福建省1例人巴贝虫病的诊断与鉴定

目的 分析1例人感染巴贝虫的实验室资料,提高对巴贝西虫病的诊断水平。方法 观察外周血中虫体的形态;从患者外周血中提取的DNA核酸,采用田鼠巴贝虫种特异性引物进行聚合酶链反应(PCR)。采用PCR扩增田鼠巴贝虫18S rRNA片段,取阳性PCR产物送测序并进行序列比对分析。结果 外周血中见大量疑似恶性疟原虫虫体;PCR产物测序结果经过BLAST比对,与田鼠巴贝虫18s核糖体DNA序列有99%的同源性。结论 感染的虫体为田鼠巴贝虫。福建省部分地区鼠类(尤其是野鼠)存在田鼠巴贝虫感染,是巴贝虫病的自然疫源地,必须引起足够的重视。     

广西某猴场诺氏疟原虫和田鼠巴贝虫感染情况调查

了解广西猴类诺氏疟原虫和田鼠巴贝虫感染情况,为诺氏疟原虫和田鼠巴贝虫的防控提供依据。采集广西某猴养殖场猴血样600份,其中食蟹猴330份,猕猴270份,巢式PCR扩增田鼠巴贝虫、诺氏疟原虫的18S r RNA基因,检测感染情况。测序PCR扩增阳性产物,BLAST比对分析,鉴定虫种。结果显示,共16份血样田鼠巴贝虫扩增阳性,感染率为2.7%(16/600),其中食蟹猴13份,感染率为3.9%(13/330);猕猴3份,感染率为1.1%(3/270),差异有统计学意义(P 0.05)。4份阳性PCR产物序列与田鼠巴贝虫序列(GenBank登录号:KC904078.1)一致性最高,为99.9%。未检测到诺氏疟原虫阳性血样。广西的猴中输入性诺氏疟原虫的定殖风险较低,田鼠巴贝虫的感染率较高。     

田鼠巴贝虫可溶性抗原组分分析及其初步应用

目的 分析田鼠巴贝虫可溶性抗原,寻找可用于免疫诊断的有效抗原组分.方法 用田鼠巴贝虫感染BALB/c小鼠,待虫血症达高峰期时,收集田鼠巴贝虫虫体;采用超声法制备可溶性粗抗原（soluble babesia antigens,SBA）并包板,ELISA检测血清特异性IgG,评价SBA的免疫反应性、交叉反应性和特异性;以SDS-PAGE电泳分析SBA组分,并进行Western Blot,分析其与感染鼠血清的反应性.结果 SBA-ELISA法可检测早期感染（7 d）小鼠血清,且与恶性疟、间日疟弓形虫病阳性血清无交叉反应,显示出其较好的诊断敏感性和较高的特异性.通过SDS-PAGE分析,获得5条分子质量为72、66、60、53、43 kDa的主蛋白带和介于14.4～116 kDa的7条次带.经Western Blot分析,SBA有15个抗原组分能被阳性小鼠血清识别,以72、53、43、39、30 kDa蛋白组分反应较强.结论 以SBA建立的间接ELISA可用于巴贝虫感染的有效筛查工具;田鼠巴贝虫可溶性抗原组分中72、53、43、39、30KDa为比较理想的抗原组分.     

