抑制MMP-9表达与大鼠氧糖剥夺后星形胶质细胞AQP4的表达变化

目的探讨抑制星形胶质细胞基质金属蛋白酶(MMP)-9表达与氧糖剥夺后水通道蛋白(AQP)4的表达变化。方法体外培养原代星形胶质细胞,建立氧糖剥夺缺血细胞模型,随机分为正常组、阴性对照组和MMP-9抑制组。应用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法测定细胞存活率,利用慢病毒转染抑制MMP-9的表达,实时荧光定量RT-PCR验证MMP-9的表达,通过实时荧光定量RT-PCR和免疫印迹分别检测星形胶质细胞AQP4的表达变化。结果细胞经氧糖剥夺处理后,细胞存活率显著下降(P0.05);MMP-9抑制组星形胶质细胞与阴性对照组相比,MMP-9 mRNA表达显著下调(P0.05),AQP4 mRNA和蛋白表达均显著下降(P0.05)。结论氧糖剥夺使星形胶质细胞活性下降,抑制MMP-9的表达可介导AQP4表达下调,提示MMP-9和AQP4可能共同参与缺血性脑水肿的形成。     

转录因子c-Jun对人血管平滑肌细胞增殖的调控作用及其机制的实验研究

目的:通过下调和上调c-Jun在人血管平滑肌细胞(hVSMCs)中的表达,研究c-Jun对hVSMCs增殖的调控作用及其机制。方法:(1)l-Jun基因低表达实验:体外培养hVSMCs,将细胞分为空白对照组、阴性对照组(转染阴性对照siRNA)和siRNA干扰组(转染靶向c-Jun的siRNA)三组,用构建好的siRNA转染各组细胞并培养24 h。(2)c-Jun基因过表达实验:体外培养hVSMCs,将细胞分为空白对照组、阴性对照组(转染阴性对照病毒载体)和慢病毒组(转染过表达c-Jun的慢病毒载体)三组,用构建好的慢病毒转染各组细胞并培养48 h。完成上述的细胞转染后,光镜观察各组细胞的生长情况,加入CCK-8试剂检测各组细胞的OD值。Western Blot检测c-Jun基因、线粒体融合基因2(Mfn2)的表达以及RAS-RAF-MEK-ERK1/2信号通路蛋白的表达。结果:siRNA干扰c-Jun表达后,与阴性对照组(1.301±0.027)或空白对照组(1.223±0.016)相比,siRNA干扰组(1.759±0.023)的OD值显著增加(P0.05),Mfn2的表达下调,RAS、RAF、MEK以及ERK1/2蛋白的表达显著增加(P0.05)。相反,慢病毒过表达c-Jun后,与阴性对照组(1.660±0.009)或空白对照组(1.862±0.123)相比,慢病毒组(1.101±0.101)的OD值显著减少(P0.05),Mfn2的表达上调,RAS、RAF、MEK以及ERK1/2蛋白的表达显著减少(P0.05)。结论:c-Jun可能通过调控Mfn2-RAS-RAF-MEK-ERK1/2信号通路调节hVSMCs的增殖。     

