一种新的广州管圆线虫候选诊断抗原基因的克隆、表达及初步鉴定

目的克隆广州管圆线虫Ⅴ期幼虫候选免疫诊断抗原基因,进行体外表达及免疫学鉴定。方法根据本室构建的广州管圆线虫Ⅴ期幼虫cDNA文库的免疫筛选结果 ,选择文库中表达具有免疫反应性Ac11蛋白基因,进行生物信息学(在线Blast)分析,PCR扩增后克隆入pET28a(+)载体中,进行诱导表达及免疫学鉴定。结果推断Ac11基因为亚硫酸盐氧化酶基因。构建的重组质粒pET28a(+)-Ac11经IPTG透导,表达以包涵体形式存在的重组融合蛋白,分子质量单位约为30 kd。Western blot显示纯化的重组蛋白具有良好的免疫反应性。结论制备了具有良好免疫反应性的广州管圆线虫Ⅴ期幼虫亚硫酸盐氧化酶重组融合蛋白,为广州管圆线虫病的免疫诊断研究奠定了基础。     

广州管圆线虫ASP基因的克隆及原核表达

目的对广州管圆线虫ASP基因的完整开放读码框进行克隆、表达及重组蛋白的免疫性分析。方法以广州管圆线虫幼虫cDNA文库中含有ASP基因的质粒为模板,扩增目的基因,进一步将其克隆到原核表达质粒pET-30a(+)中,重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达,Ni-IDA亲和层析纯化表达产物。免疫印迹(Western blotting)分析重组蛋白的免疫性。结果广州管圆线虫ASP基因的编码区含有366个碱基,编码121个氨基酸,相对分子量(Mt)为13398.26Da。重组质粒pET-30a(+)-ASP构建成功,IPTG诱导获得可溶性表达的重组蛋白,经亲和层析获得的纯化蛋白可被广州管圆线虫病人血清识别。结论广州管圆线虫ASP基因可在原核表达系统中获得具有免疫性的高效表达。     

广州管圆线虫半乳糖凝集素-1基因的克隆、表达和凝集反应

目的克隆、表达广州管圆线虫(Angiostrongylus cantonensis)半乳糖凝集素-1(galectin-1)基因并分析其凝集反应。方法用Swiss Model分析galectin-1的三维结构。提取广州管圆线虫雌性成虫总RNA,根据galectin-1基因编码序列(Gen Bank登录号为JN133961.1)设计引物,RT-PCR扩增目的基因,亚克隆至p ColdⅢ质粒,转化大肠埃希菌(Escherichia coli)BL21,取重组质粒进行双酶切、PCR鉴定和测序。阳性质粒经0.1 mmol/L异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,镍柱亲和层析法纯化galectin-1重组表达蛋白后,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析重组蛋白表达情况。以广州管圆线虫全虫免疫的小鼠血清为一抗,蛋白质印迹(Western blotting)验证目的蛋白。将重组蛋白10倍稀释为5.55×10~(-1)~5.55×10~(-5)ng/μl,显微镜观察其与新鲜的ICR小鼠血液中红细胞的凝集反应。结果 Swiss Model分析结果显示,galectin-1以非二聚体形式发挥作用。galectin-1基因RT-PCR扩增产物约为850 bp,与预期结果一致。经双酶切、PCR和测序结果显示,重组质粒p ColdⅢ-galectin-1构建成功。SDS-PAGE结果显示,经IPTG诱导获得相对分子质量约36 000的可溶性重组融合蛋白。Western blotting分析结果显示,galectin-1蛋白能被全虫免疫的小鼠血清识别。凝集反应结果显示,galectin-1蛋白与小鼠红细胞发生明显凝集反应的最低浓度为5.55×10~(-4)ng/μl。结论克隆的galectin-1基因能在p ColdⅢ原核表达系统中呈可溶性表达,并与小鼠红细胞发生凝集反应。     

