不同组织来源间充质干细胞体外成骨分化能力的比较研究

目的比较成人脂肪间充质干细胞(ASCs)、脐带间充质干细胞(UC-MSCs)和成人骨髓间充质干细胞(BMSCs)的成骨能力,选择优势干细胞种类作为应用于骨组织工程治疗骨缺损的种子细胞。方法采用含10%胎牛血清的DMEM/Ham’s F-12培养液培养3种MSCs。取3种MSCs的P3代,通过CCK8方法检测其增殖能力;通过流式细胞仪进行鉴定;通过碱性磷酸酶(ALP)和茜素红染色检测骨分化蛋白ALP的分泌和矿化钙结节的沉积,并对钙结节进行定量分析;通过实时荧光定量PCR(RT-q PCR)方法检测骨再生相关基因的表达。结果 3种P3代MSCs在3~5d之间增殖均处于对数生长期;流式鉴定3种细胞的表面标志物阳性率:CD44、CD90和CD105均高于97%,阴性率:CD14、CD34和CD45均低于1%;ALP染色结果显示3种MSCs成骨诱导9d时,细胞内均表达ALP,茜素红染色结果显示成骨诱导18d时,均呈现较好的矿化能力,BMSCs和UC-MSCs成骨诱导后形成的钙结节无显著性差异;RT-q PCR结果显示3种MSCs成骨诱导组相比较于对照组,成骨再生相关基因Osterix、ALP、I型胶原(COL1)和骨钙素(OCN)均显著性高表达;3种MSCs成骨诱导9d时,UC-MSCs实验组的COLI基因表达显著性高于BMSCs,成骨诱导18d时,ASCs实验组的Osterix基因表达显著性高于BMSCs。结论 ASCs和UC-MSCs具有一定的成骨矿化能力,有望成为骨组织工程治疗骨缺损的种子细胞。     

非接触共培养人髓核细胞诱导血管内皮细胞凋亡及抑制迁移的研究

[目的]利用人髓核细胞系(NPCs)与人微血管内皮细胞系(HMEC-1),通过非接触共培养探讨人髓核细胞对血管内皮细胞的凋亡诱导并抑制迁移的影响。[方法]利用过氧化氢诱导NPC衰老,进行细胞衰老β-半乳糖苷酶染色。将正常NPC、衰老NPC与HMEC等比例(1:1)通过Transwell培养板进行非接触共培养作为实验组,单纯HMEC培养作为对照组,培养24 h光镜下观察内皮细胞的生长情况,用流式细胞仪检测HMEC凋亡率,ELISA检测细胞培养液中TNF-α、VEGF的量。各组利用不同细胞条件诱导培养基和Transwell小室检测其纵向迁移能力。[结果]利用200μmol/L与400μmol/L过氧化氢处理NPC细胞衰老β-半乳糖苷酶染色阳性比例分别达25%和55%。共培养1d后正常NPC组HMEC凋亡率高于衰老NPC组(P0.05)。对照组细胞凋亡率均低于5%,明显小于实验组(P0.01)。ELISA检测培养液中TNF-α、VEGF,正常NPC组TNF-α高于衰老NPC组(P0.05)。VEGF正常NPC组低于衰老NPC组(P0.05)。趋化实验正常NPC条件培养基迁移膜下细胞数少于衰老NPC组(P0.05),且少于对照组(P0.01)。[结论]在非接触共培养条件下人髓核细胞可以诱导血管内皮细胞凋亡,并且抑制内皮细胞迁移,髓核细胞衰老之后诱导凋亡能力下降,抑制迁移能力减弱,进而证明随年龄增长髓核细胞的衰老引起椎间盘微环境变化可能为椎间盘退变中血管长入的诱发因素之一。     

