pCMV-tag2B—HBX质粒的构建和表达

目的构建乙型肝炎病毒X基因（HBX）的真核表达质粒，诱导并鉴定其表达。方法将克隆获得的HBX全长cDNA片段插入带有报告基因的真核表达质粒pCMV-tag2B，构建HBX的重组表达载体pCMV-tag2B—HBX，经DNA测序证明HBX的cDNA片段的插入方向和其全长cDNA的碱基顺序，将重组质粒转染HepG2细胞系，诱导其表达，用Western Blot进行鉴定。结果构建的重组表达载体pCMV-tag2B-HBX经双酶切表明有相应大小的DNA片断，序列分析证实为正确的有完整读码框的X基因，用脂质体转染法可将pC-MV-tag2B-HBX导入HepG2细胞并成功表达，目的蛋白经Western Blot鉴定具有生物学活性。结论成功构建了HBX真核表达质粒pC-MV-tag2B-HBX，重组质粒能表达具有生物学活性的HBX蛋白，为研究HBX的功能打下了基础。     

幽门螺杆菌glmM DNA重组质粒的构建及体外表达

目的构建幽门螺杆菌(Hp)pVAX1-glmMDNA重组质粒,体外转染SGC-7901细胞并鉴定其表达蛋白的抗原性。方法RT-PCR方法从国际标准株NCTC11637中获取glmM全长基因,克隆插入T载体。测序后经酶切、连接反应将glmM的开放读码框架定向克隆入真核表达载体pVAX1,酶切初步鉴定后测序确认。通过脂质体法将pVAX1-glmMDNA重组质粒转染SGC-7901细胞,检测其转染效率,确定转染成功后RT-PCR法检测glmM在转录水平的表达,ELISA法鉴定表达蛋白的抗原性。结果DNA测序结果显示扩增出的glmM全长基因与GenBank公布的HpglmM序列有96%的同源性。PCR、酶切和测序结果证实glmM目的基因成功克隆入真核表达载体pVAX1。重组质粒转染的细胞经RT-PCR扩增获得1.4kb片段,与目的基因大小相符。ELISA结果显示重组质粒转染细胞的超声破碎物及培养上清液中抗原的滴度比对照组高2倍以上。结论成功构建了pVAX1-glmMDNA重组质粒,其表达蛋白具有良好的抗原性,为进一步研究其抗Hp感染的效果及制备相应有效DNA疫苗奠定基础。     

C-端截短变异的HBx真核表达质粒的构建及表达

目的构建羧基端缺失30个氨基酸的HBx蛋白的真核表达质粒,并在真核细胞内稳定表达。方法提取HBV-DNA阳性血清总DNA,PCR扩增截短变异的HBx基因(HBx),克隆到真核质粒pEGFP-N3中,酶切及测序鉴定。利用脂质体将重组质粒转染HepG2细胞,通过W estern blot方法检测细胞内截短变异的HBx蛋白的表达。结果构建的重组质粒pEGFP-N3/x经酶切及测序鉴定结果正确。质粒pEGFP-N3/x转染细胞后可检测到目的蛋白。结论成功构建在真核细胞内稳定表达的重组质粒pEGFP-N3/x。     