广州管圆线虫雌性成虫肌蛋白-1基因的克隆表达及免疫学效应分析

目的 对广州管圆线虫雌性成虫肌蛋白-1(Ac-fmp-1)基因的开放读码框进行克隆、表达及重组蛋白的免疫学效应分析,评价其重组蛋白在免疫学诊断中的应用前景。方法 逆转录聚合酶链反应扩增目的基因,克隆至原核表达载体pET-30a-c(+),重组质粒转化至大肠埃希菌E.coli BL21(DE3),经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达,镍离子亲和层析(Ni-IDA)纯化分离表达产物。免疫印记(Western-blot)和酶联免疫吸附试验(ELISA)分析重组蛋白的免疫性。结果 广州管圆线虫Ac-fmp-1基因的编码区有1 251个碱基,编码417个氨基酸。原核表达载体pET-Ac-fmp-1构建成功,IPTG诱导表达获得了体外高效表达的重组融合蛋白,经亲和层析得到纯化蛋白。融合蛋白可被感染广州管圆线虫的SD大鼠血清及病人血清所识别;作为包被抗原用于ELISA检测大鼠血清其敏感性与特异性均为100%,与粗抗原无差别;检测广州管圆线虫病人血清敏感性为100%,与粗抗原有差别;检测其他寄生虫病人血清与正常病人血清其特异性为100%和98%,与粗抗原相比特异性较高。结论 广州管圆线虫Ac-fmp-1基因在原核表达系统获得高效表达,编码蛋白可能是虫体的重要抗原成分,在免疫学诊断方面有潜在的应用前景。     

广州管圆线虫组织蛋白酶Z基因的原核表达及免疫学分析

目的克隆并原核表达广州管圆线虫组织蛋白酶-Z基因,评价其融合蛋白在免疫诊断中的应用前景。方法利用生物信息学分析工具,分析广州管圆线虫组织蛋白酶-Z的理化性质、结构与功能特征;克隆目的基因至原核表达载体pET30a(+),经PCR、双酶切鉴定后,IPTG诱导表达,表达产物通过SDS-PAGE鉴定,融合蛋白用His-镍蛋白纯化柱纯化;ELISA检测融合蛋白作为诊断抗原的敏感性及特异性。结果该蛋白理化性质较稳定,含有分泌型信号肽;含有构成半胱氨酸蛋白酶催化中心的Cys84、His232和Asn253三个氨基酸残基。成功构建了重组质粒且目的基因在E.coliBL21中获得高效表达,经亲和层析获得了纯化的融合蛋白。融合蛋白可被其免疫的BALB/c小鼠血清及感染广州管圆线虫的小鼠血清识别;作为包被抗原用于ELISA检测小鼠血清其敏感性及特异性均为100%与粗抗原无差别,检测其他寄生虫病人血清及正常人血清其特异性分别为100%和97.4%与粗抗原相比特异性较高。结论广州管圆线虫组织蛋白酶-Z与多个物种组织蛋白酶-Z基因同源,是一种半胱氨酸蛋白酶,含有信号肽,可能是重要的虫体分泌排泄抗原成分,在广州管圆线虫病的免疫诊断方面有潜在的应用前景。     

霍乱弧菌O139 mshA基因的克隆、表达及免疫反应性鉴定

目的克隆霍乱弧菌O139临床菌株的甘露糖敏感血凝素(Mannose-Sensitive Hemagglutinin,MSHA)基因,构建原核表达系统,鉴定重组表达产物的免疫反应性。方法高保真PCR扩增mshA基因,T-A克隆后测定核苷酸序列并构建原核表达系统pET-28a(+)-mshA-E.coliBL21(DE3),IPTG诱导目的重组蛋白(rMSHA)表达、Ni-NTA亲和层析法收集蛋白;Western blot鉴定其免疫反应性。结果所克隆的mshA基因与GenBank报道的(AE004128)序列完全一致。构建的mshA基因原核表达系统pET-28a(+)-mshA-E.coliBL21(DE3)表达量占细菌总蛋白的20%以上。表达的蛋白(约20kD)可与His单克隆抗体发生特异性免疫结合。结论成功构建了霍乱弧菌O139mshA基因的高效原核表达系统,表达的rMSHA蛋白有良好的免疫反应性,为进一步研制MSHA及其抗体检测试剂盒奠定了基础。     

