基于颜色判定的环介导等温扩增检测生殖支原体的研究

目的建立一种基于颜色判定的快速、灵敏、简便的检测生殖支原体(MG)感染的环介导等温扩增(LAMP)方法。方法使用PrimerExplorer V5软件依据gap基因保守区域设计4条特异性MG等温扩增引物,通过优化体系dNTPs、MgSO_4浓度,建立一种基于羟基萘酚蓝(HNB)作为结果判读指示剂的MG等温扩增方法,进行灵敏度、特异性检测并与普通PCR比较;对30份性病门诊病例标本进行LAMP、RT-PCR和普通PCR检测,并进行比较分析。结果建立的LAMP方法对8种常见支原体以及8种泌尿生殖道常见病原菌扩增均为阴性,特异性度为100%。对于MG ATCC 33530标准菌株核酸的检测限约为10~2copies,与MG普通PCR一致,比MGRT-PCR检测限(10 copies)低一个数量级。30份临床标本使用LAMP、普通PCR和RT-PCR方法的MG阳性检出率分别为16.7%,16.7%和20.0%。结论建立的MG LAMP检测方法灵敏、特异且操作简便,可在基层推广应用。     

基于颜色判定的环介导等温扩增检测生殖支原体的研究北大核心CSCD

目的建立一种基于颜色判定的快速、灵敏、简便的检测生殖支原体(MG)感染的环介导等温扩增(LAMP)方法。方法使用PrimerExplorer V5软件依据gap基因保守区域设计4条特异性MG等温扩增引物,通过优化体系dNTPs、MgSO4浓度,建立一种基于羟基萘酚蓝(HNB)作为结果判读指示剂的MG等温扩增方法,进行灵敏度、特异性检测并与普通PCR比较;对30份性病门诊病例标本进行LAMP、RT-PCR和普通PCR检测,并进行比较分析。结果建立的LAMP方法对8种常见支原体以及8种泌尿生殖道常见病原菌扩增均为阴性,特异性度为100%。对于MG ATCC 33530标准菌株核酸的检测限约为10~2copies,与MG普通PCR一致,比MGRT-PCR检测限(10 copies)低一个数量级。30份临床标本使用LAMP、普通PCR和RT-PCR方法的MG阳性检出率分别为16.7%,16.7%和20.0%。结论建立的MG LAMP检测方法灵敏、特异且操作简便,可在基层推广应用。     

一种快速检测患者血液标本猪链球菌方法的研究

目的建立一种快速检测患者血液标本中猪链球菌的方法。方法收集患者血液标本。提取细菌金基因组DNA；根据猪链球菌6个特异基因设计引物，采用PCR技术对这些基因进行检测，并对PCR扩增阳性的基因产物进行序列分析验证，并分析该方法诊断猪链球菌病的特异性和敏感性。结果取唾液链球菌等6种链球菌进行验证，该检测方法的特异性为100％。模拟标本（细菌含量〉10^3个／ml）的敏感性为100％，血培养阳性病人标本的敏感性为100％。通过对90份血培养阴性临床标本的检测，9份PCR结果阳性，序列分析结果证实扩增片段为目的基因。结论该方法灵敏、特异、快速。可直接用于患者血液标本的猪链球菌特异性基因的检测，为猪链球菌感染的早期诊断提供实验室依据。     

发酵支原体、穿通支原体双重套式PCR检测研究

目的　应用双重套式 PCR技术同时检测发酵支原体 (Mf)和穿通支原体 (Mpe)。方法　以支原体 16 Sv RNA基因为靶基因 ,外套引物为 Mf 与 Mpe共用、内套引物则分别为 Mf 种特异和 Mpe种特异 ,建立双重套式扩增体系。结果　本双重套式 PCR不仅能分别扩增 Mf 和 Mpe的特异性 DNA,并能同时扩增 Mf 和 Mpe出现二条特征性条带 ,产物经测序证实。结论　双重套式 PCR是一种灵敏、特异和快速的 Mf 和 Mpe检测方法     