含EGFP报告基因单顺反子HCV亚基因组复制子载体的构建和表达

目的构建含增强型绿色荧光蛋白(EGFP)报告基因的HCV复制子表达载体,并实现其在细胞中的复制表达。方法用分子生物学基因克隆技术对HCV 2a型复制子的基因进行改造,用EGFP基因替代HCV基因组中的包膜基因(E1和E2)体外构建重组单顺反子HCV亚基因组复制子真核表达质粒pcDNA-JFH1-EGFP,经限制性内切酶酶切分析和测序鉴定;脂质体介导转染人肝癌细胞系Huh-7细胞,用荧光显微镜观察EGFP表达,采用半定量RT-PCR方法检测重组复制子的HCV RNA负链,采用Western blot检测HCV NS3蛋白的复制表达,并观察IFN-α对重组质粒表达的HCV RNA复制的抑制作用。结果构建的4个重组质粒酶切分析与预期相符,HCV亚基因复制子表达载体中未发生EGFP和HCV编码区读码框架改变,转染重组载体Huh-7细胞检测到HCV负链及EGFP和HCV NS3蛋白表达。转染后48h,1 000IU/ml和2 000IU/ml IFN-α处理的细胞HCV RNA表达水平分别为未处理组的20.0%和7.6%。结论含EGFP报告基因的单顺反子HCV亚基因组复制子表达载体pcDNA-JFH1-EGFP构建成功,在Huh-7细胞中能有效复制表达,为进一步研究HCV提供了实验平台。     

丙型肝炎病毒非结构蛋白5A对干扰素α-2b诱导的信号传导和转录激活因子1磷酸化及核转移的影响

目的探讨丙型肝炎病毒（HCV）非结构蛋白5A（NS5A）对干扰素α-2b诱导的Janus激酶-信号传导和转录激活子（JAK—STAT）信号传导途径中STAT1磷酸化及核转移的影响。方法用表达HCVNS5A的质粒（pCNS5A）转染Huh7细胞，应用免疫细胞化学技术检测HCVNS5A的表达，用免疫荧光和Western blot方法检测HCVNS5A对干扰素α-2b诱导的STAT1磷酸化和核转移的影响。结果转染了pCNS5A的Huh7细胞质可见HCVNS5A蛋白的表达；以干扰素α-2b诱导30min后，STAT1磷酸化及核转移在转染了表达HCVNS5A的质粒组比转染空白载体pRC／CMV组及未转染组减少，而未转染组及转染空白载体pRC／CMV组间无明显差别。结论表达HCVNS5A的质粒pCNS5A成功转染至Huh7细胞；HCV NS5A减弱干扰素α-2b诱导的STAT1的磷酸化及核转移，提示NS5A影响干扰素α-2b的JAKSTAT信号传导途径可能是HCV干扰素抵抗的机制之一。     

丙型肝炎病毒1b基因型核心蛋白对HepG2细胞Bax与Bcl-2基因表达的影响

目的研究丙型肝炎病毒（HCV）1b基因型核心蛋白（C）对HepG2细胞B细胞淋巴瘤-2基因（Bcl-2）与Bcl-2相关X蛋白（Bax）表达的影响,以探索1b型HCV C蛋白与HepG2细胞凋亡的关系。方法利用RT-PCR扩增出HCV-1b-C基因,经双酶切后连接pcDNA3.1（-）,成功构建真核表达载体pcDNA3.1（-）/HCV-1b-C。利用脂质体转染HepG2细胞,RT-PCR及Western Blot检测其mRNA及蛋白的表达,RT-PCR及Western Blot检测转染成功后HCV-1b-C对HepG2细胞Bax与Bcl-2表达的影响,并设转染空质粒组及未处理组作对照。结果成功构建真核表达载体pcDNA3.1（-）/HCV-1b-C;瞬时转染HepG2细胞,成功表达HCV C mRNA及蛋白;转染C基因组的Bax的mRNA及蛋白相对表达量减少,与转染空质粒组及未处理组比较差异均有统计学意义（P〈0.01）;转染C基因组的Bcl-2的mRNA及蛋白相对表达量增多,与转染空质粒组及未处理组比较差异均有统计学意义（P〈0.01）。结论 1b基因型HCV C蛋白转染HepG2细胞会导致Bax表达减少及Bcl-2表达增多,降低Bax/Bcl-2比值,可能是抑制HepG2细胞凋亡的机制之一。     

