弓形虫ROP2-SAG1重组复合蛋白及其重组质粒的免疫效应

目的研究弓形虫棒状体蛋白2(ROP2)和膜表面蛋白1(SAG1)重组复合抗原(ROP2-SAG1)的核酸和蛋白两种疫苗的免疫效应。方法 60只雌性BALB/c小鼠随机均分为4组(每组15只),即rROP2-SAG1蛋白组、无菌生理盐水组、pcROP2-SAG1质粒组和pcDNA3.1质粒组,rROP2-SAG1组以2.5μgrROP2-SAG1重组蛋白与等体积佐剂乳化后,背部皮下多点免疫小鼠;无菌生理盐水组以等体积无菌生理盐水替代重组蛋白,首次免疫使用福氏完全佐剂,其余使用福氏不完全佐剂。pcROP2-SAG1组和pcDNA3.1组分别以pcROP2-SAG1和空质粒pcDNA3.1腿部肌肉注射免疫,剂量为100μg/次;以上各组小鼠共免疫3次,每次间隔2周。采用间接ELISA方法检测免疫后25、45和70d小鼠血清中特异性IgG抗体,及末次免疫后2周小鼠血清特异性IgG1和IgG2a抗体。用CCK-8细胞增殖法检测小鼠脾细胞增殖,间接ELISA法检测小鼠脾细胞培养上清液中γ干扰素(IFN-γ)和白介素2(IL-2)表达水平。结果 rROP2-SAG1组小鼠血清特异性IgG抗体水平随着免疫时间的延长持续升高,pcROP2-SAG1质粒组抗体则随着免疫时间的延长相对稳定。末次免疫后2周,rROP2-SAG1组小鼠血清IgG1抗体水平(1.538±0.183)显著高于IgG2a(0.618±0.122)(P0.05),而pcROP2-SAG1组IgG1抗体水平(1.107±0.137)与IgG2a(0.830±0.185)间的差异无统计学意义(P0.05)。以特异性抗原rROP2-SAG1为刺激物时,rROP2-SAG1组小鼠脾细胞受特异性抗原刺激的增殖效果(A450值=0.348±0.042)显著高于pcROP2-SAG1组(0.123±0.018)(P0.05)。rROP2-SAG1组小鼠脾细胞培养上清液中IFN-γ含量[(149.37±30.51)pg/ml]、IL-2含量[38.58±9.10)pg/ml],分别与pcROP2-SAG1组IFN-γ[(138.58l±29.92)pg/ml]、IL-2[37.47l±9.26)pg/ml]比较,差异均无统计学意义(P0.05)。结论 ROP2-SAG1重组复合蛋白诱导的抗体水平、脾细胞增值效应显著高于重组质粒pcROP2-SAG1。     

人乳头瘤病毒16型晚期基因L1的原核表达质粒的构建和鉴定

目的 构建人类乳头瘤病毒（ＨＰＶ）１６型晚期基因Ｌ１的原核表达质粒,以期从中选出能够高效表达ＨＰＶ１６Ｌ１的重组子,为进一步表达Ｌ１蛋白奠定基础。方法 应用定向克隆策略,将ＨＰＶ１６Ｌ１基因分别克隆到原核表达载体ｐＴｒａｃ９９Ａ和ｐＥＴ－２１ｃ中。结果 通过酶切鉴定选出了重组子ｐＴｒｃ９９Ａ－ＨＰＶ１６Ｌ１和ｐＥＴ－２１ｃ－ＨＰＶ１６Ｌ１。结论 ＨＰＶ１６Ｌ１的原核表达质粒构建成功。     

