1,10-邻二氮杂菲双过氧钒酸钾对HT22细胞增殖和周期的影响

目的探讨1,10-邻二氮杂菲双过氧钒酸钾〔BPV(phen)〕是否通过调节DNA甲基转移酶(DNMT)的表达,调控细胞周期相关基因表达,进而影响细胞周期。方法 BPV(phen)0.3和3.0μmol·L~(-1)处理HT22细胞24 h,MTS法检测细胞存活;流式细胞术方法检测细胞周期;ELISA法检测DNMT活性;实时荧光定量PCR检测p21,DNMT1,DNMT3A和DNMT3B mRNA表达水平;Western印迹法分别检测相应蛋白表达水平。结果与DMSO对照组相比,BPV(phen)0.3μmol·L~(-1)对细胞存活率无显著影响,BPV(phen)3.0μmol·L~(-1)组细胞存活率显著降低(P<0.05)。细胞周期结果显示,与DMSO对照组相比,BPV(phen)0.3μmol·L~(-1)组各细胞周期百分比无显著差异,BPV(phen)3.0μmol·L~(-1)组S期细胞显著增加,为(76.1±1.6)%(P<0.05),G2期细胞显著降低(P<0.05),为(2.1±1.5)%。与DMSO对照组相比,BPV(phen)3.0μmol·L~(-1)组细胞DNMT活性显著增加(P<0.05)。实时荧光定量PCR结果显示,与DMSO对照组相比,BPV(phen)0.3μmol·L~(-1)组p21,DNMT1,DNMT3A和DNMT3B mRNA表达水平无显著差异,BPV(phen)3.0μmol·L~(-1)组各基因表达水平均显著增加(P<0.05,P<0.01)。Western印迹结果显示,与DMSO对照组相比,BPV(phen)0.3μmol·L~(-1)组各蛋白表达水平均无显著性差异,只有BPV(phen)3.0μmol·L~(-1)组DNMT3B和P21蛋白表达显著增加(P<0.05)。结论 BPV能够通过改变DNMT的表达,调节下游与细胞周期相关基因的表达,进而影响HT22细胞的生长和增殖。     

用实时荧光定量RT-PCR检测单个小鼠种植前胚胎中特异性基因表达

目的用单细胞实时荧光定量RT-PCR,检测单个小鼠种植前胚胎中特异性基因表达。方法采集小鼠卵母细胞和原核期胚胎,后者经体外培养至囊胚。采用实时荧光定量RT-PCR对多个及单个卵母细胞和2-细胞期胚胎中Tcl1基因的表达进行定量检测;用同样方法对小鼠种植前各发育阶段的胚胎进行Tcl1基因的表达检测。结果在多个及单个卵母细胞和2-细胞期胚胎中,均检测出Tcl1的表达;多个卵母细胞、2-细胞期胚胎中Tcl1的表达量显著高于单个卵母细胞、2-细胞期胚胎;此方法也适用于胚胎早期发育的各个时期,Tcl1在单个卵母细胞、原核期胚胎和2-细胞期胚胎中表达量最高,在4-细胞期胚胎、8-细胞期胚胎、桑葚胚和囊胚中表达量极低。结论应用单细胞实时荧光定量RT-PCR可对单个小鼠种植前胚胎中基因的表达进行定量检测。     

二烯丙基三硫诱导人胃癌细胞凋亡相关基因的差异表达

目的探讨二烯丙基三硫(diallyl trisulfide,DATS)诱导人胃癌MGC803细胞凋亡的分子机制。方法MTT法检测DATS对MGC803细胞的生长抑制作用,荧光显微镜和流式细胞仪观察DATS作用后的细胞凋亡。人细胞凋亡基因芯片检测DATS作用MGC803细胞的凋亡相关基因表达谱,RT-PCR验证凋亡相关基因。结果MTT结果显示,4、8、12、16、24mg.L-1DATS对MGC803细胞生长的抑制率从11%增至78%,呈明显量效关系(P<0.05)。荧光显微镜下,DATS处理后的MGC803细胞核染色质着橘红色并呈固缩状或片段状。流式细胞仪检测显示,8、12、16、24mg.L-1DATS作用24h后,出现典型亚二倍体峰,平均凋亡率分别为11.4%、23.7%、27.4%、31.1%(P<0.05)。人细胞凋亡基因芯片检测结果表明,16mg.L-1的DATS作用4h后出现16个凋亡相关基因表达差异,RT-PCR证实,SODD基因mRNA表达上调、Apaf-1基因mRNA表达下调(P<0.05)。结论DATS诱导人胃癌MGC803细胞凋亡可能与多个基因和信号转导通路作用有关。     

