携带Oct4、Klf4、Sox2、c-myc和EGFP基因小鼠肿瘤细胞株的建立

目的构建稳定携带Oct4、Klf4、Sox2、c-myc（以下简称为OKSM）和增强型绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein,EGFP）基因的小鼠肿瘤细胞株。方法将载体pLentG-KOSM用NotI、XbaI线性化,并进行聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）,以鉴定其结构。按Invitrogen公司推荐的标准程序进行慢病毒包装和确认慢病毒是否成功生产;携带OKSM和EGFP基因的慢病毒感染小鼠肝癌细胞（Hep1-6）、小鼠乳腺癌细胞（4T1）和小鼠肺癌细胞（LLC）,以建立相应病毒感染体系。结果 pLentG-KOSM确实含有OKSM4种基因,按标准程序生产的携带OKSM和EGFP基因的慢病毒上清高效率感染Hep1-6、4T1及LLC,成功建立稳定携带OKSM和EGFP基因的小鼠肿瘤细胞株。结论成功构建携带OKSM和EGFP基因的Hep1-6、4T1、LLC细胞株,为相关的后续研究打下了良好基础。     

人脐带间充质干细胞表达胚胎干细胞相关转录因子

背景：Nanog、Oct4和Sox2通过调节胚胎干细胞的基因转录,对其多潜能性和自我更新的能力具有关键性的调控作用,脐带间充质干细胞中这些胚胎干细胞相关转录因子的表达情况如何还不太清楚。 目的：研究脐带间充质干细胞中Nanog、Oct4和Sox2等这些胚胎干细胞相关转录因子的表达情况。 方法：胶原酶和胰酶消化法培养脐带间充质干细胞;mTeSRTM1体系进行无滋养层培养人胚胎干细胞,定量PCR比较上述两种细胞中Nanog、Oct4和Sox2 mRNA表达量的差异;免疫荧光检测上述两种细胞中Nanog、Oct4和Sox2的表达情况。 结果与结论：间充质干细胞表达胚胎干细胞标记Nanog、Oct4和Sox2,但Oct4主要表达在胞浆,且以Oct4B为主。脐带间充质干细胞Nanog、Oct4A和Sox2的表达量明显低于胚胎干细胞,其mRNA表达量分别为胚胎干细胞的20%,0.3%,10%左右。通过了解两种细胞Nanog、Oct4和Sox2的表达差异,可为优化脐带间充质干细胞重编程提供依据,也为进一步研究胚胎干细胞相关转录因子在成体干细胞表达起何种作用提供参考。     

干细胞相关因子在大肠癌组织及SW620细胞株的表达

背景：肿瘤细胞有多种干细胞标记的表达,深入研究其表达规律有助于揭示肿瘤发病机制、完善肿瘤干细胞理论。 目的：检测大肠癌实体组织中干细胞相关分子标记CD133、CD166、Oct4、Sox2、C-myc、Klf4、Bmi-1与癌旁组织的表达差异,以及CD133免疫磁珠分选阳性与阴性SW620细胞中上述基因的表达差异。 方法：选临床病理诊断清楚的29例大肠癌组织标本提取RNA,RT-PCR检测CD133、CD166、Oct4、Sox2、C-myc、Klf4、Bmi-1在大肠癌组织与癌旁对照组织中的表达。CD133免疫磁珠分选SW620,提取CD133细胞与CD133阴性细胞RNA,RT-PCR检测分选后上述基因的表达差异。 结果与结论：29例标本均诊断为低、中分化腺癌或黏液腺癌,干细胞相关分子标记癌组织与癌旁组织表达灰度相对值癌组织表达均高于癌旁组织(P < 0.05)。RT-PCR检测分选后CD133⁺细胞CD133,CD166,Oct4,Sox2,C-myc,Klf4,Bmi-1表达,结果均高于CD133^-细胞。提示,CD133、CD166、Oct4、Sox2、C-myc、Klf4、Bmi-1相关干细胞标记可作为大肠癌肿瘤干细胞标记并有望用于诊断检测。     