人乳头瘤病毒16型L1蛋白表达及其单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立

目的表达并纯化重组人乳头瘤病毒16型（HPV16）L1蛋白，建立分泌抗HPV16 L1单克隆抗体（mAb）的杂交瘤细胞株。方法以基因工程表达HPV16L1蛋白。用Ni—NTA技术进行纯化后免疫BALB／c小鼠，取脾细胞与SP2／0骨髓瘤细胞融合，经含次黄嘌呤、氨基蝶呤、胸腺嘧啶（HAT）的选择培养基及有限稀释法进行克隆化，用间接ELISA法筛选阳性杂交瘤细胞，对获得的杂交瘤细胞株染色体进行计数．同时测定细胞培养上清mAb的效价。结果筛选出2株可分泌抗HPV16 L1 mAb的杂交瘤细胞，命名为AE3和AG7，染色体数分别为130条和98条。2株杂交瘤细胞AE3和AG7培养上清的效价分别为1：5120和1：80。结论成功建立了2株可分泌抗HPV 16 L1 mAb的杂交瘤细胞，为进一步研制HPV感染检测试剂盒提供实验基础。     

人乳头瘤病毒51型L1蛋白B细胞表位预测

目的对高危型人乳头瘤病毒51型(HPV-51)L1蛋白的B细胞表位进行预测和分析。方法从Swissprot蛋白质数据库中检索HPV51型L1蛋白序列,采用生物信息学软件分析其理化性质、二级结构、柔韧性、亲水性、表面可及性、抗原性等参数,运用ExPASy网站的TMPRED和PROTSCALE软件分析预测其跨膜区域;采用氨基酸抗原性指数方法计算肽段的平均抗原指数(AI),将得到的肽段序列用Protein BLAST进行在线同源性匹配分析。结果 HPV51型L1蛋白由504个氨基酸残基组成,分子质量单位为56.31487 ku,等电点8.38。预测人乳头瘤病毒51型L1蛋白的B细胞表位可能位于其N端的5-10、51-57、75-96、124-132、138-152、174-185、214-217、230-234、269-286、316-320、336-341、355-360、428-443、475-486、489-497肽段。采用氨基酸抗原性指数方法计算AI,筛选出10条HPV 51型L1蛋白的B细胞优势表位。同源性分析显示75-96、138-152、174-185、428-443区段为可能的HPV51型L1蛋白优势B细胞表位。结论生物信息学方法预测HPV51型L1蛋白含有多个B细胞表位优势区域,可为其表位疫苗的研究提供理论基础。     

人乳头瘤病毒16型L1的表达、病毒样颗粒组装及其免疫原性研究

目的 在原核表达系统中表达HPV16 L1蛋白,纯化后在体外自组装成VLPs并鉴定。方法 优化GenBank中HPV16 L1基因序列并截短C末端25个氨基酸,构建至原核表达载体pET-28a上,获得重组表达载体pET28a-16L1△C25。采用镍亲和层析法纯化超声上清,于体外解组装-重组装HPV16 VLPs,采用动态光散射和透射电镜进行形貌分析,纯化后于第0、2和4周免疫小鼠,假病毒中和试验检测HPV16 VLPs免疫后血清中和抗体。结果 双酶切和测序结果表明成功构建pET28a-16L1△C25重组质粒,诱导表达后,经SDS-PAGE和Western blotting分析显示表达的L1蛋白大部分以可溶性形式存在,纯化后的蛋白样品于体外重新组装,动态光散射和透射电镜能够观察到形态与天然病毒颗粒相似的VLPs,第6周小鼠血清中和抗体滴度Log10平均值达到4.43。结论 利用原核表达系统成功表达了截短型HPV16 L1蛋白,并于体外组装成结构完整的VLPs,且具有较好的免疫原性,为低成本HPV预防性疫苗的研发奠定基础。     

人乳头瘤病毒16型表位嵌合病毒样颗粒的构建及免疫原性研究

目的 制备E7_49-57表位嵌合病毒样颗粒,并进行免疫原性分析。方法 利用分子模拟软件Discovery Studio预测HPV16 L1的E7_49-57最佳嵌合位点,将E7_49-57表位嵌入预测位点。构建pET28a-16L1-E7_49-57重组质粒,于大肠杆菌中诱导表达HPV16L1-E7_49-57蛋白并利用镍柱进行亲和层析纯化。于体外重组VLPs后,进行动态光散射粒径和透射电镜分析。用E7_49-57嵌合VLPs免疫小鼠,假病毒中和试验检测免疫血清中和抗体滴度。流式多因子法检测Th1和Th2型细胞因子水平。结果 HI loop区355/356为最佳表位嵌合位点。正确表达了HPV16 L1-E7_49-57蛋白并组装E7_49-57嵌合VLPs。E7_49-57嵌合VLPs免疫小鼠3次后,小鼠血清中和抗体滴度log10平均值达到4.23,略低于野生型VLPs(log10平均值为4.45)。但是,相对于野生型VLPs,E7_49-57嵌合VLPs诱导产生Th1型细胞因子(INF-γ, IL-2, TNF-α)的水平显著提高。结论 本研究制备的E7_49-57嵌合VLPs 能刺激机体同时产生较强的体液和细胞免疫应答,可能兼具预防和治疗双重功效,为宫颈癌治疗性疫苗的研制奠定基础。     