应用基因芯片技术研究非毒性结节性甲状腺肿基因表达的初步研究

目的筛查非毒性结节性甲状腺肿(NTNG)相关基因,探讨NTNG发生机制。方法分别抽提NTNG患者甲状腺组织及正常甲状腺组织总RNA,逆转录合成相应以Cy5和Cy3标记的探针与基因表达谱芯片进行杂交,扫描芯片荧光信号图像,用对扫描图像进行数字化处理和分析。利用实时荧光定量PCR技术对筛选出的部分表达差异明显的基因进行验证。结果筛选出表达差异明显的基因48个,其中NTNG组中表达上调的基因36条,表达下调的基因12条。荧光定量PCR结果与基因芯片一致。结论 NTNG患者甲状腺组织与正常甲状腺组织之间存在明显的基因表达差异,为NTNG患者提供相当数量的与细胞外基质、细胞因子、受体信号转细胞信号传递等相关的差异表达基因,为NTNG早期诊断和治疗提供了线索。     

胰高血糖素样肽-1受体在β淀粉样蛋白31-35对HT22神经细胞节律基因per2影响中的作用

目的探讨胰高血糖素样肽-1受体(GLP-1R)在β淀粉样蛋白(Aβ)31-35影响HT22神经细胞节律基因per2表达中的作用。方法以小鼠海马HT22神经细胞为研究对象。四甲基偶氮唑盐(MTT)细胞毒性实验检测细胞存活率的变化;实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)检测不同CT时间per2基因的变化趋势;免疫荧光染色观察CT16时GLP-1R及PER2蛋白的原位表达情况。结果 (1)分别使用0、1、5μmol/L的Aβ31-35处理细胞,结果发现:1μmol/L Aβ31-35处理组细胞存活率与对照组相比差异无统计学意义(P>0.05);5μmol/L Aβ31-35处理组细胞存活率与对照组相比差异有统计学意义(P<0.05)。(2)经1μmol/L Aβ31-35处理后,per2基因表达与对照组相比差异无统计学意义(P>0.05);经5μmol/L Aβ31-35处理后,per2基因表达在CT16时与对照组相比差异有统计学意义(P<0.05)。(3)在CT16时,经5μmol/L Aβ31-35处理后,GLP-1R的表达与对照组相比差异有统计学意义(P<0.05)。(4)在CT16时,经10μmol/L Exendin(9-39)处理后PER2蛋白的荧光强度与对照组相比差异有统计学意义(P<0.05)。结论:Aβ31-35可能通过降低GLP-1R表达导致小鼠海马HT22神经细胞per2节律基因异常表达。     

5-氮-2'脱氧胞苷对食管癌细胞系KYSE220中CDH13基因甲基化的影响

目的观察去甲基化制剂5-氮-2’脱氧胞苷(5-Aza-dC)对人食管癌细胞系KYSE220中CDH13基因启动子区甲基化影响,探讨KYSE220中CDH13基因失活机制及5-Aza-dC对CDH13基因表达调控作用。方法 5-Aza-dC处理体外培养的KYSE220细胞,用甲基化特异性PCR(MSP)法检测处理前后细胞中CDH13基因甲基化状态,半定量RT-PCR法检测用药前后细胞中CDH13 mRNA表达变化。结果 KYSE220中CDH13启动子区发现甲基化现象,应用5-Aza-dC使CDH13基因启动子区CpG岛去甲基化,经药物处理癌细胞后其CDH13 mRNA表达较前明显增强。结论去甲基化制剂5-Aza-dC能逆转CDH13基因甲基化状态,从而调控CDH13基因表达。     

荧光定量聚合酶链反应检测miR-342-3p及靶基因EVL在多发性骨髓瘤细胞中的表达

目的研究多发性骨髓瘤(MM)患者中miR-342-3p及靶基因EVL的表达情况及意义。方法建立应用颈环式结构引物反转录扩增微小RNA(miRNA)的反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法 ,并采用荧光定量聚合酶链反应(RQ-PCR)对miR-342-3p及靶基因EVL的表达进行定量分析。结果①5例MM患者中miR-342-3p相对表达量为7.6±5.7,与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。②MM细胞株U266中miR-342-3p相对表达量为7.0±3.2,较对照组表达增加,差异有统计学意义(P<0.05)。③5例MM患者中EVL基因相对表达量为6.3±3.2,较对照组表达增加,差异有统计学意义(P<0.05)。④MM细胞株U266中EVL基因相对表达量为4.3±1.1,较对照组表达增加,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 MM存在miR-342-3p及EVL基因表达异常,可能为研究MM发病机制提供思路。     

