较,不同浓度和不同时间作用组CD86表达均有下降趋势;经终浓度10μmol/L瑞舒伐他汀处理36 h后DCs表面分子CD83、CD40、CD86、HLA-DR、CD80均有不同程度的下调,上清液中MCP-1浓度以及DCs促T淋巴细胞增殖的作用明显下降(P0.01)。Western blot检测表明,瑞舒伐他汀预处理后各组,IκBα表达均有不同程度增加,NF-κB含量则存在不同程度的减少,并表现一定的剂量和作用时间的依赖性,但当剂量达到10μmol/L,作用时间为24 h时,作用达到一个平台期。结论瑞舒伐他汀预处理可以抑制外周血单核来源的DCs成熟,并影响DCs的促T淋巴细胞增殖能力及迁移能力。     

高表达毒力因子ROP18的转基因刚地弓形虫株的建立及鉴定

目的构建并鉴定高表达毒力因子ROP18的转基因刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)虫株。方法 RTPCR扩增刚地弓形虫RH株速殖子的ROP18基因片段。将纯化的PCR产物克隆至p CR-BluntⅡ-Topo载体构建p ROP18质粒,PCR扩增ROP18基因序列。将纯化的PCR产物亚克隆至p TUB8-myc GFPPftail-Ty1载体,构建p TUB8-ROP18-Ty1质粒。将质粒电穿孔转染刚地弓形虫RH株,刚地弓形虫悬液转移到长有贴壁细胞的培养瓶中培养,用含25μg/ml霉酚酸和50μg/ml黄嘌呤的DMEM培养基筛选高表达ROP18的刚地弓形虫RH株。免疫荧光和蛋白质印迹(Western blotting)检测ROP18在转基因刚地弓形虫株中的表达。吉氏染色比较弓形虫RH株和高表达ROP18的转基因RH株弓形虫分别感染人包皮成纤维细胞(HFF细胞)的增殖情况。20只昆明小鼠均分为2组,每鼠分别腹腔内注射1×103高表达ROP18弓形虫RH株和1×103弓形虫RH株,统计小鼠存活率。结果 RT-PCR扩增出1 665 bp的ROP18基因序列。经酶切和测序鉴定证明p TUB8-ROP18-Ty1质粒构建成功。Western blotting分析结果显示,高表达ROP18 RH株可表达相对分子质量(Mr)为56 000的蛋白,与ROP18-Ty1蛋白预期结果一致。免疫荧光结果发现,ROP18-Ty1定位于弓形虫前端的棒状体。吉氏染色结果表明,高表达ROP18 RH株弓形虫感染HFF细胞6、12和24 h后的速殖子数量分别为100.0±16.9、476.0±31.1和860.0±52.3,均显著高于RH株弓形虫(88.0±16.9,300.0±11.3,675.0±35.4)(P0.05)。弓形虫毒力实验结果显示,RH株弓形虫感染小鼠在第8天均存活,第14天存活率下降至30%(3/10),至第16天全部死亡;高表达ROP18 RH株弓形虫感染小鼠在第5天均存活,第8天存活率下降至30%(3/10),至第9天全部死亡。结论构建了高表达毒力因子ROP18的转基因弓形虫虫株。     