广州管圆线虫蛋白酶体α5基因的克隆、表达及重组蛋白对人THP-1巨噬细胞凋亡的影响

目的获得广州管圆线虫蛋白酶体α5基因(pas-5),构建其重组质粒,探讨PAS-5重组蛋白对人THP-1巨噬细胞凋亡的影响。方法以广州管圆线虫逆转录DNA为模板,PCR扩增pas-5基因,构建pcoldⅢ-pas-5重组质粒,转化至大肠埃希菌DH5α感受态细胞,取菌液进行PCR、双酶切和测序鉴定。阳性质粒经0.1 mmol/L异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导表达后,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白质印迹(Western blotting)分析重组蛋白表达情况,采用镍离子亲和层析法纯化重组蛋白。将用佛波酯诱导的人THP-1巨噬细胞经PAS-5(实验组)孵育18 h后,采用流式细胞术观察细胞凋亡情况,采用ELISA检测细胞培养上清中细胞因子白细胞介素-10(IL-10)水平,另设阴性对照组(牛血清白蛋白)和空白对照组(RPMI1640)。结果Pas-5基因PCR扩增产物约为800 bp,与预期大小相符。经菌液PCR、双酶切和测序鉴定获得pcoldⅢ-pas-5重组质粒。SDS-PAGE分析结果显示,PAS-5重组蛋白主要以包涵体形式存在,其相对分子质量约28 000。Western blotting分析结果显示,重组蛋白能与兔抗鼠His单克隆抗体特异性结合。镍离子亲和层析纯化重组蛋白后获得单一条带。流式细胞术分析结果显示,阴性对照组和实验组人THP-1巨噬细胞凋亡率分别为(0.380±0.194)%和(0.052±0.036)%,两者差异有统计学意义(P0.05)。ELISA检测结果显示,实验组细胞培养上清中IL-10水平为(77.606±1.766)pg/ml,高于阴性对照组的(45.652±5.975)pg/ml(P0.05)。结论获得了pas-5基因和重组质粒pcoldⅢ-pas-5,重组蛋白PAS-5可抑制人THP-1巨噬细胞凋亡,与IL-10水平提高有一定关系。     

刚地弓形虫滑行相关蛋白45的克隆、表达与免疫反应性检测

目的克隆、原核表达刚地弓形虫滑行相关蛋白45 (Tg GAP45)基因,检测重组蛋白r Tg GAP45的免疫反应性。方法提取刚地弓形虫RH株速殖子总RNA,逆转录合成cDNA。根据Tg GAP45基因全长编码序列的开放阅读框设计引物,PCR扩增Tg GAP45基因。扩增产物经双酶切后连接入pET30a (+)载体,重组质粒转化至大肠埃希菌(E. coli) DH5α,阳性菌落经PCR、双酶切和测序鉴定。将重组质粒pET30a (+)Tg GAP45转化至E.coli BL21 (DE3)感受态细胞,以异丙基βD硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDSPAGE)结合考马斯亮蓝染色检测表达产物,分别以抗His标签抗体、人抗弓形虫血清或小鼠抗弓形虫可溶性速殖子抗原(STAg)血清为一抗,蛋白质印迹(Western blotting)鉴定重组蛋白免疫反应性。结果刚地弓形虫GAP45基因的cDNA开放式阅读框全长为738 bp, PCR扩增结果显示,在750 bp处有一条特异性扩增条带(带His标签),与预期大小相符。菌落PCR、双酶切以及测序结果均表明重组质粒pET30a (+)Tg GAP45构建成功。SDSPAGE结果表明,经IPTG诱导获得相对分子质量(Mr)约35 000的可溶性重组蛋白。Western blotting分析结果显示,诱导表达的蛋白为带His标签的重组蛋白,可分别被His标签抗体、人抗弓形虫血清和小鼠抗弓形虫STAg血清识别。结论刚地弓形虫RH株Tg GAP45基因片段可在原核表达系统中高效可溶性表达,该重组蛋白r Tg GAP45具有免疫反应性。     