浙江省中部及南部地区巴贝虫自然疫源地调查

目的调查浙江省中部及南部地区巴贝虫动物宿主和传播媒介感染情况,对浙江省确诊的1例人感染巴贝虫的18S rRNA基因序列与Gen Bank中巴贝虫序列进行比对,了解巴贝虫亲缘关系和进化特征。方法采集浙江省确诊的病例居住地以及浙江省中部及南部地区的动物宿主抗凝血样和蜱虫,提取DNA,以巴贝虫18S rRNA基因序列引物进行PCR扩增、测序,并对测序序列进行分析比对,确认感染虫种;在GenBank数据库中查询巴贝虫属、种的18S rRNA基因序列信息,以及不同动物宿主、不同地理来源的田鼠巴贝虫种内18S rRNA序列信息,进行BLAST比对分析,并构建系统进化树。结果采集的261份生物样品中有37份扩增出阳性条带,其中动物宿主抗凝血阳性率为14.2%(32/225),蜱阳性率为13.9%(5/36)。对部分阳性样品进行测序,获得有效测序序列20份,经序列比对分析,共发现田鼠巴贝虫(Babesia microti)5份,均来自鼠类血样;此外,在鼠、牛等宿主/媒介体内还分别检测到肉孢子虫属(Sarcocystis sp.)4份、肝簇虫属(Hepatozoon sp.)2份,球虫(Coccidia sp.)1份、东方泰勒虫(Theileria orientalis)阳性5份、水牛泰勒虫(Theileria buffeli)2份和驽巴贝虫(Babesia caballi)1份。浙江省确诊的人巴贝虫序列与Gen Bank中不同宿主、地理来源田鼠巴贝虫18S rRNA序列的同源性为98.1%~99.8%,与日本、中国云南的人源以及福建、浙江杭州、天台、仙居的鼠源田鼠巴贝虫同属一个分支,而我国的CNMM-2株和新疆1647株与美国GI株和德国Jena株的遗传距离较近。结论在浙江省中部及南部地区的啮齿类小型哺乳动物中发现多份田鼠巴贝虫的自然感染。     

细粒棘球蚴原头节mRNA测序及生物信息学初步分析

目的 利用RNA-seq技术对细粒棘球蚴原头节的转录组进行测序并对测序数据进行生物信息学分析,以揭示细粒棘球蚴原头节mRNA所包含的信息. 方法 用Trizol法提取原头节总RNA,分离mRNA,利用Illumina公司的HiSeq2000高通量测序仪对mRNA序列进行测序.参考英国桑格研究院（Wellcome Trust Sanger Institute）公布的细粒棘球绦虫基因组数据,对测序数据进行拼接组装,将获得的unigene与非冗余的蛋白序列数据库（non-redundant,Nr）、全球蛋白资源数据库（universal protein,UniProt）、基因本体数据库（gene ontology,GO）以及日本京都基因和基因组百科全书通路数据库（the kyotoencyclopedia of genes and genomes pathway,KEGG pathway）进行比对,获得该unigene的蛋白功能注释信息. 结果 测序后共获得132 007 609条读段（reads）,经过组装共形成91 342条unigene,平均长度为419 bp.通过GO分类注释,共有36 552个unigene获得了注释信息,分别归入到了生物学过程、分子功能、细胞组分3大类共计48个功能组.通过KEGG pathway的注释,有6 664条unigene注释到了KEGG上,参与了6大类生物过程中34个小类的代谢,共有227个代谢通路. 结论 获得了细粒棘球蚴原头节转录组相关信息,为棘球蚴病的后续研究提供了研究数据,积累了研究资料.     

田鼠巴贝虫感染BALB/c小鼠血细胞动态变化

目的 观察小鼠感染田鼠巴贝虫（Babesia microti）后体重、脾脏及血液细胞的变化情况。方法 取田鼠巴贝虫感染种鼠外周血（虫密度为20%）,腹腔接种6周龄健康BALB/c小鼠,100 μL/只,并设立健康小鼠对照组。感染组小鼠于感染后0～28 d隔日尾尖采血,涂薄血片,吉氏染色后油镜下观察田鼠巴贝虫增殖情况,并分别于感染后0、7、14、21、28 d测定小鼠体重、脾重,采用全自动血细胞分析仪分析小鼠血细胞。结果 小鼠在感染后第1天即可在外周血中查见田鼠巴贝虫虫体,第7天染虫率最高（55%）,随后感染率逐渐下降,至第28天外周血虫体镜检阴性,进入隐性感染阶段。小鼠于感染后第7天体重降至最低,随后逐渐恢复;脾脏重量在感染后第14天最重,后逐渐降低,但至第28天脾重仍高于正常组。全血细胞分析发现,感染组小鼠白细胞数量及淋巴细胞、嗜酸性粒细胞比例无明显变化,波动范围在正常小鼠参考值范围内。感染组小鼠红细胞计数、血红蛋白含量及血小板计数在感染后虫密度高峰期降至最低,后随着虫密度降低而逐渐恢复至正常水平。结论 田鼠巴贝虫感染可引起小鼠体重下降、脾脏增重、红细胞及血小板数量降低,全血细胞分析仪对巴贝虫病诊断具有参考价值。     

