粉尘螨变应原第3组分基因克隆及序列多态性分析

目的获得粉尘螨变应原第3组分(Der f 3)的编码基因并了解其序列多态性。方法根据GenBank已公布的Der f 3核酸序列设计引物,用RT-PCR扩增获得其编码基因,插入pMD19-T载体,进行序列测定和多态性分析。结果获得粉尘螨变应原Der f 3编码基因为780bp。5株Der f 3基因cDNA克隆的核苷酸序列与参考序列(GenBankNo.AY 283291,GenBank No.D63858,GenBank No.EU312162,GenBank No.EU312163)相比,有19处cDNA序列发生突变,但有7处突变至少在3个cDNA克隆中序列一致;推导出氨基酸序列后进行比对,有11处氨基酸序列发生变化,有4处与上述7个位点相一致。结论获得了粉尘螨变应原Der f 3编码基因且证明其序列具有多态性,为进一步开展相关研究奠定了基础。     

粉尘螨变应原第16组分基因克隆及表达

目的获得粉尘螨变应原第16组分(Der f 16)编码基因并构建其原核表达体系。方法提取粉尘螨总RNA,根据GenBank(AF465625)设计并合成引物,经RT-PCR合成Der f 16全长基因,克隆至pCold TF DNA载体,热转化至E.coli JM109;将测序正确的pCold TF-Der f 16质粒转化BL21(DE3),IPTG诱导表达,并用SDS-PAGE验证产物。结果 RT-PCR扩增获得目的基因Der f 16,全长1 443bp,与参考序列同源性99.72%。将构建的pCold TF-Derf 16质粒转化宿主菌E.coli BL21后进行诱导,SDS-PAGE电泳显示其全细胞、上清及沉淀物均有蛋白表达,且上清表达量高于沉淀物。生物信息学分析显示该重组蛋白由480个氨基酸组成,分子质量单位为55.1315ku,二级结构由(-螺旋(35.21%)、延伸主链(20.83%)和无规卷曲(43.96%)组成。该变应原含有4个凝溶胶蛋白位点。结论粉尘螨变应原第16组分原核表达获得成功,为进一步规模生产该变应原并应用于临床诊治奠定了基础。     

屋尘螨和粉尘螨主要变应原的序列多态性分析

目的 探讨不同地域间屋尘螨和粉尘螨主要变应原变异体的差异。方法 分别提取中国华南地区培养的粉尘螨和欧洲商业化培养的屋尘螨和粉尘螨的螨体、螨卵和全螨培养物总RNA,采用RT-PCR技术扩增第1组变应原的包含前导肽段、酶原肽段和成熟肽段,以及第2组变应原的包含前导肽段和成熟肽段的目的片段,根据国际标准参照物进行序列比较。 结果 欧洲商业化的屋尘螨Der p 1主要变异体是Der p 1.0105,除了第124V、50Y和19M位氨基酸有频繁的置换外,其余为散在的置换,出现8种新的变异体;Der p 2主要变异体是Der p 2.0104,置换集中在第40V、4T7、111M和114D位,出现6种新的变异体。中国华南地区的粉尘螨Der f 1变异体很少,出现3种新的变异体;与欧洲商业化的粉尘螨相比,中国华南地区有不同的Der f 2变异体,出现6种新的变异体。来自螨体、螨卵和全螨培养物的各主要变应原变异体无明显差异。 结论 不同地域间尘螨的主要变异体不同。     

重组粉尘螨变应原第2组分的研究概况

尘螨是最常见的室内变应原来源之一,约80％以上尘螨过敏性疾病患者血清螨特异性IgE可与尘螨变应原第2组分结合.粉尘螨变应原第2组分Der f 2为螨体的组织成分,被认为是诱导哮喘与变态反应性疾病的最重要变应原之一.近年来,变态反应性疾病的发病率呈现逐年增高的趋势,而重组变应原在过敏性疾病诊断和治疗中具有独特的优势和前景,故正日益成为此领域中研究的热点之一.该文就Der f2的生物学特征、重组变应原的制备、免疫学效果及其在特异性免疫诊治中的应用前景予以综述.     