广州管圆线虫半胱氨酸蛋白酶抑制剂基因的克隆表达及免疫保护作用研究

目的对广州管圆线虫半胱氨酸蛋白酶抑制剂(cystatin)基因进行克隆、原核表达,并对表达产物的免疫保护作用作出初步鉴定。方法将广州管圆线虫cystatin基因克隆入载体pGEX-4T-1中,转化大肠杆菌BL21进行诱导表达。用纯化融合蛋白隔周免疫小鼠1次,共3次,设GST免疫及未免疫对照组,末次免疫后1w用广州管圆线虫Ⅲ期幼虫攻击感染,3w后剖杀小鼠,计算减虫率及保护率,并测定小鼠特异性IgG抗体水平变化。结果成功构建了pGEX-4T-1/cystatin重组表达质粒,并在大肠杆菌中得以高效可溶性表达,融合蛋白免疫小鼠后诱导产生了58.1%的减虫率及20%的保护率,与对照组相比减虫效果显著(P<0.01)。结论广州管圆线虫cystatin基因能在大肠杆菌中高效表达并可诱导小鼠产生一定水平的保护性免疫力。     

恶性疟原虫配子体期特异性蛋白Pfgdv1克隆表达及鉴定

目的克隆恶性疟原虫配子体期特异性基因(Plasmodium falciparum gametocyte development 1 gene,Pfgdv1),体外表达和鉴定重组Pfgdv1蛋白。方法通过PCR法从恶性疟原虫感染病人血液DNA样本中扩增Pfgdv1基因,插入到原核表达载体p ET28a(+),构建p ET28a-Pfgdv1重组表达质粒,转化至大肠埃希菌(E.coli)BL21(DE3+),通过异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷诱导表达重组蛋白,经Ni+-亲和层析柱纯化重组蛋白,纯化产物经十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和Western blotting鉴定。结果 PCR扩增的Pfgdv1基因长度约为1.65 kb,重组p ET28a-Pfgdv1质粒构建成功,插入方向正确无框移,转化至E.coli BL21(DE3+)所表达的重组蛋白分子量约为67 k Da,且能被抗His标签单克隆抗体识别。结论成功克隆了Pfgdv1基因,表达并纯化了重组Pfgdv1蛋白,为进一步研究恶性疟原虫配子体期传播阻断疫苗奠定了基础。     

一个广州管圆线虫特异性抗原候选基因的克隆与表达

目的用免疫探针交叉筛选前期实验获得的广州管圆线虫候选抗原基因，将筛选出的特异抗原候选基因进行原核表达、鉴定。方法制备抗血吸虫和抗旋毛虫多克隆抗体血清，交叉筛选广州管圆线虫抗原候选基因，从中获得特异性抗原候选基因，将其从重组噬茵体状态转化为质粒状态，再亚克隆入原核表达载体pET-30a—c（＋）进行融合表达，SDS-PAGE鉴定表达产物，同时对该基因进行生物信患学分析。结果获得了一个广州管圆线虫特异性抗原候选基因，经生物信患学分析该抗原基因属中问纤维家族基因（intermediate filament，IF），原核表达产物为48KDa。结论获得了一个广州管圆线虫特异性抗原候选基因及其原核表达产物。     

微小隐孢子虫病毒衣壳蛋白的原核表达及鉴定

目的对微小隐孢子虫病毒衣壳蛋白S-dsRNA基因进行克隆、表达和反应原性分析。方法以微小隐孢子虫总RNA逆转录的cDNA为模板,克隆S-dsRNA基因,并转化至原核表达载体pET-28a(+)中,构建重组原核表达载体pET-28a(+)-S,转入大肠埃希菌BL21(DE3)中,用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)观察重组蛋白的表达情况,蛋白质印迹(Western blotting)分析重组蛋白与鼠抗微小隐孢子虫阳性血清的反应原性。结果 PCR和双酶切鉴定表明,重组质粒pET-28a(+)-S构建成功。SDS-PAGE结果显示,37℃下经1mmol/L IPTG诱导4h,重组蛋白表达量最大。重组蛋白主要以包涵体形式表达,相对分子质量(Mr)约为37000,与预期大小一致,重组蛋白约占蛋白总量的72.6%。Western blotting分析结果表明,重组蛋白能识别抗微小隐孢子虫阳性鼠血清。结论微小隐孢子虫病毒衣壳蛋白S-dsRNA基因表达成功,重组蛋白具有反应原性。     