旋毛虫新生幼虫可溶性抗原的免疫蛋白组学分析

目的 鉴定能被旋毛虫感染血清识别的新生幼虫蛋白，为抗新生幼虫疫苗筛选候选抗原。方法 从感染旋毛虫的BALB/c小鼠肠道收集成虫，培养后收集新生幼虫，制备新生幼虫可溶性性抗原，通过蛋白质免疫印迹（Western blotting）筛选出能被旋毛虫感染小鼠血清识别的新生幼虫可溶性抗原蛋白带进行液相色谱串联质谱（LC-MS/MS）鉴定，并与Uniprot数据库中的旋毛虫数据进行比对，利用生物信息学在线网站分析所鉴定的旋毛虫蛋白的理化性质，使用WEGO在线软件对匹配的蛋白进行基因本体（GO）分类。收集旋毛虫肌幼虫、肠道感染性幼虫（感染后6 h）、成虫（感染后2 d）和新生幼虫等不同发育期的虫体，提取虫体总RNA，反转录为cDNA。qPCR扩增旋毛虫C型凝集素（CTL）、钙网蛋白（CRT）、锌指蛋白（ZFP）和丙酮酸激酶（PK）基因，以甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）基因为内参，以肌幼虫的相对转录水平为对照，比较4个旋毛虫基因在不同发育期的相对转录水平。不同发育期相对转录水平的比较采用单因素方差分析。结果 Western blotting结果显示，新生幼虫可溶性抗原的11条蛋白条带中有4条被...     

田鼠巴贝虫丽水分离株小鼠感染模型的建立及其病理变化

目的 建立田鼠巴贝虫丽水分离株(分离自浙江丽水患者,简称丽水分离株)BALB/c小鼠感染模型,研究小鼠感染后的原虫血症动态变化和病理特征。方法 用浙江丽水田鼠巴贝虫病患者的全血血样腹腔接种NOD-SCID小鼠进行保种、分离田鼠巴贝虫。50只BALB/c小鼠随机分为感染组和对照组(每组25只),感染组每鼠腹腔接种1.0×10⁷个NOD-SCID小鼠田鼠巴贝虫感染红细胞,对照组小鼠接种等量生理盐水。每日采小鼠尾静脉血制备薄血膜片,吉氏染色后显微镜下观察原虫形态,分析原虫血症。用DNA提取试剂盒提取感染小鼠血样DNA,巢式PCR扩增巴贝虫18S r RNA基因,测序后进行基因型鉴定和系统进化树分析。感染后0、5、10、15和20 d,每组分别取5只小鼠,测量体质量、脾长度和质量,制备脾组织切片,HE染色显微镜下观察脾组织病理特征;采用动物全自动血液分析仪检测感染小鼠血常规。组间比较采用t检验。结果 感染后5 d,感染组小鼠血涂片中可见单个环状体;感染后10 d,同一红细胞中可见2个或4个虫体,呈双梨形或马耳他十字形,并有细胞溶血现象;感染后15和20 d,红细胞内虫体仍...     