应用竞争性荧光定量聚合酶链反应检测乙型肝炎病毒DNA

目的:建立竞争性荧光定量聚合酶链反应(CFQ-PCR),并探讨CFQ-PCR在乙型肝炎病毒(HBV)临床检测中的意义.方法:根据HBV病毒adr亚型基因组序列合成一对HBV特异的引物,和一条特异的TaqMan探针;根据上述引物序列,采用分子克隆技术制备内对照DNA;再根据内对照序列合成一条内对照DNA特异的与上述TaqMan探针不同标记的TaqMan探针;将适量的内对照DNA加入到PCR反应体系中,使其与HBV靶序列共扩增.结果:在30μL CFQ-PCR反应体系中,加入约20拷贝内对照DNA能够稳定地获得共扩增曲线;经琼脂糖凝胶电泳分析,加入约100-500拷贝内对照DNA能够有效地获得共扩增产物条带信号;在210个临床HBsAg阳性血清标本的CFQ-PCR扩增中识别出8个未能有效扩增的标本,60份HBsAg阴性血清标本中识别出2个内对照未能有效扩增的标本,后经DNA纯化处理,上述全部标本的内对照均获得阳性扩增结果,其中有7个HBsAg阳性血清标本获得HBV DNA扩增阳性结果.结论:CFQ-PCR能够有效地提示临床标本HBV DNA体外扩增时由于扩增失败导致的假阴性,适合临床推广应用.     

TaqMan-LNA探针多重实时荧光定量PCR检测炭疽芽胞杆菌的研究

目的设计检测多个靶基因的炭疽多重荧光定量PCR反应系统,建立快速准确的基因诊断方法,解决蜡样芽胞菌群基因诊断交叉反应问题。方法选择炭疽杆菌PX01毒素质粒基因pagA,PX02毒素质粒基因capB,以及染色体上的前噬菌体λBa03基因PL3作为靶基因,利用在线荧光定量PCR引物设计软件设计、优化多重PCR引物以及相应的TaqMan探针序列,对探针进行LNA标记并优化荧光PCR反应体系,构建多重实时荧光定量PCR反应系统。以3对引物PCR扩增并克隆靶基因的质粒标准品,倍比稀释后进行敏感度试验,以炭疽、蜡样芽胞杆菌、苏云金杆菌、蕈状杆菌以及常见肠道致病菌进行特异度试验,利用炭疽弱毒株污染土壤及奶粉进行模拟检测。结果 TaqMan-LNA多重实时荧光定量PCR可迅速检出3个炭疽杆菌靶基因,常用的探针法荧光定量PCR反应液均适用;pagA、CapB、PL3基因克隆标准品序列正确;该方法对pagA、CapB、PL3基因的检出限分别为63、398、114copies/μl,且仅检出炭疽杆菌基因,其余4种蜡样芽胞菌扩增均阴性。土壤及奶粉样品检测均阳性,其中pagA近检出限为6.6×104/ml,PL3基因检出限为6.6×105/ml。结论 TaqMan-LNA多重实时荧光定量PCR方法具有适用性广,检测迅速,灵敏度及特异度高等特点,能够将炭疽杆菌与蜡样芽胞菌群中其他细菌相鉴别,可试用于炭疽杆菌的感染检测。     

rDNA探针杂交检测病人痰标本中结核杆菌的研究

目的 应用结核分枝杆菌特异的rDNA探针杂交检测痰标本中的结核杆菌rDNA,评价其在临床标本检测中的应用价值。方法 用引物b对结核分枝杆菌16S-23SrDNA间隔区序列进行扩增,同时加入生物素标记,制成250bp的rDNA探针。对该探针的敏感性、特异性进行了研究,并对90份结核病人,30份非结核病人痰标本的PCR产物进行了斑点杂交检测。结果 rDNA探针检测引物bPCR扩增产物的敏感性为100pg。rDNA探针与受试24种分枝杆菌和11种非分枝杆菌引物bPCR扩增产物杂交只有结核分枝杆菌、胃分枝杆菌为阳性杂交,特异性较高。而rDNA探针对90份结核病人痰标本引物b扩增产物检测的阳性率为80.2%,高于PCR扩增产物电泳检测结果 (64%)。rDNA探针与30份非结核病人痰标本杂交结果均为阴性杂交。结论 rDNA探针与引物bPCR扩增相结合能提高结核病人痰标本检测的敏感性与特异性。     

基因芯片检测7种常见腹泻病致病菌方法研究

目的 建立运用多重PCR和基因芯片技术一次检测腹泻病粪便同一标本中7种常见致病菌的方法。方法 筛选7种常见腹泻病致病菌的特异基因作为检测目的基因,并据此设计引物及探针,制备相应的寡核苷酸芯片,检测了标准菌株, 并直接检测腹泻病粪便标本64份。结果 以多重PCR扩增出7种腹泻病致病菌特异的致病基因片段,并与基因芯片相应的探针杂交。最低检测菌数为10到100cfu/ml。64份腹泻病粪便标本检测出45份致病菌。其中33份志贺菌、12份副溶血弧菌。敏感性高于粪便培养方法。结论 该基因芯片直接检测腹泻病致病菌,具有较高的敏感性和特异性,达到了高通量即高效的检测目的,具有较好的实用性。     

乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA套式-实时荧光定量聚合酶链反应的建立

目的 建立检测HBV共价闭合环状DNA(cccDNA)的套式一实时荧光定量PCR法.方法 根据HBV cccDNA与松环DNA(rcDNA)结构上的差异,设计2对跨缺口的特异引物及1条位于负链缺口下游的特异TaqMan荧光探针.根据Plasmid-SafeTM ATP-Dependent Dnasc(PSAD)对rcDNA与cccDNA作用的不同,对模板DNA进行酶切纯化,降解reDNA,再进行套式PCR扩增,先用外引物和模板进行第一轮常规PCR,再用内引物、荧光探针和第一轮PCR产物进行实时荧光定量PCR,根据阳性参照标准品,得出待检标本定量值.结果 检测阳性参照标准品.得出该方法灵敏度可达2 lg拷贝/mL.用上述方法检测34份乙型肝炎患者血清HBV DNA阳性标本,25份血清HBVcccDNA阳性,28份外周血单个核细胞HBV cccDNA阳性.27份健康对照者血清HBV DNA阴性标本,6份HBV cccDNA阳性.对5份HBV cccDNA阳性标本扩增产物进行克隆测序,无碱基缺失、突变.与HBV不同基因型序列(A～G)比较,同源性为90.6%～99.1%,其中,与B、C基因型同源性为95.3%～99.1%,验证了方法的特异度.结论 套式-实时定量PCR法可检测乙型肝炎患者血清、PBMC中的HBV CCCDNA,且具有敏感、特异性.     

基于样品检测的布鲁氏菌荧光定量PCR方法的建立

目的 本文建立一种基于样品检测的特异性好、灵敏性高的布鲁氏菌荧光定量PCR检测方法。方法 以哺乳动物beta-actin基因和外源重组质粒为内参,针对布鲁氏菌属特异性基因IS711,建立用于样品检测的布鲁氏菌荧光定量PCR方法,并验证其敏感性、特异性及稳定性,绘制标准曲线。将该方法用于哺乳动物样品检测,并与细菌分离培养检测结果比较。结果 荧光定量PCR方法对布鲁氏菌检测有良好的特异性,3对引物对阴性对照菌均无非特异性扩增;该方法用于样品检测的最低检测限为17拷贝;内外源内参同时存在条件下,布鲁氏菌荧光定量PCR的标准曲线相关系数为R²=0.997(Y=-3.12X+40.9)。将该方法直接用于181份动物样本的检测,并与分离培养结果相比,荧光定量PCR检测阳性率为11.4%,细菌分离培养检测阳性率为9.9%,且细菌分离培养阳性样品与荧光定量PCR阳性样品中编号基本一致。结论 本文建立的荧光定量PCR检测方法灵敏性高、特异性及稳定性好,可直接应用于样品的检测,检测结果受内参基因质控。     

应用巢式PCR对恶性疟原虫培养中支原体污染的检测

目的应用巢式PCR检测恶性疟原虫体外培养中的支原体污染。方法根据支原体16s和23s保守序列设计PCR引物,应用巢式PCR检测恶性疟原虫体外培养中的支原体。结果体外培养的恶性疟原虫标本16份,PCR检测支原体均阳性,经测序比对后确认为口腔支原体。已知阴性对照无扩增带。结论应用巢式PCR能敏感和特异地检出恶性疟原虫体外培养中的支原体。     

霍乱弧菌和大肠杆菌O157∶H7检测芯片的制备

目的设计和制备快速检测霍乱弧菌和大肠杆菌O157∶H7基因芯片。方法选择霍乱弧菌特异的编码外膜蛋白的ompW基因和毒素ctxA基因以及大肠杆菌O157∶H7特异的编码菌体抗原rfbE、鞭毛抗原fliC和毒素SLT1、SLT2基因,设计引物和探针,并制备检测芯片,通过两次PCR扩增,制备荧光标记的靶序列,并与芯片进行杂交,检测霍乱弧菌和大肠杆菌O157∶H7。结果所有霍乱弧菌和大肠杆菌O157:H7菌株在采用单一和多重PCR两种方法制备的荧光标记靶序列与芯片杂交,均在芯片相应探针处出现阳性信号,非霍乱弧菌和非O157:H7菌株杂交结果均为阴性。结论基因芯片可以快速检测霍乱弧菌的O157∶H7。     