小干扰RNA对川崎病血清诱导血管内皮细胞基质金属蛋白酶-9表达的影响

目的 观察川崎病急性期血清对血管内皮细胞摹质金属蛋白酶-9(MMP-9)表达的影响以及MMP-9小干扰RNA(siRNA)对上述过程的调节作用.方法 构建MMP-9 siRNA质粒,脂质法转染血管内皮细胞(ECV-304).ECV-304细胞培养分为川崎病血清+siRNA阴性对照组、正常血清组、川崎病血清+MMP-9 siRNA1组、川崎病血清+MMP-9 siRNA2组、川崎病血清+人血丙种球蛋白组、川崎病血清组.应用逆转录聚合酶链式反应检测MMP-9 mRNA的表达,免疫印迹法检测MMP-9蛋白的表达.结果 川崎病血清组和川崎病血清+siRNA阴性对照组的MMP-9 mRNA、MMP-9蛋白表达分别是2.49±0.03、1.20±0.04和2.45±0.03、1.15±0.03,均较正常血清组(1.21±0.03、0.52±0.03)明显增高(均P<0.01).川崎病血清+MMP-9 siRNA1组(0.78±0.03、0.31±0.02)、川崎病血清+MMP-9 siRNA2组(0.74±0.04、0.28±0.04)及川崎病血清+人血丙种球蛋白组(1.58±0.03、0.88±0.04)的MMP-9 mRNA、MMP-9蛋白表达与川崎病血清组及川崎病血清+siRNA阴性对照组比较均明显减少(均P<0.01).结论 川崎病急性期血清能诱导血管内皮细胞的MMP-9表达增高,可能参与川崎病冠状动脉损伤的发生.构建的MMP-9 siRNA能显著抑制MMP-9 mRNA和蛋白的表达.     

沉默CXCR4基因对食管鳞癌EC-9706细胞中MMP-9基因表达的影响

目的:探讨在食管鳞癌EC-9706细胞中沉默CXCR4基因对MMP-9基因表达的影响,为阐明CXCR4基因在食管鳞癌侵袭转移中的作用提供实验依据.方法:化学合成2条靶向CXCR4基因的siRNA1和siRNA2,同时设立荧光标记阴性对照和空白对照.脂质体法转染入EC-9706细胞,荧光显微镜下观察转染效率.转染48h后,半定量RT-PCR检测各组细胞CXCR4和MMP-9基因mRNA表达的变化,Western blot检测各组细胞CXCR4和MMP-9基因蛋白表达的变化,侵袭小室检测各组细胞穿膜细胞数的变化,MTT检测各组细胞的A值.结果:与阴性对照和空白对照相比,转染CXCR4siRNA1和siRNA2组细胞CXCR4mRNA和蛋白的表达明显降低,差异具有统计学意义(P<0.05);同时与阴性对照和空白对照相比,转染CXCR4siRNA1和siRNA2组细胞MMP-9mRNA和蛋白的表达同样明显降低,差异具有统计学意义(P<0.05);转染CXCR4siRNA1和siRNA2组细胞穿膜细胞数与阴性对照和空白对照相比明显下降,差异具有统计学意义(P<0.05);MTT结果显示转染CXCR4siRNA1和siR...     

miR-34a在结肠癌细胞增殖和迁移中的作用及其分子机制

目的探讨miR-34a在结肠癌细胞增殖和迁移中的作用,并验证其靶点蛋白。方法传代培养人结肠癌细胞株HCT-116,分别采用空病毒载体(pRI-CMV-GFP)转染(阴性对照组)、慢病毒载体(pRI-CMV-GFP-miRNA-34a)转染(慢病毒组),另选未经任何处理的HCT-116细胞作为空白对照组。采用Real-time PCR法检测miR-34a的相对表达量,采用MTT实验、Transwell小室法检测HCT-116细胞增殖和迁移能力,采用细胞免疫荧光试验和Western blotting法验证其靶点蛋白。结果以空白对照组miR-34a表达为1,阴性对照组为1.03±0.09,慢病毒组为6.41±1.56,慢病毒组高于阴性对照组及空白对照组(P均<0.01),证实慢病毒转染成功。与空白对照组、阴性对照组比较,慢病毒组细胞增殖和迁移能力显著下降(P均<0.01)。细胞免疫荧光试验显示,慢病毒组细胞c-Met的荧光强度显著降低,而空白对照组与阴性对照组无明显变化。Western blotting结果显示,慢病毒组c-Met及磷酸化c-Met表达均低于阴性对照组、空白对照组(P均<0.01)。结论过表达miR-34a可抑制结肠癌细胞增殖及迁移,并下调靶点蛋白c-Met及磷酸化c-Met表达,提示miR-34a可作为结肠癌治疗的分子靶点。     

