U937泡沫细胞模型的建立

为建立一个新的人单核细胞来源的泡沫细胞模型,将Ｕ９３７细胞与８０ｍｇ／Ｌ氧化型低密度脂蛋白孵育４８ｈ,应用高效液相色谱检测发现细胞内胆固醇和胆固醇酯增加,胆固醇脂含量大于总胆固醇含量的５０％,应用光镜和透射电镜观察发现细胞乐内出现大量的红染颗粒或脂质空泡,提示Ｕ９３７细胞与８０ｍｇ／Ｌ氧化型低密度脂蛋白孵育４８ｈ后,成功建立了人类单核细胞源性泡沫细胞。     

氧化型低密度脂蛋白和普伐他汀对人脐静脉内皮细胞细胞间粘附分子-1表达的影响

观察氧化型低密度脂蛋白对人脐静脉内皮细胞细胞间粘附分子－１表达的诱导及普伐他汀对它的抑制影响,以期氧化型低密度脂蛋白致动脉粥样硬化的机制及普伐他汀可能的非调脂抗动脉粥样硬化作用。体外培养人脐静脉内皮细胞,分别加氧化型低密度脂蛋白５０ｍｇ／Ｌ、１００ｍｇ／Ｌ、２００ｍｇ／Ｌ及氧化型低密度旨蛋白（１００ｍｇ／Ｌ）＋普伐他汀（１０＾－４－－６ｍｏｌ／Ｌ）,孵育１２ｈ、２４ｈ和３６ｈ,采用细胞酶联免疫吸附     

氧化型低密度脂蛋白诱导U937细胞凋亡时细胞间粘附分子-1的表达时序

研究氧化型低密度脂蛋白诱导人单核细胞U937细胞吞噬脂质发生凋亡过程中对细胞间粘附分子－1表达的影响,用胸腺嘧啶核苷将U937细胞阻滞在G1期,流式细胞仪监测同步化处理效果;流式细胞术检测U937细胞泡沫化过程中细胞凋亡和细胞间粘附分子－1的表达;逆转录－聚合酶链反应分析细胞间粘附分子－1 mRNA的表达,结果显示,80mg/L氧化型低密度脂蛋白温育U937细胞48h可形成典型的泡沫细胞,72h可见凋亡细胞增多;氧化型低密度脂蛋白温育U937细胞12h即可检测到细胞间粘附分子－1表达,24h时达到最高值,48h略有降低,72h时则明显降低。结果表明,氧化型低密度脂蛋白可以促进U937细胞细胞间粘附分子－1表达,细胞间粘附分子－1的表达增强有利于巨噬细胞的趋化运动和对脂质的吞噬。     

小鼠腹腔巨噬细胞对糖基化脂蛋白的氧化修饰作用

目的通过研究脂蛋白糖基化后易被氧化修饰的性质来探讨胰岛素抵抗患者易于发生动脉粥样硬化的机理。方法用葡萄糖和低密度脂蛋白（ＬＤＬ）共同温育后得到糖基化脂蛋白（Ｇｌｕ－ＬＤＬ），并用琼脂糖电泳法和硫代巴比妥酸（ＴＢＡ）比色法鉴定糖基化的程度。用Ｃｕ２＋和小鼠腹腔巨噬细胞分别和Ｇｌｕ－ＬＤＬ共同温育，检测ＴＢＡ反应物（ＴＢＡＲＳ）含量及电泳迁移速度。结果Ｇｌｕ－ＬＤＬ和未糖基化ＬＤＬ分别与Ｃｕ２＋共同温育８ｈ后，二者ＴＢＡＲＳ含量具有显著性差异（Ｐ＜０．００１）；Ｇｌｕ－ＬＤＬ和ＬＤＬ分别与小鼠腹腔巨噬细胞共同温育２４及４８ｈ后，二者ＴＢＡＲＳ含量亦具有显著性差异（Ｐ＜０．０５），电泳迁移率也有相应改变。结论脂蛋白糖基化后易被氧化修饰，说明其稳定性下降。     