刚地弓形虫蛋白磷酸酶的全蛋白质组鉴定及生物信息学分析

从相关数据库分别下载刚地弓形虫GT1、 ME49、 VEG虫株,疟原虫以及44个其他真核生物物种的全蛋白质组氨基酸序列,应用HMMER3软件搜索弓形虫不同虫株及其他物种氨基酸序列,鉴定出弓形虫及其他物种磷酸酶家族蛋白。对所有鉴定出的磷酸酶家族蛋白进行聚类分析,提取相对保守的磷酸酶家族蛋白氨基酸序列,分别用邻接法和最大似然法构建系统进化树。应用Pfam在线工具对鉴定出的弓形虫磷酸酶蛋白的结构域进行注释,并进行基因本体(GO)和京都基因与基因组百科全书(KEGG)富集分析,利用基因芯片数据分析并比较蛋白磷酸酶在不同虫株及ME49虫株不同发育时期的转录水平。共鉴定出64个弓形虫磷酸酶蛋白,分属5个磷酸酶亚家族,其中,磷蛋白磷酸酶家族蛋白11个,酪氨酸磷酸酶样蛋白A家族蛋白1个,天冬氨酸依赖的酪氨酸磷酸酶家族蛋白8个,双特异性磷酸酶家族蛋白9个,Mg²⁺或Mn²⁺依赖的磷酸酶家族蛋白35个。系统进化树分析结果显示,蛋白磷酸酶在不同弓形虫虫株间高度保守,仅有2个蛋白磷酸酶无直系同源蛋白,为VEG虫株所特有。GO富集分析结果显示,弓形虫蛋白磷酸酶主要具有磷酸酶、水解酶及催化活性的分子功能,参与调节去磷酸化的生物学过程。芯片分析结果显示,蛋白磷酸酶在弓形虫不同虫株速殖子时期的表达谱相似,虫株间表达水平差异最大的为TG312200,其在ME49虫株中的表达水平约为GT1和VEG虫株的4倍;部分蛋白磷酸酶的转录水平在ME49虫株不同发育阶段差异显著,如TG318660在未孢子化的卵囊中低表达,TG304955在速殖子和缓殖子期高表达,这些在不同发育时期差异表达的蛋白磷酸酶可能在虫体发育过程中发挥重要作用。     

田鼠巴贝虫实验动物模型的建立

目的建立田鼠巴贝虫(Babesia microti)的实验动物模型。方法自感染田鼠巴贝虫的种鼠取血,腹腔注射接种3~4周龄雌性BALB/c小鼠(7只)、免疫抑制BALB/c小鼠(4只)、雄性SCID小鼠(4只)和NOD-SCID小鼠(4只)。感染后每天采血,涂制薄血片,吉氏染色,油镜下观察田鼠巴贝虫的生长、增殖情况,记录红细胞的感染率。解剖3只不同红细胞感染率的BALB/c小鼠,油镜下观察心、肝、脾、肺、肾、脑和骨髓等组织的感染情况。记录各组织中红细胞的感染率,并分析与外周血红细胞感染率的关系。取红细胞感染率大于40%的BALB/c小鼠血液,冷冻保存2个月后用同样的方法接种小鼠,观察田鼠巴贝虫的增殖情况。结果 BALB/c小鼠、免疫抑制BALB/c小鼠、SCID小鼠和NOD-SCID小鼠接种后,末梢血液中均检测出田鼠巴贝虫。BALB/c小鼠的红细胞感染率在d7达到峰值(82.4%),免疫抑制BALB/c小鼠的红细胞感染率在d5达到峰值(73.2%),SCID小鼠和NOD-SCID小鼠的红细胞感染率均在d8达到峰值(86.4%和72.5%)。红细胞感染率达到峰值后,BALB/c小鼠的红细胞感染率迅速下降,免疫抑制BALB/c小鼠的红细胞感染率缓慢降低,SCID小鼠和NOD-SCID小鼠的红细胞感染率则出现震荡变化。感染的BALB/c小鼠的心、肝、脾、肺、肾、脑和骨髓等组织内均可观察到田鼠巴贝虫,虫体主要位于红细胞内,各组织内的红细胞感染率随外周血红细胞感染率的升高而增高。冷冻保存的虫种复苏后可感染健康BALB/c小鼠,末梢血中出现虫体的时间与新鲜含虫血液感染鼠的比较滞后2 d,达到感染高峰的时间滞后1 d。结论成功建立田鼠巴贝虫的小鼠模型,红细胞的感染情况与机体的免疫状态相关。     

