1型重组腺相关病毒介导增强型绿色荧光蛋白基因转染人脐静脉内皮细胞的体外研究

目的 评价1型重组腺相关病毒(rAAV1)作为新生血管性角膜病变基因治疗载体的可行性.方法 rAAV1-EGFP按转染倍数(MOI)5×103,5×104,5×105转染ECV304细胞,转染后在倒置荧光显微镜下观察ECV304细胞中GFP阳性表达情况和细胞生长形态特点等,流式细胞仪检测rAAV1-EGFP对EVE304细胞的转染效率.MTT法检测rAAV1-EGFP对EVC304细胞增殖的影响.结果 转染后2 d,MOI=5×105组细胞中的GFP开始表达;表达强度随MOI值的增高而增强,同时GFP的表达强度随着时间延长而逐渐增强,转染后第7天达到高峰,此时流式细胞仪检测rAAV1-EGFP对ECV304细胞的转染率分别为45.90％(MOI=5×103),58.56％(MOI=5×104),68.31％(MOI=5×105).AAV1-EGFP转染ECV304细胞后.细胞生长及形态正常.MTT法显示转染后72、96 h各转染组与未转染组之间A值无显著性差异.结论 rAAV1-EGFP对ECV304细胞转染稳定、有效,重组腺相关病毒对细胞增殖无明显抑制,重组腺相关病毒可作为基因治疗角膜新生血管性病变的载体.     

2种腺相关病毒介导的增强型绿色荧光蛋白对人成纤维细胞转染效率的研究

目的 比较2种不同腺相关病毒(adeno-associated virus, AAV)介导的增强型绿色荧光蛋白对人皮肤成纤维细胞(human fibroblast, HFB)的转染效率.方法 原代分离培养人皮肤成纤维细胞并鉴定,按照感染复数(multiple of infection,MOI)为104、105、106转染传2代的人成纤维细胞,流式细胞检测AAV2-EGFP和AAV2/1-EGFP对HFB的转染效率,倒置荧光显微镜观察转染后的荧光强度.MTT法检测AAV2-EGFP和AAV2/1-EGFP对HFB的毒性.结果 腺相关病毒AAV2-EGFP对HFB的转染效率随着MOI增加而增高, MOI为104时转染效率为(7.68±1.18)%,当MOI达到105后,转染效率稳定在(22.16±5.59)%,随着MOI增加,最高至MOI 106转染效率无显著提高.而病毒AAV2/1对于HFB的转染效率在MOI 为106转染效率仅为(3.47±0.93)%.2种病毒在转染过程中,细胞生长正常,MTT显示各转染组与未转染组的吸光度值无统计学差异.结论 AAV2载体对体外培养的HFB转染效率高于AAV2/1,但2种病毒载体对人皮肤成纤维细胞转染效率均不高,AAV2/1-EGFP对HFB几乎无感染能力.     

腺相关病毒介导增强型绿色荧光蛋白基因体外转染兔结膜上皮细胞

目的:研究2型重组腺相关病毒( recombinant adeno-associated virus 2,rAAV2)载体介导增强型绿色荧光蛋白基因(enhanced green fluorescent protein,EGFP) 对体外培养兔结膜上皮细胞的转染和表达情况,为后续研究提供依据。方法:体外培养兔结膜上皮细胞,rAAV2-EGFP 按感染复数(multiplicity of infection ,MOI)为104、105、106 转染第2代兔结膜上皮细胞,转染后第1 、3 、5 、7日倒置荧光显微镜下观察细胞中EGFP表达情况,计算转染率。MTT方法检测rAAV2-EGFP转染对细胞增殖的影响。结果:随着MOI值增大及转染时间延长,EGFP 表达效率逐渐增高,转染后第7～8日达到高峰并维持。MTT检测各MOI组与对照组差别无统计学意义。结论:rAAV2载体可以介导EGFP 基因高效稳定转染兔结膜上皮细胞,并且对细胞增殖无影响。     