吗啡急性处理小鼠的微阵列数据分析和生物标记识别

目的通过生物信息学方法,识别吗啡急性处理小鼠的差异表达基因及其富集的通路。方法从高通量基因表达数据库(Gene Expression Omnibus)下载吗啡急性处理小鼠的微阵列数据,并调用R语言3.1.0软件的质量控制包Affy QCReport 1.42.0对数据样本进行质量控制分析,运用R语言的微阵列数据线性模型识别吗啡处理前后的差异表达基因,采用表达分析系统检测算法进行差异表达基因的通路富集分析。结果吗啡急性处理小鼠的微阵列基因表达数据具有良好的均一性和阵列强度相似性,识别得到Gm11627、Zfand4、Zbtb16、Pkp2和Plin4等481个差异表达基因和癌症、黑素原生成和丝裂原活化蛋白激酶信号等8条代谢通路。结论所识别的差异表达基因和代谢通路成为吗啡急性处理小鼠潜在的生物标记。     

二甲双胍对大鼠垂体-性腺轴钙调蛋白mRNA表达的影响

目的研究二甲双胍(metformin,MF)对大鼠垂体—性腺轴钙调蛋白(calmodulin,CaM)mRNA表达的影响。方法采用实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术,系统观察MF对大鼠垂体—性腺轴钙调蛋白mRNA表达的影响。结果MF270mg·kg-1·d-1,ig,连续给药21d,可抑制大鼠睾丸细胞CaM mRNA的表达(P<0.01),而对垂体分泌细胞CaM mRNA的表达则无明显影响。结论二甲双胍可抑制大鼠睾丸细胞CaM mRNA的表达。     

应用基因芯片技术研究非毒性结节性甲状腺肿基因表达的初步研究

目的筛查非毒性结节性甲状腺肿（NTNG）相关基因,探讨NTNG发生机制。方法分别抽提NTNG患者甲状腺组织及正常甲状腺组织总RNA,逆转录合成相应以Cy5和Cy3标记的探针与基因表达谱芯片进行杂交,扫描芯片荧光信号图像,用对扫描图像进行数字化处理和分析。利用实时荧光定量PCR技术对筛选出的部分表达差异明显的基因进行验证。结果筛选出表达差异明显的基因48个,其中NTNG组中表达上调的基因36条,表达下调的基因12条。荧光定量PCR结果与基因芯片一致。结论NTNG患者甲状腺组织与正常甲状腺组织之间存在明显的基因表达差异,为NTNG患者提供相当数量的与细胞外基质、细胞因子、受体信号转细胞信号传递等相关的差异表达基因,为NTNG早期诊断和治疗提供了线索。     

岗田酸促癌作用过程中对Balb/c 3T3细胞凋亡的影响

目的初步探讨促癌物岗田酸(OA)在促进Balb/c 3T3细胞转化过程中对细胞凋亡的影响及其分子机制。方法以N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍(MNNG)为启动剂,OA为促癌剂,建立Balb/c 3T3细胞转化模型。台盼蓝染色法检测OA的细胞毒性,AnnexinⅤ-FITC/PI双染色流式细胞术检测细胞凋亡率,小鼠毒理基因芯片分析OA促癌作用过程中的基因表达变化,同时采用荧光定量RT-PCR方法验证部分基因的表达情况。结果MNNG 1 mg.L-1启动后,7.8μg.L-1OA持续处理能促进Balb/c3T3细胞的转化。OA处理3,5和7 d后细胞存活率降低,同时细胞凋亡率显著升高;基因表达谱分析显示,Bnip3,Cycs和caspase3等细胞凋亡相关基因以及Gstp2,Txn1和Prdx1等抗氧化基因的表达发生明显改变。RT-PCR检测显示OA处理3,7 d时,SPP1和Txn1基因的表达变化与芯片检测结果相似。结论OA在促癌过程能诱导Balb/c 3T3细胞凋亡,影响线粒体凋亡通路相关基因和抗氧化基因的表达。     

低浓度N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍对HeLa细胞DNA聚合酶及拓扑异构酶Ⅱα mRNA表达水平的影响

利用定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法， 研究了低浓度甲基硝基亚硝基胍(MNNG)对HeLa细胞DNA聚合酶(Polα,β,δ,ε)及拓扑异构酶Ⅱα(TopⅡα) mRNA表达水平的影响. 发现经0.2 μmol·L^-1 MNNG 处理2.5 h后，HeLa细胞Polβ mRNA水平在6-24 h内升高约1倍，而Polα,δ,ε及TopIIα mRNA水平则无明显改变. 提示Polβ mRNA水平改变可能参与MNNG诱发细胞遗传不稳定的发生.     