人DC-SIGN基因表达质粒的构建及其表达

目的 构建含有人DC-SIGN基因的真核表达载体,并在293T细胞中表达目的 蛋白.方法 人血培养获得树突状细胞(DC),以DC的mRNA逆转录cDNA为模板,应用PCR体外扩增获得目的 DNA,用限制性内切酶Sal Ⅰ和BamH Ⅰ分别酶切VRC4409载体和PCR产物,通过连接、转化及克隆的筛选将目的 基因克隆入载体VRC4409,构建载体VRC4409-DC-SIGN,经PCR鉴定及测序分析证实,脂质体介导转染293T细胞,蛋白质印迹分析其表达DC-SIGN蛋白.结果 重组质粒经双酶切和测序鉴定证实VRC4409-DC-SIGN构建成功,DC-SIGN蛋白在293T细胞中成功表达.结论 成功构建质粒VRC4409-DC-SIGN并在293T细胞中表达目的 蛋白,为进一步研究DC-SIGN的生物学功能奠定了基础.     

丙型肝炎病毒非结构蛋白5A影响p53抑制肝癌细胞甲胎蛋白表达的分子机制

目的了解丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白5A(NS5A)对p53抑制甲胎蛋白(AFP)基因表达的影响及分子机制。方法采用质粒转染技术及微粒体酶免疫法观察p53蛋白对Huh7肝癌细胞AFP表达的抑制作用及HCV NS5A对其抑制作用的影响;蛋白印迹实验观察HCV NS5A对p53蛋白表达的影响;谷胱甘肽转移酶沉淀实验鉴定HCV NS5A与p53蛋白能否相互作用形成复合物。结果转染pRc/CMV空质粒的Huh7细胞上清液AFP浓度为(14 322±2412)ng/ml,转染pCNS5A质粒的Huh7细胞上清液的AFP 浓度为(13 843±3218)ng/ml,两组问t=1.42,P>0.05;转染pC53-NS3质粒的Huh7细胞上清液的AFP 浓度为(10 241±1326)ng/ml,与上述两组比较,t值分别为2.41及2.38,P值均<0.05;pCNS5A和pC53- NS3共转染者AFP浓度为(14 582±1238)ng/ml,与pC53-NS3单独转染组比较,t=3.12,P<0.01; pCNS5A和pC53-NS3共转染者和pC53-NS3单独转染者Huh7细胞p53蛋白表达无变化。在谷胱甘肽转移酶沉淀实验中,加入谷胱甘肽-p53融合蛋白后出现HCV NS5A蛋白条带,而仅加入谷光甘肽者则未出现此条带。结论p53蛋白能抑制Huh7细胞AFP的表达,HCV NS5A能减轻p53蛋白对AFP表达的抑制作用。HCV NS5A不影响p53蛋白的表达但能与p53蛋白结合形成复合物是使p53功能失活的分子机制。     

pcDNA3．1（＋）-SAA真核表达载体构建、转染及其对人鼻咽癌细胞CNE-2增殖的影响

目的构建peDNA3．1（＋）-血清淀粉样蛋白A（SAA）真核表达载体,观察其在人鼻咽癌细胞CNE-2中的表达及对CNE-2增殖的影响。方法以CNE-2细胞的eDNA为模板,通过PCR扩增得到SAA片段,经酶切、纯化后与peDNA3．1（＋）连接;重组质粒经酶切分析及测序鉴定后,用脂质体转染法转染人鼻咽癌细胞CNE-2,用Westernblot法检测转染前后该细胞中SAA蛋白的表达,并用MTr法检测转染重组质粒后的细胞增殖情况。结果peDNA3．1（＋）-SAA经酶切、测序鉴定完全正确,真核表达载体构建成功;转染peDNA3．1（＋）-SAA真核表达载体后CNE-2细胞中SAA蛋白表达水平明显高增高;转染pcDNA3．1（十）-SAA后CNE-2细胞增殖速度加快。结论成功构建peDNA3．1（＋）-SAA真核表达载体,其能稳定表达于人鼻咽癌细胞CNE-2并促进细胞增殖;此为进一步研究SAA的生物学功能及鼻咽癌的新型治疗方法奠定了基础。     