贝类奥尔森派琴虫实时荧光定量PCR检测方法的建立及初步应用

目的建立一种快速、灵敏、特异的用于检测贝类奥尔森派琴虫的实时荧光定量PCR方法。方法根据基因库中奥尔森派琴虫的基因保守序列,设计合成1对引物和1条TaqMan探针,建立荧光定量PCR方法,对采自广西沿海的49份贻贝标本进行检测,并与常规PCR比较。结果建立的荧光定量PCR方法灵敏度可达20个拷贝,比常规PCR灵敏度高100倍。49份贻贝标本的阳性率为16.3%,检测的奥尔森派琴虫基因组DNA含量为2.38×10^6～9.21×10^2拷贝/μl。结论建立的荧光定量PCR方法可以用于贝类奥尔森派琴虫感染的快速检测。     

基因芯片检测肠出血性大肠埃希菌O157:H7

目的设计和制备快速、特异、灵敏的检测大肠埃希菌O157：H7基因芯片。方法选择157：H7特异的rfbE、fliC、SLT1和SLT2基因,设计引物和探针,并制备检测芯片,通过两次聚合酶链反应(PCR)扩增,制备荧光标记的靶序列,并与芯片进行杂交,检测O157：H7菌株和非O157病原体。结果O157：H7菌株在采用单一和多重PCR两种方法制备的荧光标记靶序列与芯片杂交,均在芯片相应探针处出现阳性信号,非O157杂交结果均为阴性;芯片检测灵敏度比PCR检测高。结论基因芯片可以快速、灵敏、特异地检测O157：H7,为建立快速灵敏的检测细菌病原体和鉴别诊断的自动分析系统提供了新方法。     

基因芯片检测肠出血性大肠埃希菌O157∶H7

目的设计和制备快速、特异、灵敏的检测大肠埃希菌O157∶H7基因芯片。方法选择O157∶H7特异的rfbE、fliC、SLT1和SLT2基因,设计引物和探针,并制备检测芯片,通过两次聚合酶链反应(PCR)扩增,制备荧光标记的靶序列,并与芯片进行杂交,检测O157∶H7菌株和非O157病原体。结果O157∶H7菌株在采用单一和多重PCR两种方法制备的荧光标记靶序列与芯片杂交,均在芯片相应探针处出现阳性信号,非O157杂交结果均为阴性;芯片检测灵敏度比PCR检测高。结论基因芯片可以快速、灵敏、特异地检测O157∶H7,为建立快速灵敏的检测细菌病原体和鉴别诊断的自动分析系统提供了新方法。     

中东呼吸综合征冠状病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立

目的建立一种快速、敏感、特异的实时荧光定量PCR(Real-time PCR)方法,用于中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)的检测。方法根据中东呼吸综合征冠状病毒S蛋白基因的保守序列设计并合成一对引物及一条特异性TaqMan探针。通过条件优化,以10倍系列稀释重组质粒为标准品,进行Real-time PCR扩增,绘制标准曲线,并进行重复性、准确性、特异性及敏感性检测。结果建立的Real-time PCR方法检测中东呼吸综合征冠状病毒所绘制标准曲线的相关系数0.99,灵敏度为1.00×101拷贝,高于常规PCR方法(1.00×102拷贝);用该方法检测中东呼吸综合征冠状病毒基因为阳性,其他6种对照呼吸道病原体及冠状病毒基因检测均呈阴性;批内、批间重复试验的变异系数均1%。结论建立的中东呼吸综合征冠状病毒Real-time PCR检测方法灵敏、特异、重复性好,可用于中东呼吸综合征冠状病毒感染的快速诊断和流行病学调查。     

阪崎肠杆菌实时荧光双重TaqMan PCR快速检测体系的建立

目的建立针对阪崎肠杆菌的高灵敏、高特异的实时荧光双重TaqMan聚合酶链式反应（PCR）快速检测体系。方法根据阪崎肠杆菌基因组16SrRNA～23SrRNA的内部转录间隔区（ITS）基因和外膜蛋白A（OmpA）基因的特异性序列设计引物及TaqMan探针,利用高通量实时荧光PCR检测平台探讨该检测体系的灵敏度;用50种其他肠道致病菌及院内感染中常见的致病菌评价该检测体系的特异性。结果实时荧光双重TaqMan PCR快速检测体系对阪崎肠杆菌重组质粒的检测灵敏度为1×102拷贝/反应体系;对阪崎肠杆菌基因组的检测灵敏度为4×10-1pg/反应体系;该检测体系在检测50种其他肠道致病菌及院内感染中常见的致病菌时未出现特异性扩增,整个反应在2h内完成。结论本研究建立的实时荧光双重TaqMan PCR检测体系可作为阪崎肠杆菌灵敏、特异、快速的检测方法,并同时检测阪崎肠杆菌的致病力。     