粉尘螨变应原Der f 8全长基因克隆及表达

目的获得粉尘螨(Dermatophagoides farinae)变应原Der f 8全长基因并构建其原核表达质粒。方法参考Gen Bank登录号为AY283295的Der f 8部分序列设计并合成引物。以粉尘螨总RNA为模板,RT-PCR扩增获得Der f 8部分片段。采用5′cDNA末端快速扩增技术(rapid amplification of cDNA ends,RACE)获得Der f 8全长序列,连接至pMD19-T载体,热转化至大肠埃希菌(Escherichia coli),挑取阳性菌落,抽提质粒后测序。根据Der f 8全长序列设计并合成引物,以粉尘螨总RNA为模板进行RT-PCR扩增,产物回收后连接pCold TF载体,热转化至E.coli,涂板过夜培养后,挑取阳性菌落,抽提质粒后测序。将pCold TF-Der f 8质粒转化至E.coli BL21,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导表达,采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析表达产物。采用生物信息学软件预测Der f 8的理化特性、结构和功能,并构建系统进化树。结果以Der f 8部分序列设计的引物行RT-PCR扩增获得Der f 8部分片段,长度为600 bp;5′RACE获得Der f 8剩余序列,长度为300 bp;以全长基因序列设计的引物进行RT-PCR扩增获得了Der f 8基因CDS区,长度为696 bp,测序均正确。SDSPAGE结果显示,目的蛋白为可溶性表达,相对分子质量(M_r)为81 000,与预期大小一致。序列经生物信息学分析结果显示,Der f 8全长序列与参考序列(Gen Bank登录号为AY283295)同源性为98.49%,预测其编码的疏水性蛋白具有谷胱甘肽S转移酶活性,二级结构包括α-螺旋(45.45%)、延伸主链(11.26%)和无规卷曲(43.29%)。系统进化树结果显示,粉尘螨与户尘螨(Dermatophagoides pteronyssinus)聚成一簇。结论获得了Der f 8全长基因及其原核表达质粒。     

华南地区粉尘螨主要变应原Derf2的cDNA克隆及序列分析

目的克隆并分析华南地区粉尘螨主要变应原Derf2的cDNA片段。方法广州地区收集、鉴定、培养的粉尘螨,提取总RNA,RT-PCR扩增其Derf2片段,连接入T载体,测序和分析。结果Derf2片段长度为558bp,与GenBank公布的Derf2(D10448)的核酸序列比较,在62个核苷酸处插入了87个核苷酸,插入点前后的核酸序列没有差异,按原读码框进行读码显示插入了29个氨基酸,插入点前后的氨基酸序列没有改变。结论获得华南地区粉尘螨的Derf2cDNA片段,和已公布的序列相比,有较大差异。     

粉尘螨Ⅰ类变应原基因的多态性分析及表达蛋白的特性鉴定

目的克隆表达我国深圳地区粉尘螨I类变应原Der f 1基因,并进行该基因的多态性分析和鉴定该纯化蛋白的变应原性,为研究具有我国区域特色的粉尘螨变应原奠定基础。方法从深圳地区挑取经形态鉴定的活粉尘螨,提取总RNA,RT-PCR扩增Der f 1基因,克隆到T载体测序确认。通过计算机软件进行该基因的多态性分析。将该目的基因克隆到pET-His表达载体上得到重组质粒pET-Der f 1。工程菌经IPTG诱导培养,表达Der f 1目的蛋白。重组Der f 1蛋白通过6 His-tag蛋白纯化系统进行分离、纯化,并进行Western-Blot检测纯化的Der f 1蛋白与粉尘螨过敏病人血清中IgE的反应性,以鉴定重组Der f 1的变应原性。结果以粉尘螨总RNA为模板,经RT-PCR从深圳地区克隆了4株Der f 1基因。该基因与GenBank公布的Der f 1(No.AB034946.1)比较发现核苷酸的同源性在99.48%-100%之间,理论推导的氨基酸序列同源性在99.69%-100%之间。工程菌经IPTG诱导后高效表达的Der f 1重组蛋白,并主要以包涵体形式存在。Western-Blot试验证实该4株Der f 1基因表达的重组蛋白都具有变应原性。结论本研究克隆了4株深圳地区粉尘螨I类过敏原基因并实现了原核表达,为进一步开展Der f 1蛋白研究和重组变应原免疫治疗疫苗研究奠定基础。     