冠状动脉粥样硬化斑块组成成分与斑块破裂的关系

为观察氧化型低密度脂蛋白对内皮细胞一氧化氮生成的影响,采用体外细胞培养方法将含不同浓度氧化型低密度脂蛋白的ＤＭＥＭ 培养液（ 氧化型低密度脂蛋白终浓度分别为０ ｍｇＬ、５０ ｍｇＬ 、１００ ｍｇＬ 、２００ ｍｇＬ）,与内皮细胞共同孵育（３７ ℃、５％ ＣＯ２）２４ ｈ 后,分别测上清液中乳酸脱氢酶活性和一氧化氮含量及细胞中一氧化氮合酶活性,并用细胞化学染色法记数各组细胞一氧化氮合酶阳性染色细胞数。结果发现,随着培养液中氧化型低密度脂蛋白浓度升高,上清液中乳酸脱氢酶活性增加和一氧化氮含量下降,细胞中一氧化氮合酶活性和一氧化氮合酶阳性染色细胞数下降,可见,氧化型低密度脂蛋白可损伤血管内皮细胞,降低细胞中一氧化氮合酶活性,抑制一氧化氮产生,这可能是氧化型低密度脂蛋白致动脉粥样硬化的原因之一。     

消斑肽能逆转平滑肌细胞源性泡沫细胞

培养的猪主动脉平滑肌细胞，在与１０ｍｇ·Ｌ－１氧化型低密度脂蛋白作用７２ｈ后，细胞内蓄积胆固醇酯，使胆固醇酯占总胆固醇的６４．１％，形成泡沫细胞。然后向泡沫细胞的培养基中加入不同浓度的消斑肽，作用２４ｈ后，发现总胆固醇和胆固醇酯均下降，而且胆固醇酯小于总胆固醇的５０％，提示泡沫细胞发生了逆转。在平滑肌细胞源性泡沫细胞的形成过程中，一氧化氮合成增加，与对照组的差别有显著性，而在逆转过程中一氧化氨合成下降，与对照组差别无显著性，提示消斑肽有使一氧化氮合成功能恢复正常的作用。     

RAW264.7巨噬细胞源性泡沫细胞模型的建立及鉴定

目的 以小鼠巨噬细胞RAW264.7为对象,建立简便而又准确的泡沫细胞诱导及鉴定方法.方法 将实验分为正常对照组和不同浓度氧化型低密度脂蛋白与细胞孵育组,在以孵育时间为24 h的前提下,用MTT法和流式细胞术来确定诱导泡沫细胞的氧化型低密度脂蛋白合适浓度区间范围,并用总胆固醇试剂盒和游离胆固醇试剂盒测定不同程度泡沫细胞内胆固醇酯含量.结果 氧化型低密度脂蛋白浓度范围为20～30 mg/L时,细胞存活率已受到显著抑制,并随着氧化型低密度脂蛋白浓度的增高细胞凋亡率和坏死率逐渐增大,起初以细胞凋亡为主,当氧化型低密度脂蛋白浓度大于40 mg/L时凋亡的细胞不断坏死.20 mg/L和30 mg/L氧化型低密度脂蛋白与RAW264.7细胞共孵育24 h,细胞内胆固醇酯比重分别为66.26%和71.19%,而10 mg/L的氧化型低密度脂蛋白诱导24 h的泡沫细胞不典型,40 mg/L以上的氧化型低密度脂蛋白诱导的泡沫细胞泡沫化程度严重,贴壁不牢,大部分细胞破裂或凋亡,脂滴散布于细胞外.结论 20～30 mg/L氧化型低密度脂蛋白诱导的RAW264.7巨噬泡沫细胞模型稳定且形态较完整,符合泡沫细胞的形态学特征.     