1例误诊为疟疾的田鼠巴贝虫病患者的鉴别诊断

目的对1例误诊为疟疾的田鼠巴贝虫病患者进行鉴别诊断,并分析其临床诊治情况。方法收集患者的临床发病资料,对患者进行流行病学调查。采集患者血样,制作厚、薄血片,吉氏染色后镜检,并进行疟疾快速诊断试剂(RDT)检测。提取患者外周血DNA,以巴贝虫18S r RNA基因属、种特异性引物和恶性疟原虫核糖体RNA小亚基(SSU r RNA)基因特异性引物进行PCR扩增。结果该患者于2019年2月起,反复发热2月余,血常规白细胞、红细胞和血小板进行性下降,有中度贫血及脾肿大。流行病学调查结果显示,该患者无外出史。患者外周血的厚、薄涂片均可见大量似恶性疟原虫虫体,其外周血经疟疾快速诊断试剂检测呈阴性。患者血样DNA经PCR扩增后,可获得长度约400 bp和1 600 bp的巴贝虫属、田鼠巴贝虫种特异性阳性条带。结论结合患者的临床发病资料、流行病学史、病原学和分子生物学检测结果,确诊其为田鼠巴贝虫感染。     

河南省信阳地区家畜寄生蜱感染巴贝虫的分子流行病学调查

目的 了解河南省信阳地区家畜寄生蜱感染巴贝虫的情况。方法 2022年6—8月在河南省信阳市光山县和商城县采集家畜动物体表寄生蜱,采用形态学和PCR扩增蜱虫16S rDNA鉴定蜱虫种类。提取蜱虫基因组DNA,采用巢式PCR扩增巴贝虫18S rRNA基因。目的条带经测序后,进行BLAST比对分析,采用邻接法构建系统进化树,采用MEGA7.0软件进行同源性分析。结果 共釆集335只蜱,形态学和PCR扩增鉴定结果显示,长角血蜱49只、微小扇头蜱208只、褐黄血蜱1只、具环扇头蜱34只、刻点血蜱43只。PCR扩增结果显示,335份蜱虫样品中有2份样品扩增出巴贝虫400 bp大小的目的条带,蜱虫巴贝虫总阳性率为0.6%。BLAST比对分析结果显示,1份样品扩增出的18S rRNA序列与GenBank中来自美国（MK609547）、泰国（MG199181）、中国（KU204794）的田鼠巴贝虫序列相似性均达99.26%;另1份样品扩增出的18S rRNA序列与GenBank中来自美国（MH620203）、印度（MN161136）和中国（KP666166）的吉氏巴贝虫序列相似性均达100%。系统进化树...     

豪猪血蜱转录组测序分析

目的测序分析豪猪血蜱转录组,比较雌、雄成蜱差异表达基因及其通路,为豪猪血蜱的防制提供参考。方法采用Illumina高通量技术对豪猪血蜱雌、雄成蜱进行转录组测序,将测序得到的数据进行拼接组装,利用生物信息学方法对所得序列进行功能注释、简单重复序列标记及雌雄蜱差异表达基因分析。结果共获得181 246 184个clean reads数据,组装后得到90 957个unigenes序列,平均长度951。通过BLAST软件将所有unigenes序列与Nr, Nt, Pfam, KOG,Swiss-prot, KEGG,GO数据库进行比对。其中与Nr数据库比对发现豪猪血蜱基因序列与肩突硬蜱(Ixodes scapularis)具有较高的同源性,为51.2%;在GO数据库中,有150 460个基因被注释,在56个功能群的二级分类中注释基因较多的是细胞过程(15 274个);获得KOG注释的基因序列有19 745个,将注释成功的基因按KOG的group进行分类,聚集较高的为一般功能预测基因2 071个(16.85%);注释为KEGG代谢通路相关的序列共有12 054个,在参与代谢通路5个分支中,细胞过程注释到的序列较高,为1 765个(14.64%)。在各分支的亚支中,环境信息处理分支中的信号转导丰度较高(1 270,10.54%)。通过SSR位点查找共鉴定出21 883个SSR;SNP分析显示发生转换的SNP数为961 890个,发生颠换的SNP数为509 232个。结论通过对比豪猪血蜱雌、雄蜱差异表达基因及其通路,发现了胚胎发育和性别维持相关基因通路在雌蜱中的高表达,为豪猪血蜱控制策略的制定提供了理论基础。     