抗广州管圆线虫成虫单克隆抗体的研制及初步应用

目的制备抗广州管圆线虫成虫单克隆抗体并研究其初步应用。方法用广州管圆线虫成虫可溶性抗原免疫BALB/c小鼠,经融合,筛选分泌高滴度、高特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株。使用所得的单克隆抗体以Western blotting检测广州管圆线虫病患者血清,并建立双抗体夹心ELISA法检测感染大鼠血清。结果获得3株分泌高滴度抗广州管圆线虫成虫可溶性抗原的单克隆抗体杂交瘤细胞株(2A2、3F1、4H2),其分泌的抗体与日本血吸虫、卫氏并殖吸虫、猪囊尾蚴、旋毛虫抗原均不发生交叉反应。3株单克隆抗体均可识别广州管圆线虫成虫可溶性抗原蛋白Mr 15 000,以及患者血清中两种循环抗原Mr24 000和Mr15 000。双抗体夹心ELISA检测阳性率为76.5%。结论制备的抗广州管圆线虫成虫可溶性抗原的杂交瘤细胞株能分泌高滴度、高特异性的单克隆抗体,且在循环抗原的检测方面有应用前景。     

华支睾吸虫组织蛋白酶D样天冬氨酸蛋白酶基因的克隆表达和重组蛋白的免疫学分析

目的对新发现的华支睾吸虫(Clonorchis sinensis)的组织蛋白酶D样天冬氨酸蛋白酶基因进行克隆、表达和免疫学初步研究。方法将华支睾吸虫组织蛋白酶D样天冬氨酸蛋白酶基因(去除了信号肽编码序列)克隆到原核表达质粒pET-28a(+)中,在大肠杆菌BL-21/DE3中用IPTG诱导表达,表达产物通过十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)进行鉴定,用镍离子金属螯合剂亲和层析柱进行纯化,纯化的重组蛋白免疫SD大鼠制备抗血清。用蛋白印迹(Western blotting)进行免疫学分析。结果PCR、双酶切及DNA测序结果均表明pET-28a(+)-组织蛋白酶D样天冬氨酸蛋白酶重组质粒构建成功。SDS-PAGE结果表明目的基因在大肠杆菌BL-21/DE3中获得高效表达,经亲和层析获得了高纯度蛋白。重组蛋白可被其免疫的SD大鼠血清识别,表明其具有免疫原性;并且能识别感染了华支睾吸虫的SD大鼠血清,表明具有免疫反应性。结论华支睾吸虫组织蛋白酶D样天冬氨酸蛋白酶基因可在原核表达系统中获得具有免疫原性的高效表达,为进一步研究该蛋白的功能奠定了基础。     

刚地弓形虫表面抗原1、2 B细胞表位基因的融合表达和鉴定

目的构建刚地弓形虫(以下简称弓形虫)表面抗原(SAG)1、2 B细胞表位基因片段的原核表达系统,并对其免疫反应性进行分析。方法根据GenBank中已公布的编码弓形虫表面抗原的SAG基因序列,分析SAG1和SAG2基因的B细胞表位,设计并合成弓形虫表面抗原SAG1和SAG2蛋白的B细胞表位基因,将目的基因与p ET-28a(+)表达质粒连接,并转化至大肠埃希菌(Escherichia coli)BL21(DE3)感受态细胞中,挑取完整单个菌落于含卡那霉素的LB液体培养基中,菌液进行PCR扩增、双酶切和测序鉴定;菌液振荡培养至吸光度(A450值)为0.6~0.8时,加入终浓度为1 mmol/L的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导表达,得到带有His标签的融合蛋白,进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE))电泳,对蛋白的可溶性进行分析。使用His亲和层析柱对表达的重组蛋白进行纯化,将带有His标签的纯化重组蛋白进行蛋白质印迹(Western blotting)分析和ELISA分析免疫反应性。结果构建的p ET28a(+)-SAG重组质粒,菌液经PCR、双酶切鉴定结果显示,在909 bp处出现特异性目的条带,与预期相符,经测序表明重组表达质粒构建成功。SDS-PAGE鉴定结果显示,重组蛋白rSAG相对分子质量(Mr)约50 000,为可溶性表达,与预期结果相符。Western blotting分析结果显示,重组蛋白可以与弓形虫感染小鼠阳性血清1∶100发生特异性结合。ELISA检测结果显示,重组蛋白稀释度为1∶1,阳性血清稀释度为1∶50时,阳性反应最明显,A450值为1.037 9。不同稀释倍数的重组蛋白r SAG与不同浓度的小鼠弓形虫阳性血清均可发生反应,并能很好的区分阴性和阳性血清。结论构建了弓形虫表面抗原SAG1和SAG2蛋白的B细胞表位基因的原核表达系统,重组蛋白rSAG为可溶性表达,并具有较好的免疫反应性。     