人乳头瘤病毒16型次要结构蛋白家兔免疫血清的制备及其特性研究

目的制备高效价人乳头瘤病毒(HPV)16型次要结构蛋白(L2)特异性兔血清抗体,并对其效价及其与HPV16 L2蛋白结合的特异性进行鉴定。方法将重组质粒PGEX-4T-1-HPV16 L2转化至E.coliBL21(DE3)中,经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导蛋白表达,SDS-PAGE和Western blot鉴定融合蛋白的抗原性;经镍螯合亲和层析柱(Ni-NTA Agarose)纯化HPV16 L2全长融合蛋白,纯化蛋白用佐剂乳化后经日本大耳白家兔背部皮下多点免疫注射,间隔2周后加强免疫,共2次,并分别于免疫前和每次免疫后1周取血,采用Western blot检测血清抗体的特异性,采用ELISA法检测血清抗体水平及变化趋势。结果家兔用HPV16 L2融合蛋白全程免疫后均产生了抗HPV16 L2抗体,ELISA法检测最高滴度达1∶256 000;Western blot检测显示,该抗体能识别HPV16 L2蛋白。结论用原核HPV16 L2全长蛋白免疫家兔,可获得高效价的血清抗体,该抗体具有与HPV L2蛋白结合的特异性。     

以人乳头瘤病毒16 L1为载体的流感通用疫苗初步研究

目的 构建以人乳头瘤病毒(human papillomavirus,HPV)16 L1为载体的甲型流感病毒M2基因胞外区(M2e)通用疫苗杆粒,利用昆虫细胞杆状病毒表达系统,进行初步的蛋白表达.方法 利用PCR技术将甲型流感病毒M2e基因序列与HPVl6 L1相连.经酶切、酶联将融合基因插入pFastBacHTA载体,在DH10Bac细胞中进行同源重组,经测序鉴定后构建M2e-HPV16 L1杆粒,脂质体转染sf9昆虫细胞,收获并扩增含有M2e-HPV16 L1的杆状病毒,经扩增后获得高效价的重组杆状病毒,用SDS-PAGE、免疫荧光法和电镜检测目的蛋白的表达.结果 构建了以HPV16 L1为载体的M2e通用疫苗杆粒,通过转染sf9昆虫细胞得到初步M2e-HPV16 L1融合蛋白表达.结论 成功构建了HPV16 L1与甲型流感病毒M2e融合蛋白的病毒样颗粒,为流感通用疫苗的研制奠定了基础.     

弓形虫棒状体蛋白2和膜表面蛋白1融合基因的克隆与表达

目的 进行弓形虫棒状体蛋白2（ROP2）和膜表面蛋白1（P30）融合基因的克隆与表达，为弓形虫ROP2?鄄P30基因工程复合抗原的制备做准备。 方法 半套式PCR扩增编码弓形虫P30的基因片段，克隆至已构建成功的重组质粒pUC119/ROP2中，经PCR和酶切鉴定正确的重组质粒pUC119/ROP2-P30再以SacⅠ/HindⅢ双酶切克隆至表达载体pET28b上，鉴定正确的重组质粒pET28b/ROP2-P30转化大肠埃希菌表达菌株BL21-Codon Plus（DE3）-RIL，经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达。 结果 从弓形虫RH株基因组DNA中扩增出700 bp P30基因片段，成功构建重组质粒pET28b/ROP2-P30，该质粒经PCR和酶切鉴定，与预期结果一致，并在大肠埃希菌中高效表达，产生相对分子质量（Mr）约为 69 000的重组目的蛋白。 结论 弓形虫ROP2和P301融合基因克隆成功，并表达出预期的复合重组蛋白ROP2-P30。     