胰腺癌组织中EGFR和CD31的表达及其临床意义

目的 探讨EGFR和CD31在胰腺癌组织中的表达及其临床意义.方法 应用免疫组化SP法检测EGFR和CD31蛋白在88例胰腺导管腺癌(pancreatic ductal adenocarcinoma,PDAC)和11例正常胰腺组织中的表达水平,并计算肿瘤组织微血管密度(microvessel density,MVD),分析其与胰腺癌临床分期及其与预后的关系.结果 PDAC组织中EGFR的表达明显高于正常胰腺组织(P<0.001);PDAC组织中MVD明显高于正常胰腺组织(P<0.001);胰腺癌组织中EGFR的表达与淋巴结有无转移及临床分期密切相关(P<0.05);胰腺癌组织中微血管密度与其有无淋巴结转移密切相关(P<0.05).结论 EGFR和CD31在PDAC组织中的表达明显高于正常胰腺组织;并且与胰腺癌的临床分期和淋巴结转移相关,联合检测有助于判断胰腺癌患者的预后.     

三阴性乳腺癌中EpCAM和Sox2的表达及临床意义

目的：探讨 EpCAM 和 Sox2在三阴性乳腺癌( triple negative breast cancer, TNBC)中的表达及临床意义。方法采用免疫组化SP法检测EpCAM和Sox2在81例TNBC、71例非三阴性乳腺癌( non-triple-negative breast cancer, non-TN-BC)、20例癌旁正常乳腺组织中的表达。结果 TNBC组织中EpCAM、Sox2的阳性过表达率分别为74.1%、54.3%,均高于正常乳腺组织(15.0%和0)(P<0.05);EpCAM蛋白过表达与TNBC 的组织学分级、淋巴结转移呈正相关( P <0.05);Sox2蛋白表达与TNBC淋巴结转移、pTNM分期呈正相关( P<0.05)。 EpCAM 和 Sox2蛋白表达可能具有相关性。结论 EpCAM和Sox2蛋白在TNBC中均高表达,可能具有促癌作用及与淋巴结转移相关。     

胰腺癌组织中SERPINB5的表达及意义

目的探讨SERPINB5在胰腺癌中的表达及其临床意义。方法利用组织芯片技术及免疫组化SP法检测SERPINB5在胰腺癌、癌旁组织与慢性胰腺炎组织中的表达,分析它与胰腺癌的临床病理指标间的相关性。结果 47例胰腺癌组织中SERPINB5的阳性表达率为85.11%(40/47),而16例癌旁及慢性胰腺炎组织中SERPINB5的阳性表达率为25%(4/16),两者比较差异有统计学意义(P<0.05);SERPINB5在胰腺癌组织中的表达与患者性别、年龄、肿瘤部位、肿瘤组织学类型及神经浸润均无关(P均>0.05)。结论 SERPINB5阳性表达与胰腺癌相关,提示SERPINB5可能在胰腺癌的发生、发展中起重要作用。     

石蜡包埋胰腺癌组织中DPC4基因改变的检测

目的 研究石蜡包埋胰腺癌组织中ＤＰＣ４基因的改变。方法 用聚合酶链反应－单链构象多态性分析（ＰＣＲ－ＳＳＣＰ）银染技术检测４６例石蜡包埋胰腺癌组织中ＤＰＣ４基因的缺失和突变。结果 ＤＰＣ４基因第１、２、３、４、８和１１外显子的纯合性缺失率为１３／４６（２８．３％）,具体分布为１例在第１１外显子;１例在第１、２、３、４、８和１１外显子的纯合性缺失率为１３／４６（２８．３％）,具体分布为１例在第１１外     

干细胞关键转录因子Oct-4在宫颈癌上的表达及意义

目的探讨Oct-4蛋白在宫颈癌上的表达情况,明确其与宫颈癌患者临床资料的相关性及意义。方法应用免疫组化SP法,检测Oct-4在40例宫颈癌组织、30例宫颈上皮内瘤变（CIN）组织、10例正常宫颈组织的表达情况。结果 Oct-4蛋白在宫颈癌、CIN、正常宫颈的表达分别为92.5%（37/40）、36.7%（11/30）、0%（0/10）,差异有显著性统计学意义（P〈0.01）。宫颈癌上Oct-4蛋白的表达与患者的年龄、病理类型、TNM分期无明显相关性（P〉0.05）,而与宫颈癌的分化程度相关（P〈0.05）。结论初步认为Oct-4蛋白可作为宫颈癌干细胞的表面标志物,为宫颈癌的靶向治疗提供研究方向。     