上海粉尘螨变应原及特异性免疫治疗(英文）

我国螨性变态反应的研究开始于1970年代上海第一医学院（现为复旦大学上海医学院）。上海当地的粉尘螨螨种制备的变应原SMU-Df,其过敏活性与国外同种比较,超过许多倍属于最高的,包括美国食品药品管理局参考品、弗吉尼亚大学标准品、丹麦哥本哈根变态反应研究所标准质量品等。SMU-Df 经凝胶层析所显示的蛋白峰曲线型与粉尘螨代谢培养基者基本相似,其变应原性也相仿。过敏病例可用皮肤点刺试验、鼻腔激发试验和血清IgE水平测定方法诊断,80%左右的过敏患者呈阳性反应。粉尘螨注射液是我国第一种由卫生主管部门批准生产的商品变应原,用传统的皮下注射免疫治疗,通过季节性脱敏,大多数患者可减轻过敏症状,具有极好的疗效。尘螨特异性免疫治疗具有远期疗效而无严重不良反应。对于粉尘螨粗抗原的改良处方和不同给药途径进行过研究,尤其舌下含服粉尘螨滴剂制备和临床应用从1992年与国外同步开始,对于儿童尤其适用而无年龄限制,疗效极好。螨苗冲击特异性免疫疗法具有快速改善过敏症状且有远期疗效。粉尘螨变应原具有诱导人体免疫调节作用,不论过敏患者或健康人群都产生免疫应答。     

粉尘螨6类变应原（Der f6）的克隆表达、纯化及免疫学特性鉴定

目的 构建粉尘螨6类变应原（Dermatophagoides farinae，Der f6）基因的高效原核表达载体，并进行表达、纯化及生物学功能分析。 方法 根据Der f6基因已知序列，设计1对引物，通过对纯培养的粉尘螨提取总RNA，采用RT-PCR方法扩增出Der f6基因片段，PCR产物克隆入pMD18-T载体，转化大肠埃希菌（E.coli Top10），经PCR和酶切鉴定并测序。将上述所得阳性克隆菌株扩大培养，碱裂解法提取质粒，所得重组质粒pMD18-T-Der f6和空质粒pET-24a同时用限制性内切酶EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切，经纯化后连接并转化至E.coli Top10。构建的重组质粒pET24a-Der f6经PCR、酶切和测序鉴定后，再转化至E.coli BL21（DE3）， 异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达。用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和蛋白质印迹法（Western blotting）鉴定其表达效果，用Ni+离子亲和层析柱纯化重组质粒pET24a-Der f6表达产生的组氨酸重组蛋白。 结果 构建了重组质粒pMD18-T-Der f6和pET24a-Der f6。SDS-PAGE 结果表明Der f6基因在E.coli Bl21(DE3）中获得良好的表达，所得重组蛋白相对分子质量(Mr) 为31 000, 与理论值一致, 经亲和层析纯化后，SDS-PAGE 结果显示单一条带。该蛋白以尘螨过敏患者血清进行Western blotting, 结果表明具有良好的IgE结合活性。 结论 克隆、表达并纯化了具有良好尘螨致敏患者IgE结合活性的Der f6。     

重组粉尘螨Ⅱ类变应原的原核表达及纯化

目的表达并纯化粉尘螨2类变应原Der f 2蛋白,检测其变应原性。方法用1mmol/L的IPTG诱导含重组质粒pET30a-Der f2的大肠埃希菌BL21(DE3),SDS-PAGE电泳检测并纯化目的蛋白,ELISA检测其与尘螨哮喘患者血清IgE的结合活性。结果 SDS-PAGE电泳检测重组质粒pET30a-Der f 2表达产物,其分子质量单位为15ku,与预期大小相符。ELISA检测纯化的Der f 2蛋白可与尘螨哮喘患者血清IgE反应。结论成功获得并纯化了Der f2重组蛋白,该蛋白具有变应原性,为进行尘螨过敏性疾病的变应原特异性免疫治疗的动物实验奠定了物质基础。     