乙型脑炎病毒非结构4A蛋白编码基因重组子的构建及表达

目的构建流行性乙型脑炎病毒(JEV)非结构4A(NS4A)蛋白编码基因重组子并鉴定。方法以JEV SA14-14-2株Total RNA为模板,运用RT-PCR方法扩增JEV NS4A蛋白编码基因,克隆至pMD19-T Simple载体并测序。为便于分析JEV NS4A蛋白编码基因重组子在哺乳动物细胞中的表达,在JEV NS4A蛋白编码基因5’端附加FLAG序列,亚克隆至pcDNA3.1(+)载体中,构建重组子pJNS4A并作酶切及DNA测序分析;采用脂质体法将pJNS4A转染中华仓鼠卵巢(CHO)细胞,采用免疫荧光法检测转染的CHO细胞中JEV NS4A蛋白分布与表达。结果重组质粒pJNS4A经BamHⅠ/EcoRⅠ酶切释出的插入子在830bp左右,与JEV NS4A蛋白编码基因和FLAG基因序列之和(834bp)相一致。JEV NS4A蛋白编码基因重组质粒转染的CHO细胞可见绿色荧光标记,主要分布在胞膜。结论 pJNS4A构建成功,转染的CHO细胞可稳定表达JEV NS4A蛋白。     

丙型肝炎病毒核心区蛋白对 HepG2细胞周期、细胞凋亡和细胞端粒酶活性的影响

目的　研究丙型肝炎病毒核心区 (HCV C)蛋白对肝癌细胞HepG2细胞周期、细胞凋亡和细胞端粒酶活性的影响。方法　首先运用基因重组技术构建含有HCV C基因的真核表达质粒pcDNA3.1( ) ,然后利用脂质体介导将重组真核表达质粒转染HepG2 ,经G4 18筛选获得稳定转染HepG2细胞 (HCV C转染HepG2细胞 ) ,经逆转录 聚合酶链反应技术 (RT PCR)和间接免疫荧光法证实其中有HCV C蛋白表达。然后进行如下实验 :( 1)利用四甲基偶氮唑蓝比色 (MTT)法检测HCV C转染HepG2细胞、空白质粒转染HepG2细胞和未转染HepG2细胞的生长增殖率 ;经流式细胞术(FACS)检测 3组细胞的细胞周期 ;( 2 )经流式细胞术检测细胞凋亡率 ;( 3)经端粒重复扩增 酶联免疫吸附试验 (TRAP ELISA)法检测上述 3组细胞端粒酶活性表达情况。结果　 ( 1)HCV C转染HepG2细胞增殖率显著高于空白质粒转染HepG2和未转染HepG2细胞增殖率 ;HCV C转染HepG2细胞S期所占百分率高于未转染HepG2细胞S期所占百分率 ;( 2 )HCV C转染HepG2细胞凋亡率显著低于无HCV C转染细胞凋亡率 ;( 3)上述 3组细胞端粒酶活性之间差异无显著性。结论　 ( 1)HCV C蛋白具有抑制细胞凋亡的作用 ;( 2 )HCV C蛋白促进HepG2从G0 /1期进入S期 ,从而可能促进细胞生长增殖 ,抑制细胞凋亡 ;( 3)HCV     