人骨髓间充质干细胞复合两种填充材料体外生物相容性的比较

目的:对比膨体聚四氟乙烯(expanded polytetrafluoroethylene,ePTFE)与硅胶的体外生物相容性,为临床上ePTFE的广泛应用提供实验依据。方法:采用密度梯度离心法分离培养人骨髓间充质干细胞(human mesenchymal stem cells,h MSCs),取第3代细胞通过流式检测、茜素红和油红O染色进行干细胞鉴定,将h MSCs分别与ePTFE和硅胶材料直接作用或与材料浸提液复合培养,观察细胞黏附、生长及增殖情况,计算细胞黏附率,CCK-8比色法检测细胞增殖。结果:成功分离培养h MSCs,形态上呈长梭形、纺锤状、类成纤维细胞样;流式检测结果显示第3代h MSCs高表达间充质干细胞表面标志物CD44(99.5%)、CD90(95.8%),低表达造血系细胞表面标志物CD45;且茜素红和油红O染色阳性;ePTFE组细胞黏附率(92.3%)明显高于硅胶组细胞黏附率(76.8%)(P0.05);若两种材料直接作用培养后的细胞,随时间延长ePTFE组和空白对照组细胞活性逐渐增加,仍可保持正常的分裂增殖速度(P0.05),而硅胶组活细胞吸光值明显低于ePTFE组(P0.05)。结论:ePTFE体外生物相容性优于假体硅胶,较适合作为支架材料应用于组织工程的构建。     

肿瘤坏死因子-α对人髓核间充质干细胞衰老的影响

[目的]探索肿瘤坏死因子-α (tumor necrosis factor-α, TNF-α)对人髓核间充质干细胞的衰老的影响。[方法]分离培养第三代正常人髓核间充质干细胞（human nucleus pulposus mesenchymal stem cells, HNPMSCs）,分为空白对照组和TNF-α组,分别加入无血清培养基与TNF-α浓度为100 ng/ml的无血清培养基干预48 h。镜下观察细胞形态,并用细胞衰老β半乳糖苷酶试剂盒染色,对细胞衰老情况进行观察;CCK-8检测第1、3、5、7、9、11、13、15 d后的细胞增殖活性;Western Blot检测衰老相关蛋白P53、P16表达情况。[结果]镜下观察及β半乳糖苷酶染色均可见TNF-α组细胞呈衰老状态。CCK-8检测,随时间推移两组细胞CCK-8检测光密度（optimal density, OD）值均显著增加（P<0.05）。相应时间点两组间比较,第1～7d,两组间的人NPMSCs增殖活性OD值的差异无统计学意义（P>0.05）;而第9～15 d,TNF-α组的人NPMSCs的OD值均显著低于空白对照...     

酸环境对人髓核间充质干细胞生物学活性的影响

目的:观察酸环境对体外培养的成人髓核间充质干细胞(NPMSCs)生物学特征的影响,探讨椎间盘退变的可能机制。方法:用胶原酶消化法从6例脊柱侧凸矫形患者手术摘除的6个腰椎间盘(Pfirrmann椎间盘退变分级为Ⅰ级或Ⅱ级)髓核组织中分离细胞,体外培养,传代并观察细胞形态。取P2代细胞,利用流式细胞仪对分离得到的细胞表型CD34、CD45、CD73、CD90、CD105和人类白细胞抗原(HLA)-DR表达情况进行检测;用成骨、成软骨、成脂培养液诱导培养细胞,2周后分别用茜素红、甲苯胺蓝、油红O对细胞进行染色,观察其成脂、成骨、成软骨能力。按照国际干细胞治疗协会(ISCT)有关间充质干细胞(MSCs)的判定标准,对分离得到的细胞进行综合评估鉴定。在37℃、21%O2、5%CO2的细胞培养箱中用不同p H值(6.2、6.5、6.8、7.1、7.4)的DMEM10%血清培养液培养P2代细胞,1、3、5、7、9、11、13d后利用细胞增殖试剂盒(cell counting kit-8,CCK-8)检测细胞增殖活力(OD值),培养3d时借助流式细胞仪检测细胞凋亡率,不同p H值培养基培养28d时采用实时荧光定量(RT-PCR)检测P2代细胞"干性维持"基因Oct4、Nanog、Jag1、Notch1及酸离子通道家族蛋白基因ASIC1、ASIC2、ASIC3、ASIC4的m RNA表达情况。结果:P0代细胞均贴壁生长。P2代细胞免疫表型鉴定显示MSCs表面分子标记CD90、CD105、CD73表达比例分别高达96%、95%、94%以上,低表达CD45、CD34、HLA-DR(均低于4%)。茜素红染色、油红O染色及甲苯胺蓝染色分别证实分离的细胞均可向骨、脂肪及软骨细胞三系诱导分化。按照ISCT有关MSCs的判定标准,分离得到的细胞即NPMSCs。细胞代谢活性测定示P2代细胞在培养后1、3d各组间细胞OD值差异无统计学意义(P0.05);5d、7d、9d、11d、13d各组间细胞OD值差异有统计学意义(P0.05),且p H值越低细胞的OD值越小。p H值7.4组的细胞凋亡率均小于其余各组,各组间有统计学差异(P0.05)。p H值7.4组"干性维持"基因Oct4、Nanog、Jag1、Notch1及酸离子通道家族蛋白基因ASIC1、ASIC2、ASIC3、ASIC4的m RNA均明显高于p H值7.1、6.8、6.5、6.2组(P0.05)。随着培养液p H值降低,细胞的凋亡率升高,细胞干性维持基因及酸通道家族蛋白基因的m RNA表达降低。结论:低p H值的酸环境培养1、3d对成人NPMSCs增殖无明显影响,培养5d后明显抑制NPMSCs的增殖和基因表达,促进细胞凋亡,且随着p H降低作用越明显。     