粉尘螨Ⅰ类变应原的cDNA克隆测序及亚克隆

目的　获得粉尘螨I类变应原(Derf1)cDNA克隆及亚克隆,并进行测序。　方法　设计合成引物,从粉尘螨体内提取RNA,经逆转录聚合酶链反应(RTPCR)获得cDNA,PCR扩增目的片段经纯化回收后克隆至pMD18T,转化大肠埃希菌(E.coli)JM109,经PCR初筛挑选阳性克隆并测序,将PCR筛检阳性重组子及pET32a(+)表达载体分别用BamHⅠ和SacⅠ双酶切,连接转化至E.coli感受态细胞JM10 9中过夜培养,挑选菌落进行酶切鉴定。　结果　从粉尘螨基因组RNA中扩增出Derf1基因,获得pET32a(+)Derf1亚克隆,酶切产物的大小与预期相符。　结论　对粉尘螨Derf1基因进行体外扩增并获得pET32a(+)Derf1亚克隆。     

粉尘螨Der f4变应原的提纯及其淀粉酶活性分析

采用上海医科大学医学螨类研究室培养的粉尘螨提纯粉尘螨４类变应原，并对其作淀粉活性分析。     

刚地弓形虫RH株GRA6分子基因克隆与序列分析

目的 克隆刚地弓形虫RH株致密颗粒抗原（Dense granule antigen,GRA6)分子基因，为研究使用重组的GRA6分子作为抗原进行弓形虫病诊断奠定基础。方法 根据已知的GRA6序列合成一对引物，抽提弓形虫速殖子mRNA，以速殖子mRNA为模板，通过反转录PCR（RT-PCR）扩增出GRA6的cDNA条带，目的基因DNA条带被克隆到质粒pUC19中形成重组质粒，对重组质粒DNA进行纯化，并对目的基因片段进行核苷酸序列分析，结果 通过RT-PCR从mRNA中扩增出一条分子量约700bp的DNA条带，核苷酸序列分析表明，GRA6分子基因的开放的阅读框全长为693bp，编码230个氨基酸分子，与已报道的RH株GRA6分子具有100%的同源性。结论 本研究获得了刚地弓形虫RH株的GRA6分子基因，为今后应用此分子作为抗原诊断弓形虫病奠定了基础。     

刚地弓形虫RH株GRA6分子基因克隆与序列分析

目的　克隆刚地弓形虫 RH株致密颗粒抗原 (Dense granule antigen,GRA6 )分子基因 ,为研究使用重组的GRA6分子作为抗原进行弓形虫病诊断奠定基础。　方法　根据己知的 GRA6序列合成一对引物 ,抽提弓形虫速殖子m RNA,以速殖子 m RNA为模板 ,通过反转录 PCR(RT- PCR)扩增出 GRA6的 c DNA条带。目的基因 DNA条带被克隆到质粒 p UC19中形成重组质粒。对重组质粒 DNA进行纯化 ,并对目的基因片段进行核苷酸序列分析。　结果　通过RT- PCR从 m RNA中扩增出一条分子量约 70 0 bp的 DNA条带。核苷酸序列分析表明 ,GRA6分子基因的开放的阅读框全长为 6 93bp,编码 2 30个氨基酸分子 ,与已报道的 RH株 GRA6分子具有 10 0 %的同源性。　结论　本研究获得了刚地弓形虫 RH株的 GRA6分子基因 ,为今后应用此分子作为抗原诊断弓形虫病奠定了基础     