颗粒化日本血吸虫M_r22600抗原对小鼠树突状细胞和CD4~+CD25~+调节性T细胞的作用

目的研究颗粒化日本血吸虫Mr22600抗原对小鼠树突状细胞(DCs)功能的影响及诱导CD4+CD25+调节性T细胞的作用。方法体外实验:分别用Sepharose 4B偶联rSj22.6/26GST抗原与可溶性rSj22.6/26GST抗原负载DCs,流式检测DCs表型变化,混合淋巴细胞增殖实验检测DCs功能。将不同抗原负载的DCs,与CD4+T细胞共培养,流式检测观察对CD4+CD25+Foxp3+T细胞数量的影响。体内试验:将42只BALB/c小鼠随机分6组(每组6～8只),A组免疫Sepharose4B偶联rSj22.6/26GST抗原,B组免疫福氏佐剂乳化rSj22.6/26GST抗原,C组免疫rSj22.6/26GST抗原,同时设Sepharose4B对照组(D组),福氏佐剂对照组(E组)和PBS对照组(F组),各组均为皮下多点免疫50μg抗原,隔2周加强免疫,共免疫2次。末次免疫后2周处死,无菌取腹股沟淋巴结,制备细胞悬液,流式检测DCs占淋巴结细胞的比例;同时取脾脏,制备成脾脏单个核细胞,流式检测各免疫组CD4+CD25+Foxp3+T细胞占脾细胞的比例。用免疫磁珠分选各免疫组CD4+CD25+T细胞,与CD4+CD25-T细胞共培养,氚标记胸腺嘧啶核苷(3H-TdR)掺入法检测细胞增殖情况。结果体外实验结果显示,DCs经可溶性抗原刺激后表面分子CD40、CD80、CD86表达率分别为(43.5±6.2)%、(37.7±0.1)%和(71.4±1.4)%,经Sepharose4B偶联抗原刺激后表达率分别为(31.2±5.4)%、(32.0±1.6)%和(63.8±1.0)%,与可溶性抗原相比,Sepharose4B偶联rSj22.6/26GST抗原不能有效刺激DCs成熟。Sepharose4B偶联rSj22.6/26GST抗原负载DCs可诱导CD4+CD25+调节性T细胞扩增。体内实验结果显示,Sepharose4B偶联rSj22.6/26GST抗原免疫小鼠可诱导CD4+CD25+调节性T细胞数量增加,且与可溶性抗原组(cpm值为3558±147)相比,Sepharose4B偶联rSj22.6/26GST抗原组(cpm值为1420±335)来源的CD4+CD25+调节性T细胞的抑制能力更强。结论 Sepharose4B偶联rSj22.6/26GST抗原与可溶性抗原相比,更易诱导CD4+CD25+调节性T细胞,诱导的CD4+CD25+调节性T细胞具有更强的抑制功能,且这一作用可能与不同性状抗原干预DCs的功能状态有关。     

腺病毒介导肝癌抑制基因-1联合5-氟尿嘧啶增强结直肠癌细胞杀伤作用及机制研究

目的 通过化学治疗药物5-氟尿嘧啶(5-FU)联合重组腺病毒(Ad)肝癌抑制基因-1(HCCS1)感染结直肠癌细胞,观察两者对结直肠癌细胞的联合杀伤作用.并初步探讨相关分子机制.方法 RT-PCR和Western印迹法检测Ad-HCCS1感染结直肠癌LoVo细胞后HCCS1的表达.活细胞计数试剂盒(CCK)-8法测定Ad-HCCS1联合5-FU处理时的细胞存活率.流式细胞仪检测各种处理后细胞凋亡的情况.Western印迹法检测各种处理后相关凋亡蛋白的变化.结果 ①Ad-HCCS1可成功介导HCCS1基因在LoVo细胞中的表达.②5-FU+Ad-HCCS1联合作用96 h时,LoVo细胞存活率为(11.23±4.61)%,与对照组比较差异有统计学意义[(92.23±3.77)%,P<0.01].③处理72 h后流式细胞仪分析结果 显示,5-FU+Ad-HCCS1联合组细胞凋亡率为(27.57±1.78)%,高于单用5-Fu组[(8.64±0.94)%]、单用Ad-HCCS1组[(13.19±1.32)%]和5-Fu+空载病毒组[(12.16±1.28)%],差异均有统计学意义(P值均<0.01).④在Ad-HCCS1感染LoVo细胞高表达HCCS1时,胞质蛋白中检测到组织蛋白酶(cathepsin)D;当5-FU加入后,胞质中的抗凋亡蛋白酶前体(procaspase)-8有所减少,而活性BH3结构域凋亡诱导蛋白(Bid)明显增加.在5-FU+Ad-HCCS1处理组,胞质中的Bax水平降低最为明显,而细胞色素C和活性凋亡蛋白酶(caspase)-3表达最多.结论 在5-FU基础上联合Ad-HCCS1可显著增强LoVo细胞的生长抑制和凋亡诱导,两种处理的联合作用点为Bax蛋白,为结直肠癌治疗提供了一种新策略.