U0126及地塞米松对氨培养SD乳鼠脑星形胶质细胞AQP4表达的影响

目的观察氨培养的脑星形胶质细胞水通道蛋白4(AQP4)的表达,地塞米松及丝裂原活化蛋白激酶(MAPKs)信号转导通路抑制剂U0126对其表达的影响。方法分离、培养SD大鼠脑星形胶质细胞,分为氨培养组、氨培养+U0126组、氨培养+地塞米松组和正常对照组,采用免疫组织化学及逆转录聚合酶链式反应检测AQP4在蛋白和基因水平的表达和变化。结果氨可致培养的星形胶质细胞AQP4蛋白和AQP4 mRNA的表达增加。U0126和地塞米松均可使氨培养星形胶质细胞AQP4 mRNA和AQP4蛋白的表达减少。结论氨可致AQP4表达增加,U0126和地塞米松有细胞保护作用,可有效保护脑星形胶质细胞。     

慢病毒转染大鼠破骨样细胞研究

目的探讨慢病毒转染大鼠破骨样细胞的可行性。方法诱导大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)培养成破骨样细胞(OLC)后,将其用绿色荧光蛋白(GFP)标记的对照慢病毒进行转染,荧光显微镜下观察不同感染复数(MOI)时慢病毒转染OLC的荧光率,并用TRAP染色鉴定OLC。选择最适宜的MOI并加入不同干预进行对照,分为OLC对照组、NFAT2抑制剂(VIVIT)组、NFAT2iRNA慢病毒组、对照病毒组,用RT-PCR进行基因验证。结果对照病毒转染后,OLC随着MOI值的升高,荧光转染率增加;MOI=15时荧光数最多(41.00±9.19)个/视野。不同干预后,NFAT2抑制剂组和NFAT2iRNA慢病毒组的NFAT2的基因表达明显低于OLC对照组和对照病毒组(P0.05)。结论慢病毒可转染大鼠破骨样细胞,并在一定范围内随MOI升高转染率增高。     

有效抑制小鼠小胶质细胞上Toll样受体9表达的siRNA的筛选

目的：筛选有效抑制小鼠小胶质细胞（BV-2细胞）上Toll样受体9（TLR9）表达的小干扰RNA（siRNA）序列,并检测转染复合物的细胞毒性。方法设计并合成针对TLR9的3对siRNA（siRNA-836、siRNA-1549和siRNA-2410）及一条带绿色荧光标记（FAM）的通用阴性对照FAM-siRNA。在X-tremeGENEsiRNA转染试剂介导下转染BV-2细胞。倒置荧光显微镜下观察转染后BV-2细胞FAM-siRNA的分布,流式细胞仪检测转染效率,q-PCR检测TLR9的mRNA表达,Westernblot检测TLR9蛋白的表达,并比较其抑制率,筛选出有效抑制靶基因表达的siRNA。CCK-8检测细胞存活率的变化。结果BV-2细胞转染FAM-siRNA后6h,胞质内可见绿色荧光分布。FAM-siRNA表达阳性率为（91.87±4.77）％。转染TLR9siRNA后,BV-2细胞中TLR9mRNA表达明显下降。与阴性对照组及序列siRNA-836、siRNA-2410相比,序列siRNA-1549的TLR9沉默效能最高,使BV-2细胞上TLR9mRNA表达于24h和48h分别降低（77.89±4.23）％和（65.36±11.07）％,TLR9蛋白表达分别下降（48.37±20.56）％和（44.30±14.31）％。CCK-8检测TLR9siRNA转染组与对照组相应时间点比较,BV-2细胞存活率无明显变化（P＞0.05）。结论序列siRNA-1549对BV-2细胞上TLR9表达的抑制效果最大,利用RNA干扰处理BV-2细胞,对细胞基本无毒性作用。     