雷公藤甲素对Wistar大鼠免疫毒性相关基因表达的影响

目的应用基因芯片技术研究雷公藤甲素对大鼠胸腺全基因表达谱的影响,从基因水平探讨雷公藤甲素引起免疫抑制毒性的潜在分子作用机制。方法 Wistar大鼠,连续28 d ig给予雷公藤甲素0.5和1.0 mg·kg-1以及环孢素A 20 mg·kg-1(阳性对照),进行T细胞依赖抗体反应检测、免疫器官组织病理学检查和胸腺组织基因芯片实验。结果与溶媒对照组相比,雷公藤甲素0.5和1.0 mg·kg-1组和环孢素A组大鼠血清中T细胞依赖抗体应答水平均受到了显著抑制。组织病理学检查发现,雷公藤甲素1.0 mg·kg-1使胸腺皮髓质淋巴细胞数量轻度减少,环孢素A使胸腺髓质皮质化。基因芯片检测结果显示,雷公藤甲素1.0 mg·kg-1给药第7天引起422个显著差异表达基因,其基因功能主要涉及DNA依赖的细胞转录调节、核转运、微管蛋白复合体装配、核小体装配、线粒体DNA转录、氨基酸转运和线粒体DNA复制等。KEGG通路分析发现差异表达基因主要参与移植排斥和自身免疫性疾病等多个与免疫抑制相关的基因表达调控途径。结论雷公藤甲素1.0 mg·kg-1能够引起大鼠胸腺基因表达谱的显著性改变,其免疫毒性的主要机制可能是通过下调免疫毒性相关基因的表达,抑制淋巴细胞的增殖。     

Application of RT-PCR in formalin-fixed and paraffinembedded lung cancer tissues

Aim:

To analyze gene expression in formalin-fixed, paraffin-embedded lung cancer tissues using modified method.

Methods:

Total RNA from frozen tissues was extracted using TRIZOL reagent. RNA was extracted from formalin-fixed, paraffin-embedded tissues by digestion with proteinase K before the acid-phenol:chloroform extraction and carrier precipitation. We modified this method by using a higher concentration of proteinase K and a longer digestion time, optimized to 16 hours. RT-PCR and real-time RT-PCR were used to check reproducibility and the concordance between frozen and paraffin-embedded samples.

Results:

The results showed that the RNA extracted from the paraffin-embedded lung tissues had high quality with the most fragment length between 28S and 18S bands (about 1000 to 2000 bases). The housekeeping gene GUSB exhibited low variation of expression in frozen and paraffin-embedded lung tissues, whereas PGK1 had the lowest variation in lymphoma tissues. Furthermore, real-time PCR analysis of the expression of known prognostic genes in non-small cell lung carcinoma (NSCLC) demonstrated an extremely high correlation (r>0.880) between the paired frozen and formalin-fixed, paraffin-embedded specimens.

Conclusion:

This improved method of RNA extraction is suitable for real-time quantitative RT-PCR, and may be used for global gene expression profiling of paraffin-embedded tissues.     

DNA微矩阵芯片检测沙利度胺对HepG2细胞基因表达谱的影响

目的　从整个细胞基因组表达变化的角度 ,研究沙利度胺 (Tha)对基因表达谱的影响 ,揭示发育毒性药物的致畸机制。方法　用载有 8192条基因的DNA微矩阵芯片 ,检测在 11.6μmol·L- 1的Tha作用4 2h后 ,HepG2细胞基因表达谱的变化。结果有 19条基因的表达有明显变化 ,其中 17条基因表达下调 ,2条基因表达上调。下调基因中有多条为转录调控和胚胎发育相关基因 ,上调的基因中有DNA修复相关基因和线粒体功能相关的基因。结论　Tha能影响若干基因转录和胚胎发育基因的表达 ,可能与其发育毒性机制相关 ,为发展新的发育毒性药物评价方法提供了有利基础     

Identification of Differentially Expressed Genes with Multivariate Outlier Analysis

Abstract

DNA microarray offers a powerful and effective technology to monitor the changes in the gene expression levels for thousands of genes simultaneously. It is being widely applied to explore the quantitative alternation in gene regulation in response to a variety of aspects including diseases and exposure of toxicant. A common task in analyzing microarray data is to identify the differentially expressed genes under two different experimental conditions. Because of the large number of genes and small number of arrays, and higher signal-noise ratio in microarray data, many traditional approaches seem improper. In this paper, a multivariate mixture model is applied to model the expression level of replicated arrays, considering the differentially expressed genes as the outliers of the expression data. In order to detect the outliers of the multivariate mixture model, an effective and robust statistical method is first applied to microarray analysis. This method is based on the analysis of kurtosis coefficient (KC) of the projected multivariate data arising from a mixture model so as to identify the outliers. We utilize the multivariate KC algorithm to our microarray experiment with the control and toxic treatment. After the processing of data, the differential genes are successfully identified from 1824 genes on the UCLA M07 microarray chip. We also use the RT-PCR method and two robust statistical methods, minimum covariance determinant (MCD) and minimum volume ellipsoid (MVE), to verify the expression level of outlier genes identified by KC algorithm. We conclude that the robust multivariate tool is practical and effective for the detection of differentially expressed genes.