刚地弓形虫微线体蛋白2在不同原核表达菌中的表达与鉴定

目的利用大肠埃希菌(Escherichia coli)BL21(DE3)、Arctic Express(DE3)和Shuffle等3种不同的原核表达菌表达刚地弓形虫微线体蛋白2(Toxoplasma gondii microneme protein 2,TgMIC2),并进行蛋白质印迹(Western blotting)鉴定。方法参照Gen Bank中TgMIC2基因序列设计引物,以刚地弓形虫RH株速殖子RNA为模板,RT-PCR扩增获得DNA片段,PCR产物经NdeⅠ和HindⅢ双酶切后连至原核表达载体pET-30a(+),重组质粒转化入E.coli TOP10,双酶切筛选阳性质粒,将测序正确的阳性质粒pET30a-MIC2分别转化至E.coli BL21(DE3)、Arctic Express(DE3)和Shuffle表达菌,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导表达并优化各菌株的表达条件,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测表达产物。重组蛋白经镍柱纯化后,以抗组氨酸(His)单抗为一抗,Western blotting分析其免疫反应性。结果 TgMIC2基因的扩增产物长约2 000 bp。SDSPAGE结果显示,TgMIC2的相对分子质量(M_r)为80 000,在不同表达菌中的表达形式及表达量存在差异:TgMIC2在BL21(DE3)和Arctic Express(DE3)中均存在可溶性表达和包涵体表达,且在不同诱导条件下(15℃、16 h和37℃、4 h)可溶性蛋白均约占10%,表达量无明显差异;而TgMIC2在Shuffle中仅以包涵体形式表达。Western blotting分析结果显示,纯化后的可溶性TgMIC2和包涵体表达的TgMIC2重组蛋白都能被抗His的单抗识别。结论构建了pET30a-MIC2重组表达质粒,在3种不同的原核表达菌中成功表达TgMIC2重组蛋白。     

乙型肝炎病毒e抗原结合蛋白4基因剪切体HBeBP4A的克隆与原核表达

目的:克隆乙型肝炎病毒e抗原结合蛋白未知功能新基因HBeBP4的剪切体基因HBeBP4A,构建其原核表达载体,诱导在大肠埃希菌中表达。方法:应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术及生物信息学(bioinformat-ics)技术从HepG2细胞提取的cDNA模板中扩增获得HBeBP4基因的剪切体基因HBeBP4A,选用pGEM-T-easy载体进行TA克隆,通过PCR、限制性酶切分析及测序进行鉴定,再将其亚克隆到原核表达载体pET-32a( )中,转化进BL21(DE3)宿主菌,IPTG诱导HBeBP4A融合蛋白的表达,表达产物进行十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析,考马斯亮蓝染色,以抗-His的单克隆抗体进行Western blotting免疫印迹分析鉴定证实表达蛋白的特异性。结果:成功扩增出HBeBP4剪切体基因HBeBP4A,并将其插入pET-32a( )原核表达载体,经BL21(DE3)受体菌转化、IPTG诱导、SDS-PAGE分析获得了HBeBP4A重组蛋白的表达,Western blotting证实了重组蛋白表达的特异性。结论:发现了乙型肝炎病毒e抗原结合蛋白4(HBeBP4)基因的剪切体HBeBP4A,构建了pET-32a( )-HBeBP4A原核表达载体,并利用大肠埃希菌原核表达系统成功获得了pET-32a( )-HBeBP4A重组蛋白的表达。     