幽门螺杆菌TaqMan MGB探针双重荧光定量PCR检测方法的建立

目的建立用于幽门螺杆菌快速定量检测和分型的TaqMan MGB探针双重荧光定量PCR方法。方法采用Primer Premier 5软件分析设计引物和探针,采用双重荧光定量PCR扩增幽门螺杆菌CagA和VacA基因片段,建立循环数与拷贝数关系的标准曲线。检测临床标本中所含幽门螺杆菌的循环数,用该方法对临床胃黏膜标本进行检测并与标准曲线对比,计算所含幽门螺杆菌的拷贝数。结果建立的TaqMan MGB双重荧光定量PCR方法检测幽门螺杆菌质粒的线性范围是10~2~10~8拷贝/μl,CagA和VacA基因标准曲线的相关系数分别是0.977 8和0.990 4。29份临床胃黏膜标本的CagA和VacA基因循环数Ct值分别在29~35和30~35之间,幽门螺杆菌拷贝数分别在1.0×10~(1.39)~1.0×10~(3.87)和1.0×10~(3.06)~1.0×10~(3.91)之间,且临床标本中的幽门螺杆菌均为I型。结论建立的TaqMan MGB双重荧光定量PCR法具有敏感、精确、快速的特点,可用于幽门螺杆菌的快速定量检测与分型鉴定。     

幽门螺杆菌TaqMan MGB探针双重荧光定量PCR检测方法的建立北大核心CSCD

目的建立用于幽门螺杆菌快速定量检测和分型的TaqMan MGB探针双重荧光定量PCR方法。方法采用Primer Premier 5软件分析设计引物和探针,采用双重荧光定量PCR扩增幽门螺杆菌CagA和VacA基因片段,建立循环数与拷贝数关系的标准曲线。检测临床标本中所含幽门螺杆菌的循环数,用该方法对临床胃黏膜标本进行检测并与标准曲线对比,计算所含幽门螺杆菌的拷贝数。结果建立的TaqMan MGB双重荧光定量PCR方法检测幽门螺杆菌质粒的线性范围是10~2~10~8拷贝/μl,CagA和VacA基因标准曲线的相关系数分别是0.977 8和0.990 4。29份临床胃黏膜标本的CagA和VacA基因循环数Ct值分别在29~35和30~35之间,幽门螺杆菌拷贝数分别在1.0×10^(1.39)~1.0×10^(3.87)和1.0×10^(3.06)~1.0×10^(3.91)之间,且临床标本中的幽门螺杆菌均为I型。结论建立的TaqMan MGB双重荧光定量PCR法具有敏感、精确、快速的特点,可用于幽门螺杆菌的快速定量检测与分型鉴定。     

医院临床标本中阴沟肠杆菌遗传多样性分析及应用TaqMan荧光定量PCR方法快速检测阴沟肠杆菌的研究

目的 调查医院临床标本中阴沟肠杆菌基因群的构成比例,并建立TaqMan荧光定量PCR方法对阴沟肠杆菌进行特异、灵敏、快速检测.方法 通过hsp60基因分型分析临床标本中基因群的构成,并以外膜蛋白基因(ompⅩ)为靶基因设计引物及FAM探针,建立TaqMan荧光定量PCR方法对阴沟肠杆菌基因群检测,并评价该方法的特异性、灵敏性和稳定性.结果 237株临床标本共归为10个基因群.其中群Ⅲ,Ⅵ和Ⅷ菌株数量最多,占总菌株数的71％;群Ⅰ占11％;其他6个群总共占18％.无基因群Ⅶ,Ⅹ和Ⅻ.TaqMan荧光定量PCR方法能对阴沟肠杆菌不同基因群进行特异检测:对十个基因群和群Ⅰ的质粒标准品的检测下限分别为36拷贝/μL和21拷贝/μL,对粪便模拟标本的检测下限为104个菌落形成单位/μL;TaqMan荧光定量PCR方法对质粒标准品和粪便模拟标本检测的扩增曲线良好;结论 医院临床标本中可以检测到十个基因群,具有遗传多样性的特征.本研究建立的TaqMan荧光PCR方法特异性好、灵敏度高,能够用于阴沟肠杆菌的快速检测.