窖蛋白1对大鼠星形胶质细胞糖氧剥夺损伤的影响

目的探讨糖氧剥夺(oxygen-glucose deprivation,OGD)对体外培养的大鼠星形胶质细胞窖蛋白1(caveolin-1,Cav-1)的影响。方法原代培养出生24h内SD大鼠大脑皮质星形胶质细胞,分为对照组和OGD组(给予星形胶质细胞6h的OGD和24h的再灌注损伤,建立OGD损伤模型)。用多重免疫荧光的方法检测星形胶质细胞Cav-1表达,实时荧光定量PCR和Western blot的方法检测星形胶质细胞Cav-1表达的变化。根据小干扰RNA(siRNA)的原理,将Cav-1siRNA转染星形胶质细胞,采用CCK-8的方法检测星形胶质细胞活力。结果大鼠大脑皮质星形胶质细胞Cav-1普遍表达。与对照组比较,OGD组星形胶质细胞Cav-1mRNA和蛋白表达量下降(P<0.05)。siRNA转染后,与对照组比较,OGD组星形胶质细胞活力下降(P<0.05)。结论 SD大鼠大脑皮质星形胶质细胞Cav-1表达的下调,导致OGD后细胞损伤加重,提示Cav-1对星形胶质细胞具有保护作用。     

转录因子c-Jun对人血管平滑肌细胞中线粒体融合基因2表达调控作用的实验研究

目的:探讨转录因子c-Jun对培养的人血管平滑肌细胞(hVSMCs)中线粒体融合基因2(Mfn2)表达的调控作用。方法:①siRNA干扰实验:设正常对照组、阴性siRNA对照组和siRNA干扰组,用c-Jun siRNA转染hVSMCs,培养26 h后提取细胞mRNA和总蛋白。通过RT-PCR和Western blot检测Mfn2基因和蛋白质的表达。②过表达实验:设正常对照组、阴性病毒对照组和慢病毒过表达组。用慢病毒载体感染细胞,培养96 h后提取细胞mRNA和总蛋白。通过RT-PCR和Western blot检测Mfn2基因和蛋白质的表达。结果:siRNA敲减c-Jun后,与阴性siRNA对照和正常对照组相比,siRNA干扰组Mfn2 mRNA明显降低[(0.671±0.061)vs.(1.110±0.080),P0.01;(0.671±0.061)vs.(1.000±0),P0.01],蛋白质的表达也显著降低[(0.571±0.049)vs.(1.042±0.039),P0.01;(0.571±0.049)vs.(1.000±0),P0.01],hVSMCs的数量明显增加。相反,用慢病毒表达载体过表达c-Jun后,与阴性病毒对照和正常对照组相比,慢病毒过表达组Mfn2 mRNA明显增加[(1.414±0.063)vs.(1.056±0.020),P0.01;(1.414±0.063)vs.(1.000±0),P0.01],蛋白质的表达也显著增加[(1.449±0.044)vs.(1.089±0.026),P0.01;(1.449±0.044)vs.(1.000±0),P0.01],hVSMCs的数量则明显下降。结论:c-Jun能显著正调控Mfn2的表达,并影响hVSMCs的增殖。因此,它可能是Mfn2表达的转录调控因子。     