siRNA转染对大鼠髓核细胞TRAIL表达和细胞行为的影响

[目的]探讨siRNA转染对大鼠髓核细胞TRAIL表达和细胞行为的影响。[方法]采用弯曲鼠尾法建立椎间盘退变模型。处死动物。取退变椎间盘组织分离培养髓核细胞。P1髓核细胞分为4组,分别为空白对照组、TRAIL-siRNA转染组(siTRAIL组)、TNF-α处理组(TNF-α组)和TNF-α处理+TRAIL-siRNA转染组(TNF-α+siTRAIL组)。采用MTT法检测P1髓核细胞增殖,流式细胞仪检测细胞凋亡,Western blot法检测髓核细胞Caspase-3的活性和表达。[结果]相较于空白对照细胞,TRAIL siRNA转染对细胞增殖、凋亡、Caspase-3的表达无明显影响(P0.05);TNF-α处理引发髓核细胞增殖显著下降(P0.05),而凋亡率显著升高(P0.05),Caspase-3的表达显著升高(P0.05)。TNF-α处理后再用TRAIL-siRNA转染可显著逆转TNF-α对细胞增殖、凋亡和Caspase-3表达的影响(P0.05)。[结论] TRAIL siRNA转染可沉默TRAIL表达,从而逆转TNF-α诱导大鼠髓核细胞增殖抑制、细胞凋亡和Caspase-3表达。     

HIV-Tat-CLIO标记对大鼠骨髓间充质干细胞生物学行为的影响

目的探讨HIV—Tat—CLIO标记对体外培养的大鼠骨髓间充质干细胞(rMSCs)生物学行为的影响。方法采用差速贴壁法分离培养rMSCs,将其分为HIV-Tat-CLIO标记组和非标记组。MTT比色测定法检测细胞增殖情况,流式细胞仪分析细胞表面标记物、细胞周期和凋亡程度的变化,免疫组织化学方法研究标记后细胞分化情况,并用Transwell实验检测细胞运动迁移能力的改变。结果HIV-Tat-CLIO标记MSCs后,A570波长的光吸收值无明显变化;细胞表面CD34、CD45和CD90分子的表达差异无统计学意义;处于S期的MSCs数量(S%)、DNA合成前期细胞所占百分比(G1%)、增殖指数PrI值(S G2M)%以及细胞凋亡情况均无显著改变(P>0.05)。结论HIV-Tat-CLIO标记对大鼠MSCs生物学行为无明显影响,标记后的干细胞可以正常增殖、分化及运动迁移。     

腰退行性病变与TRALL基因之间关系的研究

[目的]探讨腰椎间盘退行性病变与肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand, TRAIL)基因之间的相关性及临床意义。[方法]取60例腰椎间盘突出症患者(退变组)和同期60例因创伤手术患者(未退变组)髓核组织。行组织化学染色。体外实验方面,分离细胞培养后,分为4组,分别为空白对照、TRAIL siRNA转染、TNF-α处理和TNF-α处理+TRAIL-siRNA转染组。采用MTT法检测细胞增殖,流式细胞仪检测细胞凋亡,Western blot法检测髓核细胞Caspase-3的活性和表达。[结果]Tunel染色显示凋亡阳性细胞率退变组为48.92%,未退变组为5.23%;TRAIL蛋白表达阳性率退变组为49.11%,未退变组为12.25%,两组间的差异均有统计学意义(P0.05)。体外试验方面,相较于空白对照细胞,TNF-α处理细胞的增殖显著下降(P0.05),而凋亡率显著升高(P0.05),Caspase-3的表达显著升高(P0.05)。TRAIL siRNA转染对细胞增殖、凋亡、Caspase-3的表达无明显影响(P0.05),TNF-α处理后再用TRAIL-siRNA转染可显著逆转TNF-α对细胞增殖、凋亡和Caspase-3表现的影响(P0.05)。[结论]髓核TRAIL阳性表达细胞率与凋亡细胞率呈正相关,TRAIL沉默能显著逆转TNF-α诱导的髓核细胞增殖抑制、细胞凋亡及Caspase-3的表达。     