乳腺癌中转录因子DLX4与EMT相关蛋白的表达及意义

目的 探讨转录因子DLX4与上皮细胞-间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)相关蛋白在乳腺癌组织和乳腺细胞系中的表达及其相关性。方法 收集100例乳腺癌及对应癌旁组织标本,采用免疫组化SP法和Western blot法检测乳腺癌组织和乳腺细胞系中DLX4与EMT相关蛋白E-cadherin和vimentin的表达,并分析三者与乳腺癌临床病理特征的关系。结果 乳腺癌组织中DLX4和vimentin阳性率(68.0%和53.0%)显著高于癌旁组织(22.0%和28.0%)(P0.05),乳腺癌组织中E-cadherin阳性率(32.0%)显著低于癌旁组织(76.0%)(P0.05)。Western blot法检测结果显示,在高侵袭性乳腺癌细胞系中DLX4、vimentin均呈高表达,E-cadherin呈低表达;DLX4、E-cadherin及vimentin的表达与乳腺癌TNM分期和淋巴结转移相关。Spearman相关分析结果显示,乳腺癌中DLX4与E-cadherin表达呈负相关(r_s=-0.505,P=0.000),DLX4与vimentin表达呈正相关(r_s=0.165,P=0.016)。结论 乳腺癌中转录因子DLX4与E-cadherin表达呈负相关,与vimentin表达呈正相关,可能存在调控关系,从而促进乳腺癌的局部侵袭和远处转移。     

携带人Oct4和EGFP基因慢病毒表达载体构建

目的构建携带人Oct4和EGFP基因的慢病毒表达载体pFUOGW。方法SacⅡ线性化pLenti-EF1a-Oct4-IRES-EGFP,回收片段并补平SacⅡ切口,接着BamHⅠ酶切该片段,回收2.565kb片段而获连接用Oct4-IRES-EGFP;EcoRⅠ线性化pFUGW,回收并补平EcoRⅠ切口,然后BamHⅠ酶切该片段,回收9.174kb片段获连接用载体片段,最后使用DNA连接试剂盒（TaKaRa）中的SolutionⅠ将其与连接用Oct4-IRES-EGFP连接,连接产物转化,次日挑选单菌落,提取质粒并行酶切鉴定。所构建载体命名为pFUOGW。获pFUOGW后,按Invitrogen公司推荐的标准程序进行慢病毒包装和确认慢病毒是否成功生产;携带Oct4和EGFP基因的慢病毒感染293FT细胞和鼻咽癌细胞株C666-1、CNE1和6-10B以建立相应病毒感染体系。结果酶切鉴定证实成功构建了pFUOGW,按标准程序生产的携带Oct4和EGFP基因的慢病毒上清高效率感染鼻咽癌细胞株C666-1、CNE1和6-10B。结论成功构建携带人Oct4和EGFP基因的慢病毒表达载体pFUOGW,为相关后续的研究打下良好的基础。     

口腔鳞状细胞癌组织中HPV感染及EGFR、Sox2蛋白表达与肿瘤预后的相关性

目的探讨口腔鳞状细胞癌(oral squamous cell carcinoma,OSCC)组织中人乳头状瘤病毒(human papiloma virus,HPV)感染及EGFR、Sox2表达与肿瘤复发的关系。方法收集OSCC组织标本85例,分别采用PCR-DNA反向点杂交及免疫组化SP法检测蜡块组织中HPV感染及EGFR、Sox2表达,收集患者病理资料并进行随访。结果 HPV在OSCC组织中的检出率为29.4%(25/85),阳性患者以非吸烟者居多,高于阴性患者(P0.001)。HPV感染与患者性别、年龄、肿瘤部位、临床分期、分级及淋巴结转移无明显相关性(P0.05);EGFR、Sox2的阳性率分别为69.4%(59/85)、71.8%(61/85);EGFR表达与肿瘤分化程度有关(P0.001);Sox2表达与肿瘤分化程度及TNM分期有关(P0.001、P0.009)。随访2年以上的OSCC患者中17例出现复发(复发组),HPV阳性患者治疗后复发率为5.9%(1/17),低于HPV阴性患者(P=0.037);EGFR、Sox2蛋白在复发组和未复发组中阳性率分别为88.2%、94.1%及64.7%、66.2%;Sox2蛋白在复发组中的阳性率明显高于未复发组(P=0.047)。结论 OSCC中存在一定比例的HPV感染及EGFR、Sox2表达;HPV阳性患者复发率低于阴性患者;EGFR表达与肿瘤分级有关;Sox2表达与肿瘤分级、TNM分期及复发相关。HPV阴性、EGFR及Sox2阳性患者治疗后应定期随诊。     