一段检测锥虫特异性核酸靶序列的筛选及评价

目的以60S核糖体蛋白L44(60S RPL44)基因为靶基因,筛选出一段可特异性检测锥虫属(Trypanosoma)原虫的核酸靶序列,并对其敏感度和特异性进行初步评价。方法将布氏锥虫指名亚种(T.brucei brucei)的60S RPL44基因序列与公共数据库中田鼠巴贝虫(Babesia microti)、杜氏利什曼原虫(Leishmania donovani)、间日疟原虫(Plasmodium vivax)、恶性疟原虫(P.falciparum)和刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)等24种非锥虫属常见的血源性原虫,以及8种锥虫属内其他种的同源序列进行比对。同时,利用Primer Premier 6对布氏锥虫指名亚种的60S RPL44基因序列设计多对引物,结合序列比对结果和各引物评价情况,从中筛选出一对评价情况良好且理论上仅能扩增锥虫属靶序列的引物。利用该对引物检测布氏锥虫指名亚种、布氏锥虫罗德西亚种(T.b.rhodesiense)、刚果锥虫(T.congolense)、伊氏锥虫(T.evansi)以及上述5种其他属原虫,评价其特异性。采用梯度稀释(10 ng/μl、1 ng/μl、100 pg/μl、10 pg/μl、1 pg/μl)的伊氏锥虫基因组DNA为模板评价其敏感度。结果选出一段基于60S RPL44的特异性序列,针对该序列的扩增引物为P1:5′-CCTGATGAAAGGTGCAATG-3′,P2:5′-CGTTTTCGCCTTCTTGTGGA-3′。该引物扩增布氏锥虫指名亚种、布氏锥虫罗德西亚种、刚果锥虫、伊氏锥虫的DNA均为阳性,扩增片段长156 bp;扩增田鼠巴贝虫、杜氏利什曼原虫、间日疟原虫、恶性疟原虫、刚地弓形虫等非锥虫属原虫均为阴性;该引物检测伊氏锥虫DNA的敏感度为10 pg/μl。结论筛选获得一段敏感度较高、特异性强的检测锥虫属原虫的核酸靶标序列。     

胰腺癌干细胞差异microRNAs的表达及生物信息学

目的:筛选与胰腺癌干细胞相关的差异表达miRNAs,并进行生物信息学分析.方法:以MIA-PaCa2(TIChigh)与BxPc-3(TIClow)为研究胰腺癌干细胞的工具细胞制备总RNA,经质量鉴定后进行荧光标记;采用Agilent人类miRNA芯片进行杂交实验,获得miRNA表达谱;以Gene Spring Software 11.0软件和Quantile算法分析芯片实验数据,筛选与胰腺癌干细胞相关的差异miRNAs;荧光定量PCR验证部分差异表达miRNAs;基于Sanger数据库预测差异miRNA靶基因,基于Gene Ontology数据库进行GO注释,基于KEGG数据库进行Pathway注释.结果:获得符合基因芯片实验质量标准的RNA样品,基因芯片杂交及数据分析共鉴定到940个miRNAs,得到91个差异表达miRNAs(P<0.05,fold change≥2),其中MIAPaCa2(TIChigh)中下调表达45个,上调表达46个.荧光定量PCR验证21条差异miRNAs,其中19条均与芯片结果相符.TargetScan6.0数据库靶基因预测共得到2895条靶基因,GO注释显示他们主要涉及轴突导向、血管生成、转录后蛋白修饰等功能.Pathway注释显示主要涉及癌症途径、细胞-基质黏附途径、Hedgehog信号途径、MAPK信号途径等信号通路.结论:筛选出的胰腺癌干细胞相关差异表达miRNAs调控多种具有不同细胞功能和参与不同信号通路的基因,有可能成为胰腺癌新的治疗靶点.     