动脉粥样硬化敏感小鼠C_（57）BL／6J腹膜巨噬细胞源性泡沫细胞模型的建立

泡沫细胞的出现是动脉粥样硬化斑块中有特征性的病理形态改变。本实验选择对动脉粥样硬化形成较敏感的纯系小鼠Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ，取其腹膜巨噬细胞与１０ｍｇ·Ｌ－１氧化低密度脂蛋白共同孵育９６ｈ，建立了典型的巨噬细胞源性泡沫细胞模型。实验结果显示，培养的泡沫样细胞与在无脂蛋白培养基中培养的Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ小鼠巨噬细胞和在氧化低密度脂蛋白中培养的昆明种小鼠巨噬细胞比较，脂质成分大量增多，出现脂质颗粒，细胞内总胆固醇增加，其中胆固醇酯含量大于游离胆固醇，符合泡沫细胞的定义。本实验从离休细胞培养方面探寻建立小鼠巨噬细胞源性泡沫细胞的可能性，为动脉粥样硬化的形成机理分析和防治研究提供了一种可靠的病理细胞模型。     

云芝多糖对受氧化型低密度脂蛋白攻击的小鼠腹腔巨噬细胞泡沫样变性及衰减的影响

以氧化修饰低密度脂蛋白攻击小鼠腹腔巨噬细胞为损伤模型，观察了云芝多糖对巨噬细胞泡沫样变性及衰减的影响的时效和量效关系。腹腔注射云芝多糖的小鼠腹腔巨噬细胞在体外与１０、５０、１００ｍｇ·Ｌ－１等三种浓度的氧化型低密度脂蛋白共同培养２４、４８和７２ｈ后，细胞形态未有较大改变，用ＭＴＴ比色法计数各时间点细胞存活数，受云芝多糖保护的巨噬细胞存活数较高。结果表明，云芝多糖能抑制巨噬细胞泡沫样变性，以及巨噬细胞泡沫样变性后，云芝多糖能延长其生存时间，防止其死亡，这对抑制动脉粥样硬化的进程有益处。     

糖尿病大鼠糖基化终产物与主动脉细胞外基质成分的关系

为了观察富含胆固醇的脂蛋白对兔主动脉平滑肌细胞脂类堆积的影响及机制,用富含胆固醇的脂蛋白（β－ 极低密度脂蛋白、正常低密度脂蛋白和氧化型低密度脂蛋白） 与兔主动脉平滑肌细胞温育４８ ｈ 后,发现β－ 极低密度脂蛋白、正常低密度脂蛋白和氧化型低密度脂蛋白都能促进平滑肌细胞内总胆固醇和甘油三酯堆积,以β－ 极低密度脂蛋白的作用更显著。乳铁蛋白作为低密度脂蛋白受体相关蛋白的一种特异配体,当它与上述脂蛋白共同与平滑肌细胞温育后,发现乳铁蛋白对脂蛋白所致的平滑肌细胞内脂质堆积有抑制作用。乳铁蛋白与标记的β－ 极低密度脂蛋白、正常低密度脂蛋白和氧化型低密度脂蛋白的竞争结合实验也进一步发现乳铁蛋白可明显竞争β－ 极低密度脂蛋白、正常低密度脂蛋白、氧化型低密度脂蛋白与平滑肌细胞的结合,且对β－ 极低密度脂蛋白的竞争抑制作用尤为明显。提示β－ 极低密度脂蛋白、正常低密度脂蛋白和氧化型低密度脂蛋白可能主要通过低密度脂蛋白受体相关蛋白介导进入平滑肌细胞,导致平滑肌细胞内脂质堆积。     

外源性Rb基因对U937细胞泡沫化过程中CD36表达的影响

为研究抑癌基因Rb基因在U937细胞泡沫化过程中的表达，应用重组腺病毒载体导入外源性Rb基因。采用逆转录聚合酶链反应和流式细胞术检测氧化型低密度脂蛋白致U937细胞泡沫化过程中清道夫受体CD36和Rb基因的表达和外源性Rb基因导入U937细胞后CD36和Rb基因的表达。结果发现，氧化型低密度脂蛋白致U937细胞泡沫化过程中，Rb mRNA和蛋白的表达随作用时间延长呈下调趋势，CD36 mRNA和蛋白的表达则呈上调趋势；随着外源性Rb导入U937细胞并表达，CD36表达呈下调趋势。结果提示，外源性Rb基因的导入可以下调清道夫受体CD36的表达。     