正常与退变髓核的髓核间充质干细胞代谢活性及干性基因表达的比较

【摘要】 目的：比较来源于正常与退变髓核的髓核间充质干细胞（NPMSCs）的细胞代谢活性及干性基因表达情况。方法：收集6例非退变患者髓核组织（正常组）与6例腰椎间盘突出症患者的退变髓核组织（退变组）,采用酶消化法分离细胞,应用标准间充质干细胞培养基（standard MSC culture medium）进行细胞培养并观察细胞形态。两组内各取1例分离得到的细胞进行流式细胞仪检测间充质干细胞表面蛋白分子标记CD90、CD105、CD73、CD45、CD34及人类白细胞抗原（HLA）-DR表达情况;并进行成骨、成脂及成软骨诱导分化,诱导28d后分别应用茜素红染色鉴定细胞成骨能力、油红O染色鉴定细胞成脂能力、甲苯胺蓝染色鉴定细胞成软骨分化能力,并按照国际干细胞治疗协会（ISCT）提出的间充质干细胞的判定标准,对分离得到的细胞进行综合评估鉴定。采用CCK-8检测两组P2代NPMSCs的代谢活力。提取两组每例P2代细胞总RNA,行RT-PCR检测P2代细胞“干性维持”相关基因Oct4及Nanog表达情况。结果：两组P0代细胞均贴壁生长,形态学方面两组并无明显差异。免疫表型鉴定显示正常组和退变组间充质干细胞表面分子标记CD90、CD105、CD73表达比例分别高达96％、98％、95%以上,两组均低表达造血细胞标志物CD45、CD34、HLA-DR（均低于4%）。茜素红染色、油红O染色及甲苯胺蓝染色分别证实正常组与退变组细胞均可向骨、脂肪及软骨细胞三系诱导分化。上述结果证实分离得到的细胞即NPMSCs。细胞代谢活性测定示P2代细胞在培养后5d、7d、9d、11d、13d正常组细胞活性均强于退变组,两组细胞活性有统计学差异（P<0.05）。正常组“干性维持”相关基因Oct4及Nanog表达量分别为退变组的4.63±1.17、7.36±1.19倍,正常组均明显高于退变组（P<0.05）。结论：正常与退变髓核组织内均存在NPMSCs,但正常椎间盘来源的NPMSCs具有较强的细胞代谢活性,较”强的“干性维持”基因表达。     

IL-6在猪肝细胞与骨髓间充质干细胞共培养中的作用

目的 探索IL-6在猪肝细胞与骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)体外共培养中的作用.方法 自中华实验猪髂前上棘抽取骨髓(3只),采用密度梯度离心法分离单个核细胞,贴壁传代培养至第3代;原位两步胶原酶法分离猪肝细胞后与MSCs按照2:1比例使用Millicell小室培养,检测共培养中肝细胞功能,观察IL-6、TNF-α、TGF-α的分泌水平变化.结果 肝细胞活率＞95%.共培养组肝细胞白蛋白分泌水平和尿素合成能力均显著高于单纯肝细胞组(P＜0.05).共培养组IL-6浓度显著高于对照组(P＜0.01).中和IL-6后共培养体系白蛋白、尿素合成水平明显下降(P＜0.01).结论 MSCs通过分泌IL-6改善共培养体系中肝细胞功能.     