HIV-1B亚型核心蛋白gag基因真核表达载体的构建及其在HepG2细胞中的表达

目的克隆人类免疫缺陷病毒Ⅰ型B亚型核心蛋白gag基因,构建真核表达载体,并在真核细胞中表达,为进一步制备自行设计的以λ噬菌体作为载体的HIV核酸疫苗奠定基础。方法以克隆好的HIV1B亚型U26942全基因质粒DNA作为模板,根据Genbank中gag基因的核苷酸序列设计引物,并在引物的5’端分别引入BamHⅠ及XhoⅠ酶切位点,特异性的扩增gag基因。TA克隆后经双酶切、测序等鉴定重组质粒,再经双酶切、连接构建含gag编码基因的真核表达载体,并进行酶切鉴定分析pcDNA3.1(+)/gag。在脂质体介导下转染HepG2细胞,经G418压力筛选建立稳定转染gag基因的细胞系,用RT PCR及Western印迹检测其在HepG2细胞中的表达。结果重组质粒经BamHⅠ、XhoⅠ双酶切成5.4kb与1.5kb的片断,表明表达载体pcDNA3.1(+)中插入了gag基因片断,测序结果表明编码框正确。RT PCR及Western印迹证实稳定转染gag基因的HepG2细胞系中有该基因的表达。结论成功构建了HIV1B亚型核心蛋白gag基因的真核表达载体pcDNA3.1(+)/gag,并在HepG2细胞中获得稳定表达。     

人BMP2-IRES-HIF1αmu腺病毒表达载体的构建及其在HEK293细胞中的表达

目的构建人BMP2-IRES-HIF1αmu腺病毒表达载体,并转染HEK293细胞,为下一步转染骨髓基质细胞和体内实验打下基础。方法 PCR扩增HIF1αmu片段,用BstXⅠ和XbaⅠ双酶切回收目的片段。pIRES2-EGFP用BstXⅠ和XbaⅠ进行双酶切后回收大片段。将上述回收的目的基因与载体片段连接,然后转化感受态大肠杆菌DH5α扩增;PCR扩增BMP2片段,用NheⅠ和BamHⅠ双酶切后回收目的片段。把目的基因与载体片段连接,转化感受态大肠杆菌DH5α扩增重组腺病毒表达载体,通过酶切分析、PCR和测序进行鉴定。将构建好的质粒转染HEK293细胞,检测病毒液滴度。结果构建了人BMP2-IRES-HIF1αmu腺病毒表达载体,转染HEK293细胞见绿色荧光表达。结论成功构建了人BMP2-IRES-HIF1αmu腺病毒表达载体,酶切分析及DNA测序证实质粒构建正确,质粒成功转染HEK293细胞,并见绿色荧光蛋白表达。     

弓形虫致密颗粒蛋白GRA2真核表达质粒的构建与体外表达

目的构建弓形虫致密颗粒蛋白GRA2的真核表达重组质粒。方法设计合成GRA2引物，运用PCR方法扩增其基因片段，经克隆至pMDl8-T载体后，亚克隆至真核表达质粒pcDNA3．1（-）而构建重组表达质粒pcDNA3．1-GRA2。脂质体法将构建的重组质粒转染HFF细胞，RT—PCR法检测转染细胞中GRA2的表达情况。结果PCR扩增GRA2基因序列正确，构建的重组表达质粒pcDNA3．1-GRA2经PCR、EcoRⅠ／HindⅢ双酶切和测序鉴定正确；转染GRA2基因的细胞，RT—PCR可见目的条带。结论成功获得真核表达重组质粒pcDNA3．1-GRA2，为进一步研究弓形虫疫苗的免疫保护性奠定基础。     

甲型流感病毒M2蛋白胞外功能区真核表达质粒的构建和表达分析

目的 构建流感病毒M2蛋白胞外功能区（M2e）真核表达质粒，并研究其在真核细胞中的表达。方法 根据Genbank（NCBI ISDN13425）中查得的M2e编码序列，设计并合成两条DNA单链;在两条链两端添加碱基构成酶切位点的粘性末端，退火后使之互补结合成为M2e编码序列；然后将其插入到经双酶切的真核表达载体pcDNA3．1（＋）中，构建重组真核表达质粒pcDNA3．1（＋）-M2ef经酶切和DNA测序鉴定后，转染HEK293细胞。用免疫荧光技术检测pcD—NA3．1（＋）-M2e在HEK293细胞的表达。并通过MTT检测刺激淋巴细胞增殖及M2e蛋白的分泌情况。结果 合成的寡核苷酸链经退火形成双链，插入酶切的真核表达载体后构建成pcDNA3．1（＋）-M2e。免疫荧光技术证实该质粒表达的M2e蛋白定位于细胞膜上，转染细胞的培养上清经MTT实验证实能刺激淋巴细胞增殖，表明表达的M2e蛋白也可分泌至细胞外。结论成功构建了流感病毒M2e的真核表达质粒pcDNA3．1（＋）-M2e，表达的M2e蛋白不仅存在于绳胞膜上，也可分泌到细胞外。流感病毒M2e基因真核表达质粒的构建及成功表达为流感病毒基因工程疫苗、通用疫苗和核酸疫苗的研究奠定了基础。     