结直肠腺癌组织中CD44+/Oct4+癌干细胞的形态及分布

背景：越来越多的证据显示CD44可作为结直肠腺癌干细胞的一个特异性的标志物,近年发现胚胎干细胞转录因子Oct4在结直肠腺癌中有表达。 目的：观察CD44⁺/Oct4⁺细胞在原发性结直肠腺癌组织中的数量、位置及分布方式。 方法：取108例结直肠腺癌、18例癌旁正常肠黏膜组织及18例伴不典型增生的结直肠腺瘤标本制成48点共3块组织芯片,应用免疫组织化学双重染色和苏木精-伊红染色,定位CD44⁺/Oct4⁺肿瘤细胞,观察计数并在苏木精-伊红切片的对应位置上观察其形态特征。 结果与结论：免疫组织化学双重染色结果显示,癌旁正常肠黏膜中未见CD44⁺/Oct4⁺细胞,在伴不典型增生的腺瘤中可见极少量CD44⁺/Oct4⁺细胞,结直肠腺癌中可见到少量CD44⁺/Oct4⁺细胞。双阳性细胞主要分布在腺管样结构基底膜侧或共壁腺体的共壁侧,呈小灶状或散在点状分布;细胞呈卵圆形或立方状,胞浆稀少,胞核规则,均质深染,呈卵圆形或高柱状。其数量与结直肠癌分化程度呈负相关(r=-0.579,P < 0.01),与肿瘤浸润深度有一定关联(r=0.236,P < 0.05)。结果提示CD44⁺/Oct4⁺细胞可能是结直肠腺癌干细胞。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞;骨髓干细胞;造血干细胞;脂肪干细胞;肿瘤干细胞;胚胎干细胞;脐带脐血干细胞;干细胞诱导;干细胞分化;组织工程全文链接：     

胰腺癌中CXCR-4和MMP-2的表达及其临床意义

目的 探讨CXCR-4和MMP-2在胰腺癌中的表达及其临床意义和互相关系.方法 采用免疫组化PV6000法检测47例胰腺癌组织中CXCR-4和MMP-2的表达.结果 47例胰腺癌组织中CXCRd及MMP-2的阳性率分别为72.3%、66.0%,二者均与胰腺癌的转移、临床分期和预后有关(X2值7.26～12.69,P<0.05).CXCR-4和MMP-2阳性表达率与胰腺癌大小、性别、年龄和组织学分级无关(x2值0.03～4.27,P>0.05).胰腺癌组织中CXCR-4的表达与MMP-2的表达呈正相关(r=0.587,P<0.01).结论 CXCR-4可能通过上调MMP-2的表达,共同促进胰腺癌的浸润和转移;CXCR-4及MMP-2可作为判断胰腺癌生物学行为的指标.     

胰腺癌组织中IL-8的表达及其临床病理意义

目的: 研究胰腺癌组织中IL-8表达并探讨其临床病理意义.方法: 胰腺癌手术切除标本51例经4 g/L甲醛固定后常规制作石蜡包埋切片, 染色为ABC免疫组化法.结果: 胰腺癌组织中IL-8阳性率及其评分明显低于低分化、无转移病例.其中分化程度、转移状况之间均有统计学差异(P<0.05).IL-8与胰腺癌其他临床病理牲无明显关系(P>0.05).结论: IL-8表达可能是反映胰腺癌发生、发展、生物学行为和预后的重要标记物.     