日本血吸虫基因组核糖体移码序列的预测分析

目的 预测日本血吸虫基因组中核糖体移码的基因序列并进行鉴定.方法 挑选稳定并能够可靠预测RNA假结结构的软件,编写批量提交数据的程序并结合本地手段进行假结结构预测,计算序列最小自由能从而挑选稳定序列,进一步使用生物信息学软件Fsfinder分析序列中核糖体移码位点,进行开放性阅读框(open reading frame,0RF)分析,筛选出可能产生核糖体移码的日本血吸虫基因序列.利用日本血吸虫蛋白质组数据库中的肽段质谱数据进行比对,寻找对应的肽段信息.结果 从日本血吸虫的8452条基因编码序列中预测出26条可能含有促使核糖体移码假结结构的序列.经过日本血吸虫蛋白质组数据库中的肽段质谱数据进行比对,发现日本血吸虫输入蛋白(Sjimportin)移码之后产生的肽段.结论 整合已有的RNA假结预测软件以及核糖体移码预测软件,建立了日本血吸虫预测核糖体移码序列数据库,并成功获取日本血吸虫蛋白Sjimportin核糖体移码表达证据.     

细粒棘球蚴重组蛋白P29(rEg.P29)诱导下差异表达microRNA的筛选及分析北大核心CSCD

目的对细粒棘球蚴重组蛋白P29(rEg.P29)诱导小鼠差异表达的microRNA进行筛选和分析,以期为rEg.P29免疫前后宿主免疫细胞的分化研究提供线索。方法将6-8周龄SPF级BALB/c小鼠随机分为2组,rEg.P29免疫组和对照组,每组12只。rEg.P29免疫组于小鼠腹部多点免疫重组蛋白100μl(含rEg.P2910μg),共免疫2次,第1次免疫2周后进行第2次免疫。提取第2周(第1次免疫后2周)、第6周(第1次免疫后4周)、第8周(第1次免疫后6周)各组小鼠外周血淋巴细胞,分离microRNA用于建库测序,利用生物信息学方法筛选rEg.P29诱导下差异表达的microRNA分子,并进行注释分析。结果测序所得数据经拼接组装比对,共获得成熟的microRNA序列342条,其中已知的microRNA序列206条,未知信息序列36条。在已知的microRNA分子中,差异表达共55个,其中上调31个,下调24个;在新发现的microRNA分子中,差异表达11个,其中上调5个,下调6个。靶基因预测结果显示,表达上调microRNA调控的靶基因有14279个,表达下调microRNA调控的靶基因13911个。GO富集注释结果显示,在上调分子中,生物学进程(BP)获得18条注释信息,其中16个microRNA调控的826个靶基因被注释到细胞分化(cell differentiation)条目下;在下调分子中,生物学进程(BP)获得21条注释信息,其中25个microRNA调控的712个靶基因被注释到细胞分化(cell differentiation)条目下。KEGG通路分析结果显示,无论是表达上调还是下调的分子,其靶基因的代谢通路均显著富集到Th1 and Th2 cell differentiation、Th17 cell differentiation、B cell receptor signaling pathway等与细胞分化相关的信号通路以及与肿瘤相关的信号通路上。结论在rEg.P29诱导下小鼠免疫细胞存在差异表达的microRNA分子,这些分子可能与免疫细胞的分化相关。     