HCV非结构蛋白5A对HIV长末端重复序列影响的初步探讨

目的本研究拟探讨HCV非结构蛋白5A(NS5A)对HIV长末端重复序列(long terminal repeat,LTR)影响,从而为HCV对HIV的影响提供实验依据。方法将构建的LTR启动子驱动的荧光素酶(Luc)报告基因表达质粒(pGL3-LTR-Luc)和含HCV NS5A基因的表达质粒pCNS5A共转染肝癌细胞株(Huh7细胞),采用免疫细胞化学技术、Western Blot及逆转录聚合酶链反应检测HCV NS5A蛋白及mRNA的表达;本实验分三组,将质粒pGL3-LTR-Luc(空白组)、质粒pRc/CMV+pGL3-LTR-Luc(对照组)、质粒pCNS5A+pGL3-LTR-Luc(实验组)分别转染Huh7细胞,48 h后收集细胞,采用Luc活性检测LTR的活性,以观察HCV NS5A对LTR的调控影响。所得荧光活性值以均数±标准差表示,采用Levene's方差齐性检验,多组间比较采用单因素方差分析,两两比较行LSD-t检验。结果转染pcNS5A质粒的Huh7细胞质经RT-PCR及Western Blot检测,HCV NS5A mRNA及蛋白在细胞中获得表达。方差分析结果提示LTR荧光活性在三组间有明显的差异(F=7.876,P=0.002),进一步比较各组间的差异,结果提示共转染质粒pcNS5A+pGL3-LTR-Luc组的Huh7细胞中Luc相对活性(22 476±4471)明显高于单转染pGL3-LTR-Luc组(15 887±3039,P=0.002)及共转染质粒pRc/CMV+pGL3-LTR-Luc组(16 321±4162,P=0.008),差异有统计学意义。结论表达HCV NS5A的质粒pCNS5A成功转染至Huh7细胞;HCV NS5A蛋白能激活HIV LTR,提示HCV NS5A可能为HCV促进HIV复制的分子机制之一。     

荧光蛋白标记逆转录病毒整合酶及Brd2真核表达载体的构建

目的构建绿色荧光蛋白标记的莫洛尼鼠白血病病毒(MLV)和人类免疫缺陷病毒(HIV)整合酶及红色荧光蛋白标记的Brd2的真核表达质粒,为研究整合酶与Brd2相互作用打下基础。方法以Prr88-MLV、HIV质粒pNL4-3及含有Brd2的质粒为模板,采用PCR技术扩增MLV-IN、HIV-IN、Brd2片段;利用酶切反应体系构建psectag2A-GFP-mIN、psectag2A-GFP-hIN、pDsred2-N1-Brd2质粒,0.8%琼脂糖凝胶电泳后进行测序分析;用重组质粒转染293T细胞,荧光显微镜观察目的蛋白表达情况,并进行WB鉴定。结果构建psectag2A-GFP-hIN、psectag2AGFP-mIN、pDsred2-N1-Brd2的真核表达质粒,酶切以及测序结果与预期相符。将上述质粒分别转染293T细胞,WB及荧光显微镜均检测到目的蛋白的表达。结论成功构建了绿色荧光标记的HIV、MLV整合酶真核表达质粒和红色荧光蛋白标记的Brd2真核表达质粒,尽管Brd2真核表达质粒荧光相对较弱,但这对整合酶与Brd2相互作用研究奠定了基础。     