人乳头瘤病毒16型(新疆株)E6基因的原核表达

根据人乳头瘤病毒16（新疆株）E6基因编码序列设计引物，从含有HPV16 E6基因的质粒中扩增出含HPV16 E6基因的CNA片段，该片段全长450bp，将所得片段与pMD18-T载体连接，转化到JM109大肠杆菌中，筛选的阳性克隆扩增后，提取质粒DNA，用BamH I和Sal I酶切，回收450bp的目的片段，定向克隆到pET28a中，转化JM109受体菌，从JM109受体菌中提出质粒，再转化到BL21（DE3）中，筛选出转化体，用IPTG诱导表达，在PAGE上见到所表达的18kD的特异性的HPV16（新疆株）E6蛋白条带。     

新疆哈萨克族食管病变人乳头瘤病毒-L1衣壳蛋白表达差异性研究

目的探讨人乳头瘤病毒(human papillomavirus,HPV)L1衣壳蛋白在新疆哈萨克族食管病变中的表达差异性及临床意义。方法收集2015年1月至2016年12月在新疆维吾尔自治区人民医院经胃镜检查获得的100例哈萨克族食管病变标本,采用HC2二代杂交捕获法检测HPV DNA,其中56例为阳性,阳性标本采用CytoReact HPV L1试剂盒检测壳蛋白在食管脱落细胞中的表达,并追踪其相对应的病理结果,依据病理学结果进行分组,其中食管炎组32例,低级别上皮内瘤变组3例,高级别上皮内瘤变组6例,食管鳞状细胞癌组15例。结果 56例患者HPVL1壳蛋白的总阳性率为42.8%(24/56),其中食管炎、低级别上皮内瘤变,高级别上皮内瘤变和食管鳞状细胞癌HPVL1壳蛋白的阳性表达率分别为62.5%(20/32)、66.7%(2/3)、33.3%(2/6)、0(0/15)。炎症组及低级别上皮内瘤变组HPV-L1衣壳蛋白阳性率明显升高,高级别上皮内瘤变组及食管鳞状细胞癌组HPV-L1衣壳蛋白阳性率明显下降。食管鳞状上皮癌组与炎症组、低级别上皮内瘤变组及高级别上皮内瘤变组阳性率比较差异有统计学意义(P值分别为0.000 05、0.000 7、0.000 09),炎症组与低级别上皮内瘤变组二者间阳性率差异无统计学意义(P0.05),低级别上皮内瘤变组与高级别上皮内瘤变组阳性率比较差异无统计学意义(P0.05)。结论 HPVL1壳蛋白在新疆哈萨克族食管病变中的阳性表达随病变程度的加重而呈下降趋势,表达存在差异性,提示其有望成为预测新疆哈萨克族食管癌前病变的指标之一。     