重组腺相关病毒介导增强型绿色荧光蛋白基因经角膜基质瓣转染兔角膜基质细胞的实验研究

目的 研究重组腺相关病毒 (rAAV)介导增强型绿色荧光蛋白 (EGFP) 基因经角膜基质瓣转染兔角膜基质细胞的有效性和安全性。方法 微型角膜刀制作兔角膜基质瓣;转染组用含rAAV－EGFP转染液浸泡角膜瓣和角膜基质床10 min,对照组用等量BSS液浸泡角膜瓣和角膜基质床10 min,不同时间点(1、3、7、14、21d)通过荧光体视镜观察角膜出现EGFP荧光的起始时间及分布情况,收集角膜,其中一半用激光共聚焦显微镜观察、照相,另一半固定后行HE染色。结果 转染组于转染第3天,体视荧光显微镜下观察到兔眼角膜瓣内面及基质床中开始有GFP阳性表达;7d达到高峰, 21d时仍有微弱表达。第7天 在激光共聚焦显微镜下可观察到兔角膜基质中有明显的荧光表达。对照组角膜始终未见荧光表达。转染组和对照组角膜HE染色均未见炎症细胞浸润及新生血管等异常。结论 rAAV- EGFP经兔角膜基质瓣转染角膜基质细胞的方法可将基因安全、相对高效地转入角膜基质细胞。为转基因治疗角膜病提供了新的转染途径。     

3种腺相关病毒介导的绿色荧光蛋白对西藏小型猪胚胎成纤维细胞的转染效率

目的比较3种不同血清型腺相关病毒(AAV)介导的绿色荧光蛋白对西藏小型猪胚胎成纤维细胞的转染效率。方法原代分离培养西藏小型猪胚胎成纤维细胞并进行形态学鉴定,按照感染复数(MOI)为103、104、105转染传代两次的猪胚胎成纤维细胞,流式细胞学检测不同血清型AAV对西藏小型猪胚胎成纤维细胞的转染效率,并在倒置显微镜下观察转染后绿色荧光的表达强度;同时,应用MTT方法检测不同血清型AAV对西藏小型猪胚胎成纤维细胞的毒性。结果腺相关病毒AAV2-EGFP对PFF的转染效率随MOI值的增加而增高,MOI为103、104、105时,转染效率分别为(33.68±1.18)%、(50.80±2.59)%和(60.08±1.08)%,而其他两种血清型病毒感染效率均低于AAV2-EGFP。3种病毒转染PFF过程中,细胞生长正常,MTT显示各个转染组与对照组(未转染组)在D570处吸光度无显著差异。结论AAV2血清型载体对体外培养的猪胚胎成纤维细胞的感染效率显著高于其他几种血清型,AAV8和AAV9对PFF感染能力极差,筛选AAV2作为西藏小型猪基因打靶的最适病毒载体;同时,3类血清型病毒载体对猪胚胎成纤维细胞均无明显细胞毒性。     

重组绿色荧光蛋白腺相关病毒载体转染293细胞和CD34^＋细胞

目的研究重组绿色荧光蛋白腺相关病毒载体分别转染293细胞(人胚肾细胞)和人CD34^ 细胞后绿色荧光蛋白的表达情况。方法用CS-3000血细胞分离机分离骨髓单个核细胞，免疫磁性分离仪纯化CD34^ 细胞，重组绿色荧光蛋白腺相关病毒载体分别转染两种细胞，并通过荧光显微镜、流式细胞仪对绿色荧光蛋白的表达进行分析。结果荧光显微镜下两种细胞均可见绿色荧光蛋白表达，流式细胞仪于一定时间内检测293细胞的基因转导效率最高为32．8％，CD34^ 细胞的基因转导效率最高为25％．在所观察的时间内，转染率呈先升高后降低趋势。结论重组绿色荧光蛋白腺相关病毒载体能转染293和CD34^ 细胞，绿色荧光蛋白基因可作为良好的报告基因，为将来的干细胞基因治疗打下良好基础。     

2型重组腺相关病毒转染新西兰兔关节软骨细胞的体外研究

目的为进一步研究腺相关病毒重组体在体内间接和直接基因治疗的效果提供依据。方法应用AAVMaxTM包装系统,复制和包装2型腺相关病毒重组体,进行纯化和滴度检测后,按照不同的转染指数(MOI)转染体外培养的新西兰兔关节软骨细胞,观察转染效果与及转染效果与时间的关系。倒置荧光显微镜观察证实表转染成功,流式细胞仪检测转染效果,包括表达绿色荧光信号细胞的百分比和平均荧光强度,将未转染的软骨细胞自发表达的绿色荧光信号百分比的最大值4·76%和荧光信号强度的最大值1·04设定为空白对照。结果当MOI值在1×105v·g·/cell以下时,MOI值(v·g·/cell)与转染率之间的剂量-反应曲线为正相关的线性关系,在MOI超过105v·g·/cell时,转染率不会再有显著的提高。在转染第7天,绿色荧光信号表达达到了峰值,随着转染时间的延长和传代次数的增加,表达绿色荧光信号的软骨细胞百分比和荧光强度均呈现降低趋势,但在转染后第56天仍可检测到绿色荧光蛋白的表达。结论2型腺相关病毒重组体在体外对新西兰兔关节软骨的转染效果良好;增强绿色荧光蛋白是观察2型腺相关病毒重组体转染关节软骨细胞效果一种良好的报告基因。     