携带融合基因穿梭质粒的构建及在人肝癌细胞中的表达

构建携带胸苷激酶(tk)与增强型绿色荧光蛋白(EGFP)融合基因穿梭质粒,并观察其在肝癌细胞系HepG2细胞中的表达。应用基因重组技术,构建EGFP与tk的融合表达穿梭质粒载体,经限制酶切鉴定和测序分析,脂质体转染将其导入HepG2中,48h后用荧光显微镜观察荧光的表达,RT-PCR法检测融合蛋白tk和EGFP的mRNA表达,四甲基偶氮唑蓝(MTT)实验检测转染融合蛋白载体后不同浓度的更昔洛韦(GCV)对HepG2细胞的细胞毒作用。酶切鉴定和测序分析证实重组质粒中插入融合目的基因片断及载体DNA大小、方向和插入位点正确,在转染此穿梭质粒的HepG2细胞中检测到绿色荧光蛋白的表达,RT-PCR检测到融合蛋白tk和EGFP的mRNA表达;GCV对转染了携带tk与EGFP融合基因穿梭质粒载体有明显的细胞毒作用。成功构建携带tk与EGFP融合基因穿梭质粒载体,转染人肝癌细胞株HepG2中tk和EGFP的独立表达没有受到影响,该载体可利用绿色荧光蛋白作为报告基因监测tk的表达并可用于肝癌的自杀基因治疗。     

HCV核心基因转染HepG2细胞后基因表达差异筛选

目的将真核表达载体pcDNA3.1(-)HCV core转染到HepG2细胞,在HepG2细胞中表达HCV核心蛋白,并筛选其中的差异表达基因。方法将构建的真核表达载体pCDNA3.1(-)HCVcore转染HepG2细胞后进行蛋白免疫印迹检测;将pcDNA3.1(-)HCVcore和pcDNA3.1(-)载体分别转染HepG2细胞后,提取mRNA并逆转录为cDNA,运用基因表达谱芯片技术分析差异表达基因。结果构建的真核表达载体经双酶切鉴定;转染HepG2细胞后HCV核心蛋白表达经蛋白免疫印迹证实;经基因表达谱芯片分析发现,其中基因表达水平显著上调和下调的分别是181个和48个。结论筛选HCV核心基因转染HepG2细胞后的糖类和脂类物质代谢相关的差异表达基因,从而为丙型肝炎病毒合并糖尿病、脂肪肝等代谢性疾病的分子生物学机制的研究提供了重要依据。     

Krüppel-like factor4慢病毒表达载体构建及其对胃癌细胞BGC-823生物学行为的影响

目的 构建Krüppel-like factor4(KLF4)过表达慢病毒载体,探讨其对胃癌细胞株BGC-823生物学行为的影响.方法 检测BGC -823中KLF4 mRNA的表达水平;用真核表达质粒pcDNA3.1IE-KLF4-EGFP,将KLF4基因连人慢病毒载体pLv-UbC-IRES2-EGFP中,构建pLv-KLF4-IRES2-EGFP重组慢病毒表达载体.将酶切和测序鉴定后的重组质粒转染至BGC-823中,观察转染情况,RT-PCR检测KLF4 mRNA.慢病毒包装后转染BGC-823细胞,Western印迹检测KLF4蛋白.结果 重组质粒经酶切和DNA测序证实目的基因插入正确;pcDNA3.1IE-KLF4-EGFP转染BGC-823细胞后KLF4 mRNA升高.慢病毒包装后转染BGC-823检测到目的蛋白KLF4.KLF4能够将细胞阻滞于G1/S,抑制其生长、促进细胞凋亡,减少细胞侵袭能力.结论 转染BGC-823后KLF4蛋白检测证实慢病毒载体成功构建,KLF4能抑制胃癌细胞的恶性转化.