人乳头瘤病毒58型E6E7融合基因重组巨细胞病毒的构建及鉴定

目的 利用人乳头瘤病毒(Human papillomavirus,HPV)58突变型E6E7(Mutant type E6E7,mE6E7)融合基因为靶点,巨细胞病毒株(Towne株)细菌人工染色体(SW102 Towne bacterial artificial chromosome,SW102-T-BAC)为载体,构建携带HPV58 mE6E7融合基因的重组病毒,探讨HPV58mE6E7的转化活性。方法 PCR扩增带有50 bp Towne 开放读码框(open reading frame,ORF)75左右同源臂的GalK、mE6E7及野生型E6E7(Wild type E6E7,wE6E7)融合基因片段,切胶回收纯化;将GalK片段电转到(SW102-T-BAC)感受态细胞,经过同源重组、GalK及氯霉素抗性筛选,获得SW102-T-ORF75-Galk-BAC克隆;然后分别将纯化的mE6E7及wE6E7电转到SW102-T-ORF75-Galk-BAC感受态细胞,经脱GalK及氯霉素抗性筛选,获得SW102-T-ORF75-mE6E7-BAC及SW102-T-ORF75-wE6E7-BAC克隆;提取所得克隆质粒DNA,转染ARPE-19细胞(以转染SW102-T-BAC的细胞及未转染细胞为对照),逆转录PCR及测序分析验证转染细胞中mE6E7及wE6E7的表达状况;观察重组病毒T-ORF75-mE6E7及T-ORF75-wE6E7对转染ARPE-19细胞的影响,通过软琼脂克隆分析mE6E7及wE6E7转化活性。结果 获得了SW102-T-ORF75-mE6E7-BAC及SW102-T-ORF75-wE6E7-BAC的克隆。逆转录PCR及测序分析验证转染细胞中mE6E7及wE6E7的表达正确。转染SW102-T-ORF75-wE6E7-BAC的细胞生长失去接触抑制,出现重叠生长现象,其形态由原来梭形变为变圆、肿胀、胞浆颗粒增多;并且在软琼脂中能够形成克隆;而转染SW102-T-ORF75-mE6E7-BAC、SW102-T-BAC及未转染细胞未出现上述细胞的特点。结论 获得了T-ORF75-mE6E7及T-ORF75-wE6E7重组病毒,并且重组病毒T-ORF75-mE6E7的转化活性已消除,为HPV58型治疗性疫苗的研究奠定了基础。     

弓形虫ROP16蛋白在人白血病细胞THP-1表达及对其细胞增殖与凋亡的影响北大核心CSCD

目的探讨弓形虫Ⅱ型(Me49)ROP16蛋白在急性单核细胞白血病细胞株THP-1中的表达及其对THP-1细胞增殖与凋亡的影响。方法构建过表达ROP16(overExp-ROP16)和空载体(overExp-NC)慢病毒,通过转染THP-1细胞,72 h后观察荧光表达情况,采用PCR与Western blot验证ROP16在THP-1细胞中的表达。免疫荧光技术检测ROP16蛋白在THP-1细胞中的定位。CCK-8与流式细胞术检测细胞增殖及凋亡。采用qRT-PCR检测细胞凋亡相关因子Bcl-2、Bax、Caspase-3 mRNA相对表达水平。Western blot检测Bax、Bcl-2、Pro-Caspase-3和Cleaved-Caspase-3蛋白的表达变化。结果构建的过表达ROP16重组慢病毒转染到THP-1细胞后,可观察强荧光信号,ROP16蛋白在THP-1细胞中成功表达。免疫荧光结果表明ROP16蛋白定位于THP-1细胞核。CCK-8与流式细胞术证实ROP16蛋白抑制THP-1细胞的增殖并促进其凋亡(均P<0.05)。与对照组相比,过表达组促凋亡因子Bax、Caspase-3 mRNA高表达(P<0.05),抗凋亡因子Bcl-2 mRNA低表达(P<0.01),Bax与Cleaved-Caspase-3蛋白水平上调(P<0.01),Bcl-2与Pro-Caspase-3蛋白水平下调(P<0.01)。结论构建的慢病毒表达质粒overExp-ROP16可在急性单核细胞白血病细胞株THP-1中表达且通过入核调节凋亡蛋白Bcl-2、Bax、Caspase-3而抑制THP-1细胞增殖,促进其凋亡。     

表达呼吸道合胞病毒融合前F蛋白的重组人5型腺病毒的构建

目的 筛选并构建成功表达A亚型人呼吸道合胞病毒(Human Respiratory Syncytial Virus, HRSV)融合前构象F蛋白的重组人5型腺病毒(Recombinant Human type5 adenovirus, rHADV-5),为制备和研发HRSV重组腺病毒载体疫苗奠定基础。方法 在真核表达载体pcDNA3.1(+)上插入具有不同突变位点的HRSV F蛋白编码序列,利用融合前F蛋白单克隆抗体AM14和D25筛选HRSV F蛋白突变体;通过同源重组将筛选出的前构象F蛋白突变体编码序列插入非复制型人5型腺病毒载体,在HEK293细胞中进行重组病毒的包装和扩增,经氯化铯密度梯度法获得纯化的重组病毒;应用夹心ELISA法和Western blot鉴定F蛋白的表达及构象。结果 通过AM14和D25单克隆抗体筛选出了2个稳定维持在融和前构象的HRSV F蛋白序列(SC-3M和SC-5M)。将SC-3M和SC-5M编码序列插入非复制型人5型腺病毒载体,对两种重组人5型腺病毒(pAd5-SC-3M和pAd5-SC-5M)和空载体(pAd5-vector)纯化,病毒滴度分别达到...     