重组绿色荧光蛋白腺相关病毒载体转染293细胞和CD34+细胞

目的 研究重组绿色荧光蛋白腺相关病毒载体分别转染293细胞(人胚肾细胞)和人CD34⁺细胞后绿色荧光蛋白的表达情况。方法 用CS-3000血细胞分离机分离骨髓单个核细胞,免疫磁性分离仪纯化CD34⁺细胞,重组绿色荧光蛋白腺相关病毒载体分别转染两种细胞,并通过荧光显微镜、流式细胞仪对绿色荧光蛋白的表达进行分析。结果 荧光显微镜下两种细胞均可见绿色荧光蛋白表达,流式细胞仪于一定时间内检测293细胞的基因转导效率最高为32.8%,CD34⁺细胞的基因转导效率最高为25%,在所观察的时间内,转染率呈先升高后降低趋势。结论 重组绿色荧光蛋白腺相关病毒载体能转染293和CD34⁺细胞,绿色荧光蛋白基因可作为良好的报告基因,为将来的干细胞基因治疗打下良好基础。     

增强型绿色荧光蛋白基因在永生化大鼠神经前体细胞株的表达

目的:研究重组腺相关病毒载体介导的增强型绿色荧光蛋白基因在永生化大鼠神经前体细胞的转染效率及其表达情况. 方法:携带增强型绿色荧光蛋白基因的重组腺相关病毒转染永生化大鼠神经前体细胞,持续观察转基因神经前体细胞绿色荧光蛋白的表达情况,并计算转染效率. 应用巢蛋白抗体和抗猿肾病毒40大T抗原抗体进行细胞鉴定,50 mL/L胎牛血清诱导细胞分化后,应用神经元和星形胶质细胞特异性标志物抗体检测其分化能力. 结果:荧光显微镜观察显示转染后24 h神经前体细胞即有绿色荧光蛋白表达,转染后72 h,大部分细胞表达绿色荧光蛋白,转染效率可达90%. 经传代培养8 wk后,表达绿色荧光蛋白的阳性细胞仍可高达70%～75%. 免疫细胞化学结果显示转绿色荧光蛋白神经前体细胞巢蛋白和抗猿肾病毒40大T抗原抗体染色均为阳性,50 mL/L胎牛血清可诱导其分化为神经元和星形胶质细胞. 结论:携带增强型绿色荧光蛋白基因的重组腺相关病毒可高效转染永生化大鼠神经前体细胞,并可在细胞中长期稳定地表达,绿色荧光蛋白作为良好的示踪剂可应用于神经前体细胞的体内移植.     

9型重组腺相关病毒转染microRNA-21前体在大鼠心肌的转染效率及安全性

目的 研究含荧光标记ZsGreen的9型重组腺相关病毒(rAAV9)转染目的基因microRNA-21前体(pre-miR-21)至大鼠心肌的转染效率、表达时间及安全性.方法 用冠脉注射方法转染PBS及rAAV9-Zs-Green-pre-miR-21 1.0×1010 vg/只、1.0×1011 vg/只、1.0 x 1012vg/只至SD大鼠心肌,倒置荧光显微镜观察心肌组织荧光表达并计算转染效率,Realtime PCR方法测定miR-21表达,超声心动图观察大鼠心功能.结果 冠脉注射后7 d PBS组未见绿色荧光,余各组大鼠心肌均可观察到少量绿色荧光表达,第14天达高峰,之后呈下降趋势.14d高病毒量组较其他中、低病毒量组转染效率明显高[(73.7±8.4)％ vs (39.6±4.8)％,(P＜0.001)];[(73.7±8.4)％ vs (24.1±4.2)％,(P＜0.001)].14d miR-21表达在低、中、高病毒量组较PBS组分别增加1.51倍、2.89倍及4.43倍.rAAV9转染后对大鼠心功能无影响(P＞0.05).结论 rAAV9-Zs-Green-pre-miR-21可以有效、持久、安全地在大鼠心肌表达.     