干扰Sestrin2表达对ox-LDL诱导的人脐静脉内皮细胞凋亡的影响

目的观察干扰Sestrin2表达对氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)诱导的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)凋亡的影响。方法用ox-LDL处理HUVEC复制内皮细胞损伤模型。Western blot检测不同浓度ox-LDL处理HUVEC不同时间Sestrin2的蛋白表达水平及转染Sestrin2 siRNA后Sestrin2的蛋白表达水平;流式细胞术检测干扰Sestrin2表达后对ox-LDL诱导的HUVEC凋亡率的影响;Western blot检测干扰Sestrin2表达后对ox-LDL诱导的HUVEC中Caspase-3表达的影响及ox-LDL对HUVEC中JNK通路的影响。结果不同浓度(20、50和100 mg/L)的ox-LDL处理HUVEC 24 h均能明显上调Sestrin2表达;50 mg/L ox-LDL处理HUVEC不同时间(24 h和48 h)均能明显上调Sestrin2表达,24 h达高峰;转染Sestrin2 siRNA能明显抑制Sestrin2的表达;ox-LDL能明显诱导HUVEC凋亡,转染Sestrin2 siRNA能明显促进由ox-LDL诱导的HUVEC凋亡;ox-LDL能明显诱导p-JNK和p-c-Jun的表达,且SP600125能明显抑制由ox-LDL诱导的Sestrin2表达。结论 ox-LDL通过JNK/c-Jun信号通路诱导Sestrin2表达,干扰Sestrin2表达能明显促进ox-LDL诱导的HUVEC凋亡。     

氧化低密度脂蛋白对U937细胞凋亡的影响及其机制的研究

目的探讨氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)对培养的单核巨噬系细胞株U937细胞凋亡的影响,并进一步探讨凋亡产生的机制。方法应用流式细胞术(FCM)检测细胞凋亡;Caspase-3、8、9的测定采用免疫组织化学技术。结果ox-LDL组细胞调亡率增加,并且随着作用时间的延长和浓度的增加,凋亡呈递增后递减变化,U937细胞在用ox-LDL培养后LOX-1和Caspase3、8、9表达都增加。结论ox-LDL可诱导U937细胞凋亡,ox-LDL诱导U937细胞凋亡既有线粒体通路,又包含了死亡受体。     

LOX-1在氧化型低密度脂蛋白诱导U937细胞凋亡中的作用和卡托普利的干预作用

目的探讨ox-LDL受体LOX-1在ox-LDL诱导单核/巨噬细胞凋亡中的角色和卡托普利的干预作用。方法应用流式细胞术检测细胞凋亡,采用免疫组织化学技术和Western Blot测定Caspase3、8、9的表达。结果ox-LDL可诱导U937细胞的凋亡峰出现(12.773±1.413),应用卡托普利和LOX-1的阻断剂角叉菜胶、PIA后凋亡峰明显减少,其百分比分别为(1.02±0.166)(4.94±0.47)(2.62±0.656),同时U937细胞在用ox-LDL培养后代表线粒体通路的Cas-pase9,3和代表死亡受体通路caspases8,3表达都增加,应用卡托普利和LOX-1的阻断剂角叉菜胶、PIA后caspase3、8、9的表达均减少。结论ox-LDL是通过与其受体LOX-1结合发挥损伤作用的。卡托普利可以抑制ox-LDL对U937细胞凋亡的诱导作用,从而对单核巨噬细胞起到保护作用。     