1型糖尿病自身抗原胰岛素瘤相关蛋白2真核表达系统的构建和鉴定

目的构建能高效表达自身抗原胰岛素瘤相关蛋白2(IA2)的真核表达载体作为预防发生1型糖尿病(T1DM)的基因疫苗。方法利用基因工程技术构建重组pEGFP/IA2真核表达系统,并且转染、筛选稳定高表达IA2的RIN5F胰岛细胞株,用免疫印迹法并在荧光显微镜下鉴定其表达,利用共培养体系检测IA2刺激淋巴细胞增殖率。结果双酶切结果表明成功构建了重组pEGFP/IA2真核表达系统,免疫印迹法证实可在RIN5F细胞内高表达IA2。并且该表达的IA2可显著促进NOD小鼠淋巴细胞增殖反应(P<0.05)。结论成功构建的IA2真核表达系统对于T1DM基因疫苗预防策略和对于IA2生理功能的研究都具有重要的意义。     

人IL-2与EB病毒LMP1融合基因重组BCG的构建与表达

目的构建并鉴定人IL-2与EB病毒LMP1融合基因重组BCG(卡介苗)。方法利用RT-PCR从EB病毒阳性的B95-8细胞中获得去除致癌部分的LMP1基因,与扩增的IL-2通过overlap-PCR扩增获得融合基因。将融合基因连接到穿梭表达质粒pMV261,进行酶切、PCR及测序鉴定。重组质粒经电转导入BCG,通过Western blot鉴定目标抗原在rBCG中的表达。结果 PCR扩增获得453bp IL-2和1 225bp LMP1,利用overlap-PCR获得1 623bp的融合基因,通过电转仪将重组质粒导入BCG感受态细胞,构建的重组质粒能够在BCG中表达相对分子质量为5.7×104的目的蛋白,Western blot显示该蛋白能被兔IL-2单抗及鼠LMP1单抗识别。结论构建的rBCG能稳定表达融合蛋白,为rBCG的抗肿瘤作用和抗肿瘤疫苗的研发奠定了基础。     

呼吸道合胞病毒M2:81-95与热休克蛋白70L1融合蛋白的制备及其免疫原性

目的 构建呼吸道合胞病毒(RSV)CTL表位M2:81-95与热休克蛋白(HSP)70L1融合蛋白的重组质粒,原核表达后初步研究其免疫原性.方法 从SMMC7721细胞中克隆HSP70L1基因.PCR扩增M2:81-95基因片段,鉴定后构建质粒pET-HSP70L1-M2:81-95(pET-HSP70L1-M2).经PCR和酶切鉴定,转化E.coli BL21(DE3).用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达HSP70L1-M2:81-95(HSP70L1-M2),Ni-螫合亲合层析纯化,梯度透析复性.用该蛋白免疫10只BAlB/c小鼠,ELISA榆测IgG抗体及其亚型.噻唑蓝(MTT)法榆测CTL杀伤活性.结果 成功构建重组质粒pET-HSP70L1-M2,并在E.coli中表达重组蛋白HSP70L1-M2,该蛋白诱导RSV及表位特异性的CTL活性,还诱导蛋白抗原特异性的IgG,为4.87±0.35、IgGl为5.53±0.28、IgG2a为4.40±0.21.且IgG1/IgG2a(1.26)的比例平衡,与PBS对照组的IgG,为0.33±0.17、IgG1为0.51±0.21、IgG2a为0比较,差异有统计学意义(t=3.512,3.681,5.856;P<0.05).结论 成功构建原核表达质粒pET-HSP70L1-M2,斤表达纯化获得重组蛋白,免疫小鼠后诱导RSV及表位特异性的CTL活性和辅助性T淋巴细胞(Th)1/Th2混合型应答.