增强型绿色荧光蛋白-C1转染示踪骨髓间充质干细胞

目的：应用增强型绿色荧光蛋白-C1（enhanced green fluorescent protein,pEGFP-C1）标记骨髓间充质干细胞（marrow mesenchymal stem cells,MMSCs）,以期为MMSCs的体内移植提供示踪方法。方法：在体外分离培养大鼠MMSCs,流式细胞仪检测细胞表型,以脂质体介导法转染质粒增强型绿色荧光蛋白基因,荧光显微镜观察基因表达。结果：pEGFP-C1在基因转染24 h后开始表达,48-72 h达高峰,12-14 d后有较多的表达。结论：由脂质体介导的质粒pEGFP-C1可较为安全、有效地转染MMSCs,是一种较为理想的干细胞示踪方法。     

不同转染方法及GFP表达载体对小鼠胚胎干细胞转染效率的比较

目的对比不同的转染方法及绿色荧光蛋白(GFP)表达载体对小鼠胚胎干细胞(ESC)的转染效率,为进一步研究ESC及衍生细胞移植示踪提供工具。方法用阳离子脂质体转染小鼠胚胎干细胞系ES-D3,对比贴壁细胞转染法、悬浮细胞转染法及不同载体pCX-EGFP、p-EGFP-C1和pIRES-hrGFP的转染效率。结果悬浮法和贴壁法转染效率分别为(90.0±4.1)%,(70.0±2.3)%,两组比较差异有显著性意义(P<0.05)。3种载体转染效率分别为pCX-EG-FP(90.0±4.1)%,pIRES-hrGFP(32.0±6.0)%,p-EGFP-C1(4.0±0.4)%。3组间两两比较差异均有显著性意义(P<0.05)。结论悬浮转染法转染pCX-EGFP可获得较高的转染效率。     

细胞穿透肽PEP-1介导增强型绿色荧光蛋白穿透在体小鼠皮肤

目的:研究细胞穿透肽PEP-1介导的增强型绿色荧光蛋白穿透小鼠皮肤的能力。方法:用基因工程的方法制备并纯化EGFP蛋白和PEP-1-EGFP融合蛋白,分别将1mg的蛋白涂抹在昆明小鼠背部皮肤上,4 h后处死小鼠取背部皮肤冰冻切片后立即在倒置荧光显微镜下观察。结果:EGFP处理的小鼠皮肤仅在角质层表面有少量荧光,PEP-1-EGFP融合蛋白处理的小鼠皮肤可见绿色荧光穿透角质层并分布于表皮和真皮内。结论:PEP-1-EGFP融合蛋白能穿透小鼠皮肤角质层并分布于表皮和真皮内,这为将来用细胞穿透肽PEP-1经皮转导大分子药物治疗各种皮肤病以及全身系统性疾病奠定了基础。     

增强型绿色荧光蛋白转基因小鼠脂肪间充质干细胞的多向分化潜能简

目的分离、培养增强型绿色荧光蛋白（enhancedgreenfluorescentprotein,EGFP）转基因小鼠脂肪间充质干细胞（adipose-derivedmesenchymalstemcells,ADMSCs）,并研究ADMSC在体外定向诱导下的多向分化潜能。方法分离EGFP转基因小鼠腹股沟的皮下脂肪组织,剪碎后胶原酶消化,含10％优等胎牛血清（fetalcalfserum,FBS）的α—MEM培养液培养,取第3代EGFP—ADMsCs进行成骨、成脂诱导,并分别采用茜素红钙盐染色和油红0染色进行鉴定。结果成功获得了稳定表达EGFP的ADMSC;EGFP-ADMSCs经成骨诱导21d后茜素红染色可见橘红色钙盐沉积,经成脂诱导14d后油红。染色阳性,并且分化后细胞的EGFP表达不受影响。结论EGFP转基因小鼠来源的脂肪间充质干细胞具有普通小鼠ADMSCs相同的自我更新增殖和多向分化的干细胞特性,并且能稳定表达EGFP,可以成为研究干细胞修复受损组织的作用机制的有效示踪工具。     