氧浓度对人髓核间充质干细胞生物学特性的影响

目的 :分离培养髓核来源的间充质干细胞(MSCs),比较不同氧浓度下细胞的生物学特性,探讨氧浓度对椎间盘退变机制的影响。方法:用胶原酶消化法从手术摘除的4个腰椎间盘(椎间盘Pfirrmann分级为Ⅰ级或Ⅱ级)髓核组织中分离MSCs,体外培养、传代,观察记录细胞形态。取P3代细胞,用流式细胞仪对分离得到的细胞表面抗原CD90、CD73、CD105、CD44和CD31、CD34、CD45的表达情况进行检测;用成骨、成脂、成软骨培养液诱导培养细胞,分别在21d、28d、21d时用茜素红、油红O、甲苯胺蓝对细胞进行染色,观察其成骨、成脂、成软骨能力。在三气培养箱的低氧条件(2%O_2、5%CO_2、37℃)和常规细胞培养箱的常氧条件(20%O_2、5%CO_2、37℃)下分别培养P3代细胞。通过细胞计数统计培养1d、2d、3d、4d、5d、6d、7d、8d时的细胞数量,比较不同氧浓度下细胞的生长曲线;使用Architect c8000自动生化检测仪检测培养1d、2d、3d、4d、5d时培养基的pH值和渗透压。实时荧光定量(q RT-PCR)检测不同氧浓度培养下细胞的干性基因POU家族类别5同位序列1(POU5F1,OCT4)、NANOG同位序列(NANOG)、性别决定区Y盒2(SOX2)及扩增基因细胞周期蛋白D1(Cyclin D1,CCND1)、MYC(c-Myc)、低氧诱导基因低氧诱导因子2α(HIF2α,EPAS1)、能量基因三磷酸腺苷合成酶(ATP5A1)、线粒体相关基因细胞色素c氧化酶Ⅳ亚基1型同工酶(COX4I1)、线粒体转录因子A(TFAM)、线粒体编码细胞色素c氧化酶Ⅰ(MT-CO1)、MT-CO_2的mRNA表达情况。结果:分离培养的细胞呈典型的单层贴壁生长,纺锤样;P3代细胞免疫表型鉴定显示MSCs表面分子标记高表达CD90(80.4%)、CD73(99.9%)、CD105(99.8%)、CD44(95.9%),低表达CD31(5.3%)、CD34(4.4%)、CD45(6.8%);茜素红、油红O染色、甲苯胺蓝染色证实细胞可向骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞分化。根据国际干细胞治疗协会(ISCT)有关MSCs的判定标准,分离培养的细胞为髓核MSCs(NPMSCs)。低氧环境下培养的细胞形态更小,更接近原始MSCs,细胞增殖更快,低氧时倍增期为31.22±1.98h,常氧时倍增期为39.56±2.02h,差异有统计学意义(P0.05)。不同氧浓度各时间点培养基的pH值、渗透压差异无统计学意义(P0.05),且皆在适合细胞生存的范围。低氧培养下POU5F1(OCT4)、NANOG、SOX2、CCND1、MYC(c-Myc)、EPAS1、ATP5A1较常氧培养时显著性升高(P0.05);COX4I1、TFAM、MT-CO1、MT-CO_2较常氧培养时显著性降低(P0.05)。结论 :低氧条件下培养有利于人NPMSCs的细胞形态、干性基因、增殖能力等生物学活性的维持。     

骨碎补促进骨髓间充质干细胞增殖及成骨分化

[目的]研究骨碎补对骨髓间充质干细胞(BMSCs)增殖与成骨分化的影响。[方法]40只SD大鼠随机分为4组,包括空白对照组和3个处理组,空白对照组给予生理盐水,而3个处理组分别给予高、中、低浓度骨碎补水煎液连续灌胃3个月。给药期满后,取各组动物骨髓体外培养,全骨髓贴壁法纯化培养BMSCs,第三代BMSCs作为检测细胞。CCK-8法分析不同浓度的骨碎补水煎液对BMSCs增殖的作用。采用ALP试剂盒测定BMSCs成骨诱导后ALP活性,茜素红染色观察钙化结节情况,并测定成骨细胞相关RUNX2和Osterix及OCN mRNA的表达情况,以评估骨碎补对BMSCs成骨分化的影响。[结果]CD90和CD45细胞免疫荧光显色证实所培养细胞为BMSCs。CCK-8法检测显示骨碎补能够促进BMSCs增殖,并呈剂量依赖性,3个处理组与空白对照组间的差异具有统计学意义(P0.05)。在成骨诱导培养基中培养后,3个处理组间培养液上清ALP活性呈剂量依赖性增高,并伴有培养皿茜素红染色观察钙化结节的相应增多,与空白对照组间的差异具有统计学意义(P0.05)。此外,相应的RUNX2和Osterix及OCN的表达也呈骨碎补剂量依赖性增加,3个处理组与空白对照组间的差异具有统计学意义(P0.05)。[结论]骨碎补能够促进大鼠骨髓间充质干细胞的增殖和成骨分化。     