胰腺癌组织中内分泌细胞及其意义研究

４２例胰腺癌嗜银和亲银染色发现１９例４５．２％含内分泌细胞（ＥＣ），其中ＥＣ阳性率≥５０％４例；高分化腺癌ＥＣ阳性率（５／２０例，２５％）低于中、低分化腺癌（１２／１９例，６３．２％）和粘液癌（２／２例，１００％），组织学分级Ｉ级病例ＥＣ阳性率（５／１８例，２７．８％）低于Ⅲ级病例（７／８例，８７．５％）；ＥＣ阳性病例间质肥大细胞数明显高于ＥＣ阴性病例；发生转移病例ＥＣ阳性率（８／１４例，５７．１     

胰腺导管癌干细胞抗原PSCA和Oct-4表达及意义

目的研究胰腺导管癌、癌旁上皮及慢性胰腺炎组织中前列腺干细胞抗原（PSCA）和Oct-4表达及探讨其临床病理意义。方法51例胰腺导管癌、20例癌旁上皮及10例慢性胰腺炎手术切除标本常规石蜡包埋切片,PSCA和Oct-4染色方法为EnVision两步法。结果胰腺导管癌PSCA和Oct-4阳性表达率（52．9％,47.1％）明显高于癌旁上皮（25.0％,20,0％）和慢性胰腺炎（10．0％,10.0％）,差异均有显著性意义（P〈0．05）。高分化腺癌和无转移胰腺导管癌PSCA和Oct-4表达阳性率明显低于低分化腺癌和转移病例（P〈0.05）。结论PSCA和Oct-4表达可能是反映胰腺导管癌发生、进展及预后的重要癌干细胞抗原。     

携带GFP的慢病毒感染人脐带间充质干细胞及其对Oct4表达的影响

目的 将携带绿色荧光蛋白(GFP)的慢病毒感染人脐带间充质干细胞(hUCMSCs),并观察其对Oct4表达的影响.方法 采用组织块贴壁法分离、培养hUCMSCs,流式细胞仪检测细胞表面标志物；利用含GFP的慢病毒,以不同感染复数(MOI值)感染hUCMSCs,荧光显微镜下观察GFP的表达情况,并用流式细胞仪检测GFP的阳性率,确定最佳MOI值；实验分为未感染组和感染组；MTT法检测感染慢病毒后对细胞增殖的影响；GFP慢病毒感染hUCMSCs后体外持续培养2周和8周,采用定量RT-PCR (qRT-PCR)和免疫荧光染色检测细胞中Oct4的表达变化.结果 体外培养出的hUCMSCs呈长梭形成纤维细胞样,第3代细胞高表达CD29、CD105和CD90,低表达CD34、CD45；荧光显微镜观察在感染96 h后荧光表达最强；当以MOI=20感染细胞96 h后,GFP阳性率达75％以上；与未感染组相比,MTT显示GFP慢病毒对细胞增殖没有明显影响(P＞0.05)；qRT-PCR检测Oct4在培养2周和8周的细胞中相对表达量分别为0.9075 ±0.0124和0.8600 ±0.0135；免疫荧光染色显示Oct4在培养2、8周中均有表达且定位于胞核.结论 慢病毒携带的GFP基因能够表达于hUCMSCs中,且不影响Oct4的表达.     

5-氟尿嘧啶对乳腺癌MCF7细胞中干细胞相关基因Oct4、Bmi-1表达的影响*

背景：国内外研究证明乳腺癌干细胞可能是起始乳腺癌生长及辅助治疗后复发和远处转移的根源。 目的：观察5-氟尿嘧啶对人乳腺癌MCF7细胞Oct4、Bmi-1表达的影响。 方法：应用0.1 mg/L 5-氟尿嘧啶处理MCF7,RT-PCR检测处理前G0及处理后6代细胞G1~G6中Oct4、Bmi-1 mRNA的表达,免疫细胞化学检测处理前G0、G1~G5中Oct4的表达。 结果与结论：5-氟尿嘧啶处理后,Oct4、Bmi-1 mRNA表达水平在G3和G5均较处理前明显增高,OCT4蛋白表达呈现出降低-升高-更高-降低-升高的趋势。提示MCF7中可能存在肿瘤干细胞样细胞;5-氟尿嘧啶可能诱导MCF7中肿瘤干细胞样细胞的数量或比例增加。 关键词：乳腺癌;5-氟尿嘧啶;MCF7细胞;Oct4;反转录酶-聚合酶链反应;免疫细胞化学 doi:10.3969/j.issn.1673-8225.2012.10.025