心肌α肌球蛋白重链启动子驱动的绿色荧光蛋白表达载体的构建及鉴定

目的:构建并鉴定心肌α肌球蛋白重链启动子驱动的绿色荧光蛋白表达载体(MHC-EGFP),该基因只在心肌中特异性表达。方法:设计5’和3’分别具有SalI/H indⅢ酶切位点的EGFP引物,聚合酶链反应法(PCR)从pLEGFP质粒中扩增增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的cDNA,插入pGEM-T Easy载体表达盒,构建pGEM-EGFP,Sa-lI/H indⅢ双酶切后回收729 kb片断,插入经相同酶切的含5.5 kb心肌特异性α肌球蛋白重链启动子的pNC26质粒,构建pMHC-EGFP。连接产物转化感受态DH5α,挑选克隆,PCR扩增鉴定,重组质粒经NotI酶切,回收7.2 kbMHC-EGFP表达盒。分离培养小鼠心肌细胞与骨骼肌成肌细胞。MHC-EGFP表达盒通过脂质体法分别转染心肌与骨骼肌成肌细胞。荧光显微镜观察转染细胞是否出现绿色荧光,以鉴定MHC-EGFP表达盒是否具有表达特异性。结果:EGFP cDNA正确插入pNC26质粒中αMHC启动子3’端。成功转染MHC-EGFP表达盒的心肌细胞出现绿色荧光,而转染的骨骼肌成肌细胞无荧光出现。结论:MHC-EGFP表达盒具有心肌特异性表达特性,为进一步监测干细胞向心肌分化研究奠定基础。     

细胞穿透肽PEP-1介导增强型绿色荧光蛋白转导入脐静脉内皮细胞

目的研究PEP—1—EGFP融合蛋白穿透人脐静脉内皮细胞的能力。方法用基因工程的方法制备并纯化EGFP蛋白和PEP—1—EGFP融合蛋白，将纯化后的两种蛋白和体外培养的人脐静脉内皮细胞共同孵育，分别观察其进入细胞的能力及PEP—1—EGFP进入细胞的时间依赖性、剂量依赖性和稳定性，并用MTr法检测PEP-1-EGFP融合蛋白对细胞的毒性。结果EGFP蛋白不能进入细胞内。PEP-1-EGFP融合蛋白可在5min内穿透人脐静脉内皮细胞，其穿透人脐静脉内皮细胞的能力呈时间和剂量依赖性，进入细胞后27h仍可观察到微量绿色荧光。PEP-1-EGFP蛋白浓度达200umol／L时对细胞仍无毒性。结论PEP—1能有效携带目的蛋白进入人脐静脉内皮细胞，这为将来用细胞穿透肽PEP-1介导有生物活性的抗氧化物质穿透内皮细胞治疗缺血再灌注损伤奠定了基础。     

腺病毒介导的人内皮型一氧化氮合酶基因和增强型绿色荧光蛋白基因在大鼠骨髓间充质干细胞中的表达

目的:研究腺病毒载体介导人内皮型一氧化氮合酶(human endothelial nitric oxide synthase,heNOS)和增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)在体外培养的大鼠骨髓间充质干细胞(mesenchymalstem cells,MSCs)的表达。方法:体外培养、扩增大鼠骨髓间充质干细胞,并对培养的细胞进行成骨、成脂肪诱导分化和细胞免疫表型鉴定;用Pme I线性化后去磷酸化的pShuttle-heNOS-EGFP转化含腺病毒骨架质粒pAdEasy-1的感受态BJ 5183,使其在细菌内发生同源重组,获得阳性重组质粒pAdEasy-heNOS-EGFP。重组质粒经PCR、酶切和测序鉴定正确后经PacⅠ酶切,转入AD 293细胞,包装成重组腺病毒Ad-heNOS-EGFP。用重组腺病毒Ad-heNOS-EGFP对MSCs进行转染,并用荧光显微镜及免疫荧光染色法观察转染细胞内EGFP和heNOS蛋白质的表达。结果:pShuttle-heNOS-EGFP与pAdeasy-1在BJ 5183中成功地发生了同源重组,得到了重组腺病毒质粒pAdEasy-heNOS-EGFP。重组质粒在AD 293细胞中包装成重组腺病毒Ad-heNOS-EGFP。经基因转染的MSCs中高表达heNOS和EGFP。结论:采用腺病毒载体可以将外源性的heNOS基因转染至MSCs中,并得到有效表达,且携带的EGFP标记可以直观地检测靶细胞感染和外源基因的表达情况,这将为勃起功能障碍的细胞治疗提供一条新的途径。