细粒棘球蚴重组蛋白P29(rEg.P29)诱导下差异表达microRNA的筛选及分析

目的对细粒棘球蚴重组蛋白P29(rEg.P29)诱导小鼠差异表达的microRNA进行筛选和分析,以期为rEg.P29免疫前后宿主免疫细胞的分化研究提供线索。方法将6-8周龄SPF级BALB/c小鼠随机分为2组,rEg.P29免疫组和对照组,每组12只。rEg.P29免疫组于小鼠腹部多点免疫重组蛋白100μl(含rEg.P29 10μg),共免疫2次,第1次免疫2周后进行第2次免疫。提取第2周(第1次免疫后2周)、第6周(第1次免疫后4周)、第8周(第1次免疫后6周)各组小鼠外周血淋巴细胞,分离microRNA用于建库测序,利用生物信息学方法筛选rEg.P29诱导下差异表达的microRNA分子,并进行注释分析。结果测序所得数据经拼接组装比对,共获得成熟的microRNA序列342条,其中已知的microRNA序列206条,未知信息序列36条。在已知的microRNA分子中,差异表达共55个,其中上调31个,下调24个;在新发现的microRNA分子中,差异表达11个,其中上调5个,下调6个。靶基因预测结果显示,表达上调microRNA调控的靶基因有14 279个,表达下调microRNA调控的靶基因13 911个。GO富集注释结果显示,在上调分子中,生物学进程(BP)获得18条注释信息,其中16个microRNA调控的826个靶基因被注释到细胞分化(cell differentiation)条目下;在下调分子中,生物学进程(BP)获得21条注释信息,其中25个microRNA调控的712个靶基因被注释到细胞分化(cell differentiation)条目下。KEGG通路分析结果显示,无论是表达上调还是下调的分子,其靶基因的代谢通路均显著富集到Th1 and Th2 cell differentiation、Th17 cell differentiation、B cell receptor signaling pathway等与细胞分化相关的信号通路以及与肿瘤相关的信号通路上。结论在rEg.P29诱导下小鼠免疫细胞存在差异表达的microRNA分子,这些分子可能与免疫细胞的分化相关。     

基于RNA-Seq技术对血链球菌spxA_2敲除株的转录组分析

目的应用RNA测序(RNA-Seq)技术分析spxA2调控的靶基因,以期揭示spx蛋白的转录调控机制,为血链球菌致病机制的深入研究奠定基础。方法采用高通量测序技术对血链球菌野生株和spxA2突变株进行转录组分析,将测序所产生的数据绘到SK36参考基因组上,获得各个基因的表达信息,应用基因组比对结果进行基因定量。利用edgeR软件分析△spxA2和WT中的基因差异表达情况。随机抽取若干差异表达基因,通过实时定量PCR对基因的差异表达情况进行验证。应用GOTermFinder软件,找出差异表达基因中显著富集GO条目,并推测差异表达基因行使的主要生物学功能;通过Pathway分析进一步了解差异表达基因所参与的代谢通路及其具体的生物学意义。结果将序列数据与公共数据库COG、GO、KEGG、NR、NT和Swiss-Pro进行BLAST比对,89.1%(1203个)独立基因得到功能注释。其中,859个独立基因注释到COG并被划分到25个功能类别,910个独立基因注释到GO数据库,707个(52.4%)独立基因被归为KEGG中的32条代谢途径。对△spxA2组和WT组进行基因表达差异分析,确定spxA2基因敲除株有17个基因表达上调,5个基因表达下调。GO功能显著性富集和Pathway显著性富集分析,表明筛选到的差异表达基因主要富集在氨基酸代谢生物学过程和酶活性细胞组分,共得到2条显著富集的代谢通路,涉及丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢及牛磺酸和牛磺酸代谢。结论RNA-Seq所得序列数据在测序深度、覆盖率以及与血链球菌SK36标准株基因组的比对结果均较理想,转录组测序结果基本能反映血链球菌的整个转录组情况。spxA2是一个全局性转录调控因子,参与多个基因的转录调控,该蛋白的改变可导致血链球菌丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢以及牛磺酸和牛磺酸代谢通路发生变化,可为深入研究血链球菌致病机制及其与代谢途径之间的联系提供重要依据。