U937源性泡沫细胞形成中组织因子途径抑制物2的表达定位及变化规律

目的研究U937源性泡沫细胞形成过程中组织因子途径抑制物2的表达定位及变化规律。方法采用沉淀法提取人血浆低密度脂蛋白,硫酸铜氧化制备氧化型低密度脂蛋白,与U937单核细胞共同孵育,建立泡沫细胞模型,同时体外培养人脐静脉内皮细胞,加入U937泡沫细胞中共同培养,观察内皮细胞对泡沫细胞形成的影响。采用双重细胞免疫荧光定位组织因子途径抑制物2蛋白,时间免疫分辨荧光定量组织因子途径抑制物2蛋白,逆转录聚合酶链反应和荧光定量聚合酶链反应检测泡沫细胞内组织因子途径抑制物2基因的动态变化。结果组织因子途径抑制物2主要定位于U937单核细胞胞质中,与组织因子有相似的分布。氧化型低密度脂蛋白作用于U937细胞6h后组织因子途径抑制物2蛋白和基因表达水平持续增高,6h达至峰值而后表达持续降低。氧化型低密度脂蛋白作用于人脐静脉内皮细胞后组织因子途径抑制物2蛋白表达增加,24h时达至峰值。加入内皮细胞可改善氧化型低密度脂蛋白抑制U937细胞表达组织因子途径抑制物2的作用。结论U937泡沫细胞形成过程中,体外培养的人源性单核细株胞U937上存在组织因子途径抑制物2的表达抑制,而与人脐静脉内皮细胞共同培养可改善这种异常。     

抗磷脂抗体对巨噬细胞摄取氧化型低密度脂蛋白及CD36表达的影响

为了探讨抗磷脂抗体对巨噬细胞摄入氧化型低密度脂蛋白的影响及其主要清道夫受体CD36抗原表达的调节 ,将培养的U937细胞与氧化型低密度脂蛋白 (80mg L)和抗磷脂抗体 (10 0mg L)孵育 ,用酶荧光法观察人类单核细胞株U937内脂质的变化、逆转录—聚合酶链反应和流式细胞术观察CD36抗原mRNA和蛋白水平表达的改变。结果发现氧化型低密度脂蛋白存在时细胞内胆固醇和胆固醇酯含量分别为 2 4 3± 9mg g细胞和 2 89± 12mg g细胞 ,流式细胞仪测CD36抗原为 2 5 % ,凝胶电泳分析CD36mRNA β actionmRNA为 1.0 5 ;在加入抗磷脂抗体后 ,胞浆内胆固醇和胆固醇酯明显增加 ,分别为 2 76± 10mg g细胞和 4 78± 13mg g细胞 ,流式细胞仪测CD36抗原为 37% ,凝胶电泳分析CD36mRNA β actionmRNA为 1.90 ;两组相比差异有显著性 (P <0 .0 5 )。以上提示抗磷脂抗体有促进U937细胞摄取氧化型低密度脂蛋白的作用 ,这一过程是通过在转录及蛋白水平上调CD36抗原表达而实现的     

不同阶段泡沫细胞模型的建立与鉴定

目的建立不同阶段的泡沫细胞,并对其生物特性进行鉴定。方法体外培养人THP-1来源的巨噬细胞（THP-M）,由ox-LDL诱导其转化为不同阶段泡沫细胞,ELISA方法检测不同阶段泡沫细胞内总胆固醇和胆固醇酯含量;透射电镜和油红O染色光镜观察细胞内脂质,噻唑蓝染色法测定不同阶段泡沫细胞的活性变化规律。Western blot方法测定II型微管相关蛋白1轻链3（LC3II）蛋白表达水平。结果 24h开始,THP-M细胞质内出现大量的红染颗粒或脂质空泡,总胆固醇和胆固醇酯均较对照组增加,细胞胆固醇酯含量大于总胆固醇的50%,泡沫细胞已经形成。噻唑蓝染色结果显示,自48h开始少量泡沫细胞出现死亡现象（存活率93.21±3.66%）,60h和72h细胞存活率率分别为72.15±2.23%和63.06±1.83%。电镜扫描结果发现,24h细胞内脂滴聚集,24h内细胞浆自噬小体逐渐增多。36h、48h细胞内脂滴大小和形态各异,可见吞噬脂滴后尚未消化完全的自噬溶酶体,部分细胞膜破裂;60h和72h,细胞内自噬小体数量明显减少,细胞大量崩解。Western blot检测结果表明自噬标志性蛋白LC3II表达水平变化规律与电镜观察自噬小体结果一致。结论利用oxLDL诱导THP-M24h、36h-48h、60h-72h后,细胞形态和细胞内脂含量分别符合早期、中期和晚期泡沫细胞的生物特征,成功建立了早、中、晚期泡沫细胞模型,其中细胞活力变化可能与II型凋亡（自噬性死亡）相关。为不同病程AS研究提供支持。