粉尘螨3类变应原的T细胞表位预测及鉴定

目的 目的 预测并鉴定粉尘螨3类变应原 （Der f 3） 的T细胞表位。方法 方法 运用生物信息学分析软件预测Der f 3的T 细胞抗原表位, 并人工合成所预测的T细胞表位肽。采用改良MTT法, 用预测表位肽刺激致敏鼠脾淋巴细胞进行脾淋巴 细胞增殖试验; 酶联免疫吸附试验检测脾细胞培养上清液中白细胞介素?2 （IL?2）、 γ干扰素 （IFN?γ）、 IL?4及IL?5水平。结 结 果 果 成功预测了Der f 3的5个T细胞表位肽, 通过脾淋巴细胞增殖试验, 其中3个表位肽序列可促进脾淋巴细胞增殖并 刺激细胞因子IL?2和IFN?γ的分泌, 抑制细胞因子IL?4和IL?5的分泌。其序列分别为37 GDCPYQISLQSSSHFCGG54 、 98 IY? QHENYDSMTIDNDVALIKLKTPMT123 和164 SELQRVDIDVVSREQCDQLYS184 。结论 结论 初步鉴定了Der f 3变应原中3个T细 胞表位序列, 为后续过敏性哮喘的诊断和特异性免疫治疗奠定基础。     

粉尘螨3类变应原的B细胞线性表位预测及鉴定

目的 目的 预测并鉴定粉尘螨3类变应原 （Der f 3） 中的B细胞线性表位。方法 方法 运用生物信息学技术, 从抗原性、 表面易接近性、 柔韧性、 亲水性、 β转角等5个方面在线预测Der f 3的B细胞线性抗原表位。同时, 采用人工合成法合成相应B细胞表位肽分别与由12份螨性过敏性哮喘患者血清组成的3个血清池共同作用, 明确其中的强阳性表位肽序列。结果 结果成功预测了Der f 3中的8个B细胞表位肽。其中, 在过敏性患者血清与变应原特异性IgE结合试验中确认了33KAKAG?DCP40、 86HASGGEKIQVAEIYQHENYDSMTID110、 118LKTPMTLDQTNAKPVPLPPQGSDVKVG144、 199DVANGGVDSCQGDSGGPV?VD218和156QEGSYSLP1635个强阳性表位肽序列。结论 结论 成功确认了Der f 3变应原中5个B细胞线性表位序列, 为尘螨过敏性哮喘的诊断和治疗奠定基础。     

中国人磷脂转运蛋白基因克隆及序列分析

为探讨中国人磷脂转运蛋白的基因结构、组成及特点 ,克隆了中国人磷脂转运蛋白基因。首先提取人胎肝组织总RNA ,以此为模板利用逆转录—聚合酶链反应法成功钓取了磷脂转运蛋白成熟肽基因片段 ,DNA序列分析所得基因片段由 14 2 8个碱基组成     

粉尘螨聚泛素样蛋白基因克隆、表达与生物信息学分析

目的克隆、表达粉尘螨聚泛素样蛋白(polyubiquitin, poly-u)的编码基因全长并制备表达质粒,对表达产物进行生物学预测和分析。方法根据转录组测序及其功能注释结果,以粉尘螨Total RNA为模板,RT-PCR和RACE技术获得全长基因后构建原核表达质粒,转化E.coli BL21(DE3)T1R感受态细胞中,利用异丙基-b-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,采用SDS-PAGE和Western blot鉴定表达产物。采用生物信息学软件分析该基因及其编码蛋白的生物学特征。结果获得了粉尘螨聚泛素样蛋白的编码基因,全长1 644 bp,构建的原核表达质粒pET28a(+)-poly-u转化BL21后经IPTG诱导表达,SDS-PAGE和Western blot鉴定均可见目的蛋白条带。生物信息学分析该基因编码的蛋白质由547个氨基酸组成,相对分子质量为61.3×10~3。预测二级结构包括α-螺旋(占32.54%)、延伸主链(占15.36%)和无规卷曲(占52.10%),优势表位可能为TGGQQMGR、LEDRRTL、IQDKEQIPPDQ。结论成功获得粉尘螨聚泛素样蛋白的编码基因全长及其原核表达质粒,,并对其生物学特征进行了分析,为进一步针对该基因开发尘螨防制措施奠定了基础。