人骨髓间充质干细胞体外分离、培养及鉴定的实验研究

目的观察体外培养人骨髓间充质干细胞(MSCs)的形态和生长规律,以证实人MSCs是一种理想的种子细胞,以及为进一步深入研究提供基础理论依据。方法对人骨髓淋巴细胞分离液采用密度梯度离心法和差异贴壁法进行分离、提纯MSCs。观察原代、传代细胞的结构、生长情况,对第2代MSCs表面抗原进行测定。结果MSCs原代培养第14～16d时细胞融合成单层,传代细胞保持原代细胞的形态特征。超微结构显示:第2代MSCs细胞核形态不规则,部分核可见多个核仁,胞质内细胞器形态分化幼稚。细胞的生长曲线显示:传代第3d起呈对数生长,第5d达到高峰,10代后无明显克隆出现。P1代克隆形成率为25.83%±2.93%,P5代为14.67%±1.63%,P10代为4.67%±0.52%。MSCs的表型特征显示细胞均一性较好,MSCs表达CD29,CD44,但不表达CD34,CD45。结论用淋巴细胞分离液密度梯度离心和贴壁筛选法,可分离、纯化人MSCs,方法简单、经济,易应用;MSCs增殖能力强,可在体外大量扩增,能满足组织工程的要求,是理想的种子细胞之一。     

骨折后外周血间充质干细胞浓度变化的实验研究

[目的]观察骨折后不同时间点外周血间充质干细胞(MSCs)浓度变化,并比较其与骨髓间充质干细胞生物学特性的异同.[方法]根据不同处理条件将SD大鼠分为:对照组和骨折组(骨折后1、3、7d共3组),每组20只.分别于骨折后1、3、7d抽取外周血,密度梯度离心法分离培养外周血MSCs,计数成纤维细胞集落形成单位(CFU-Fs)数.流式细胞仪检测细胞表面标记(CD44、CD90、CD34、CD45).成骨、成脂诱导,碱性磷酸酶、茜素红和油红染色检测其分化特性.[结果]原代外周血MSCs呈集落生长,骨折组集落数明显多于对照组,其中以骨折后3d组形成的集落数最多,具有显著差异(27.25±11.52 CFU-Fs/cuhure vs 2.80±3.96 CFU-Fs/culture,P＜0.01).外周血MSCs高表达CD44、CD90,低表达CD34、CD45,不同的是CD34小部分呈阳性(＜20％).与对照组骨髓MSCs的诱导结果相同,外周血MSCs成骨诱导后28 d出现钙结节,茜素红染色阳性;成脂诱导后21 d有大量脂滴出现,油红染色阳性.[结论]外周血体外密度梯度离心法分离培养的细胞具有多潜能分化的MSCs表面标记且可以向成骨、成脂分化.骨折后外周循环中MSCs数量明显增多,呈一定的时序性变化,可能参与骨折修复.     

人骨髓间充质干细胞分离培养及体外诱导分化为成骨细胞

[目的]建立人骨髓来源的间充质干细胞( hBMSCs)分离、培养及传代的方法,观察成hBMSCs体外成骨潜能.[方法]采用全骨髓贴壁筛选法分离培养hBMSCs,流式细胞仪检测细胞表型;所得细胞第3代用含100 nmol/L地塞米松、5mmol/Lβ -甘油磷酸钠,50 μg/ml抗坏血酸的条件培养基进行骨诱导,茜素红染色鉴定.[结果]分离培养的细胞流式细胞术检测显示CD44、CD105阳性,而CD34、CD45阴性,符合MSCs特征;hBMSCs经骨诱导后可形成钙结节,茜素红染色显示阳性.[结论]全骨髓贴壁筛选法可分离获得高纯度的hBMSCs,其在体外具有成骨潜能.     