刚地弓形虫微线蛋白16基因片段原核表达、纯化及免疫反应性分析

目的原核表达刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)微线蛋白16(micronemal protein 16,Tg MIC16)的3个基因片段,并分析3个重组蛋白的免疫反应性。方法参照Gen Bank中Tg MIC16基因序列,根据功能活性区将其分为3个片段(M16D1、M16D2、M16D3),分别设计引物,以刚地弓形虫RH株速殖子RNA为模板,通过RT-PCR扩增,获得预期的3个DNA片段,双酶切后连接至原核表达载体p ET-32a(+),将重组质粒转化入大肠埃希菌(Escherichia coli)TOP10,经PCR、双酶切筛选阳性质粒,测序确认后转化至E.coli Rosetta,经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测表达产物。重组蛋白经镍柱纯化后,分别以抗组氨酸(His)单抗和弓形虫感染兔血清为一抗,Western blotting分析其免疫反应性。结果 Tg MIC16 3个基因片段的RT-PCR扩增产物分别为1 806、1 290、855 bp。双酶切和测序结果显示,3个Tg MIC16片段的重组表达质粒构建成功。SDS-PAGE分析结果显示,3个重组蛋白成功表达,且均为以包涵体的形式表达,相对分子质量(M_r)分别为88 000、68 000、52 000。Western blotting分析结果显示,3个纯化的表达蛋白均能被抗His单抗和弓形虫感染兔血清识别。结论成功构建并表达Tg MIC16的3个功能活性区,且3个重组蛋白均表现出良好的免疫反应性。     

广州管圆线虫虾红素金属蛋白酶基因的克隆、表达及免疫组织定位分析

目的通过对广州管圆线虫虾红素金属蛋白酶基因的克隆、表达及免疫组织定位分析,探讨其在虫体中的分布及功能。方法根据虾红素金属蛋白酶EST序列设计引物进行RACE克隆和进化树分析;制备Ac-ALMP多抗血清,对广州管圆线虫L1,感染期L3和成虫进行免疫组织定位,通过Real-time PCR进行Ac-ALMP定量分析。结果获得广州管圆线虫虾红素金属蛋白酶全基因序列,并将其命名为Ac-ALMP(Astacin-like metalloprotease)。进化树分析Ac-ALMP基因的核酸序列与Dictyocaulus viviparous同源性较高。免疫荧光定位分析Ac-ALMP在广州管圆线虫的各期中主要分布于消化道(肠道与食道)。定量分析显示Ac-ALMP在各期中均有表达,其中L1相对表达量较高,L3次之。结论成功对Ac-ALMP蛋白进行了原核及真核表达,定量分析Ac-ALMP在虫体的肠道、角质层、精巢、体壁等均有分布,推测Ac-ALMP在广州管圆线虫寄生过程中起重要作用,可为广州管圆线虫病的防治及疫苗开发提供参考。     

简单异尖线虫L-样半胱氨酸蛋白酶基因的克隆与表达

目的克隆简单异尖线虫L-样半胱氨酸蛋白酶基因(AsCP)全长,研究其表达特性。方法根据GenBank中简单异尖线虫表达序列标签L-样半胱氨酸蛋白酶基因的部分信息,设计特异引物,用cDNA末端快速扩增技术扩增3′端部分,获得基因全长序列。根据基因全长序列设计引物,以简单异尖线虫总RNA为模板,RT-PCR扩增AsCP基因编码序列,产物经EcoRⅠ和SalⅠ双酶切,克隆至表达载体pET32а(+),转化大肠埃希菌BL21(DE3)株,以异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,表达效果经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测。结果3′端扩增片段大小为1211bp,拼接完整后基因全长1462bp,编码411个氨基酸,与秀丽隐杆线虫的L-半胱氨酸蛋白酶相似性达36.4%;重组载体pET32a(+)-AsCP经EcoRⅠ和SalⅠ双酶切后有一条约1150bp的条带,测序结果显示重组载体构建成功。SDS-PAGE结果表明,重组蛋白相对分子质量约为Mr60000(含6个组氨酸的标签),与目的蛋白相符。用不同浓度的IPTG诱导对表达量的影响很小,1mmol/LIPTG诱导2h后表达量达到最高水平。结论成功克隆并表达了L-样半胱氨酸蛋白酶。