人胎盘间充质干细胞的体外分离纯化及成骨能力的研究

目的通过体外分离纯化人足月胎盘间充质干细胞(hPMSCs),以研究其生物学特征及成骨能力。方法 采用胶原酶消化贴壁培养及人淋巴细胞分离液从人足月胎盘中分离纯化间充质干细胞(MSCs);流式细胞仪检测其细胞表面标志物的表达并运用MTT测定细胞生长曲线;电镜观察细胞超微结构;地塞米松、维生素C与β-甘油磷酸钠联合诱导其向成骨细胞分化,碱性磷酸酶及茜素红染色检测其碱性磷酸酶活性及钙结节。结果培养14天后可见大量贴壁细胞呈成纤维状生长,传代后增殖能力显著增强;强表达CD44,CD29,不表达CD34,CD45;经诱导后具有向成骨细胞分化的潜能,茜素红及碱性磷酸酶染色结果阳性。结论 人足月胎盘中同样含有MSCs,与其他来源的MSCs生物学特性相似,并且具有向中胚层细胞分化的能力,可作为组织工程及细胞替代疗法新的干细胞来源。     

人脂肪干细胞的体外培养鉴定及分化特性

目的：在体外从脂肪块中分离出脂肪干细胞（adipose derived stem/stromal cells,ASCs）,对其进行形态观察、干细胞鉴定、增殖和分化能力检测。方法：将腹部取皮术的皮下脂肪利用胶原酶消化法,进行体外分离培养,取第3代的细胞进行细胞爬片HE染色、流式鉴定、MTT、细胞周期检测等,利用成脂和成骨培养液诱导,油红O和茜素红染色鉴定诱导结果。结果：原代培养第1次换液时细胞多呈多角形和短梭形,第3代ASCs细胞爬片HE染色显示形态多为长梭形,呈漩涡状生长;流式鉴定显示：CD29＋,CD31-,CD34-,CD44＋,CD45-,CD49＋,CD106-,CD133-;MTT显示ASCs生长增殖活性强;细胞周期检测结果显示：G1=86.8%,G2=8.77%;成脂诱导后油红O染色阳性,对照组为阴性;成骨诱导后茜素红染色阳性,对照组为阴性。结论：人ASCs具有贴壁生长、多向分化以及干细胞表型等特征,且生长增殖活性强,是一种很有应用前景的间充质干细胞。     

诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为唾液腺腺泡样细胞的实验研究

目的:探讨在共培养系统下大鼠骨髓间充质干细胞分化为唾液腺腺泡样细胞的实验.方法:以纯化1代SD大鼠颌下腺腺泡细胞和3代骨髓间充质干细胞作为共培养实验对象.实验分组:含唾液腺培养液的共培养组;含10%FBS、DMEM/F12的共培养组;含唾液腺培养液的非共培养组;含10%FBS、DMEM/F12的非共培养组.培养1个月经α-淀粉酶(α-amylase)免疫组化染色各组的MSCs,计算阳性细胞数得出MSCs的转化率,并且通过光镜和电镜鉴定细胞形态变化.结果:各组诱导的MSCs经α-amylase染色,共培养组阳性细胞数较非共培养组多(P＜0.05),且诱导成功的细胞在镜下形态类似于唾液腺腺泡细胞.结论:在共培养条件下成功实现了MSCs向 SGCs的形态学转化,唾液腺专用培养液能够提高SGCs的诱导效率.     

脐血间充质干细胞的分离培养鉴定及诱导分化研究

目的：分离培养人脐血间充质干细胞（human umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells,hUCB-MSC）,体外观察其生长特性,并在特定条件下诱导分化,探讨其成脂成骨分化能力.方法：采用沉降法和密度梯度离心结合贴壁培养法自脐血中分离间充质干细胞,倒置显微镜下观察其形态及生长情况;流式细胞仪分析细胞周期并检测细胞表面标志物;用茜素红染色和油红0染色分别鉴定其成骨成脂分化能力.结果：纯化的hUCB-MSC贴壁生长,呈均一梭形,具有较强的增值能力,流式细胞仪分析P3代hUCB-MSC稳定表达间充质干细胞表面抗原标志CD73,CD105和CD90等,不表达造血标志CD34和CD45;成骨诱导后3周后细胞茜素红染色阳性;成脂诱导3周后细胞油红0染色阳性.结论：本实验分离的hUCB-MSC具有较强的增殖能力,表达间充质干细胞的表面标记,具有成骨成脂分化潜能.