沉默人胰腺癌细胞S100A4基因表达对肿瘤相关基因mRNA表达的影响

目的 观察沉默S100A4基因表达对人胰腺癌BxPC-3、AsPC-1细胞肿瘤相关基因COX-2、bcl-2 、Surviving、MMP-9 mRNA表达的影响,探讨它们之间的关系.方法 应用靶向S100A4的小干扰RNA(siRNA)转染人胰腺癌BxPC-3、AsPC-I细胞,应用无同源性的siRNA-C转染细胞作为阴性对照,以未转染细胞作为对照组.采用RT-PCR检测干扰后细胞S100A4、COX-2、Survivin、MMP-9、bcl-2 mRNA的表达.结果 人胰腺癌BxPC-3细胞的对照组、siRNA-C组、siRNA-S100A4组的S100A mRNA表达量分别为0.661 ±0.023、0.659±0.043、0.379±0.039;COX-2 mRNA表达量分别为0.760±0.026、0.830±0.017、0.443±0.006;Survivin mRNA表达量分别为0.948±0.049、0.909±0.081、0.068 ±0.006;bcl-2mRNA表达量分别为0.462±0.018、0.421±0.049、0.184±0.025;MMP-9 mRNA表达量分别为0.813±0.008、0.908±0.063、0.246±0.027.AsPC-I细胞的对照组、siRNA-C组、siRNA-S100A4组的S100A4mRNA表达量分别为0.641±0.042、0.626±0.053、0.320±0.081;COX-2 mRNA表达量分别为0.727±0.021、0.743±0.025、0.560±0.035;Survivin mRNA表达量分别为0.994±0.032、0.984±0.049、0.063±0.005;bcl-2 mRNA表达量分别为0.458±0.004、0.537±0.046、0.181±0.007;MMP-9 mRNA表达量分别为0.698±0.011、0.718±0.073、0.199±0.013.2株细胞的siRNA-S100A4组的S100A、COX-2、Survivin、bcl-2、MMP-9 mRNA表达量均较其相应的siRNA-C组及对照组显著减少(P值均＜0.01),而siRNA-C组与对照组间的表达量差异无统计学意义.结论 S100A4通过上调COX-2、Survivin、bcl-2、MMP-9基因的表达在胰腺癌发生、发展中发挥作用.     

TBX18腺病毒载体体外诱导乳鼠心肌细胞向起搏样细胞分化

目的观察TBX18腺病毒载体在体外转染乳鼠心肌细胞,能否诱导其向起搏样细胞分化。方法胰酶和Ⅱ型胶原酶混合消化法分离培养乳鼠心肌细胞,光学显微镜下观察细胞形态,48h后用免疫荧光技术检测心肌细胞纯度。将心肌细胞随机分为实验组(TBX18组)、空病毒对照组(GFP组),转染时分别加入带TBX18转录因子和绿色荧光蛋白(GFP)的腺病毒,带GFP的腺病毒,采用实时荧光定量聚合酶链式反应,蛋白质免疫印迹和免疫荧光技术检测各组心肌细胞HCN4mRNA和HCN4蛋白的表达。结果培养24h后,心肌细胞几乎完全贴壁,可见梭形、菱形或多边形;48h后形成网状或放射状细胞簇。α-actin检测心肌细胞纯度高达96%。TBX18组心肌细胞中HCN4mRNA和HCN4蛋白的表达水平明显高于GFP组(28 943.997±5 019.682vs 1.000±0.000,n=9,P0.05;0.631±0.025vs 0.192±0.003,n=9,P0.05);倒置荧光显微镜下观察TBX18组因表达HCN4蛋白而发出红色荧光,GFP组几乎看不到HCN4蛋白的表达。结论 TBX18腺病毒载体体外转染乳鼠心肌细胞,能使乳鼠心肌细胞向起搏样细胞分化。     

转录因子Tbx18对升主动脉平滑肌细胞的重编程作用

目的探讨转录因子Tbx18腺病毒载体在体外转染升主动脉平滑肌细胞的重编程作用。方法采用组织块贴壁法培养升主动脉平滑肌细胞,4～7d后在光学显微镜下观察细胞形态,细胞传代后随机分为空白组、绿色荧光蛋白(GFP)组、Tbx18组,Tbx18组转染携带Tbx18和GFP腺病毒,GFP组转染等量GFP腺病毒,空白组不转染病毒。转染4d后通过RT-qPCR和Western blotting检测3组相关转录因子环核苷酸门控离子通道蛋白亚型4(HCN4)、Tbx3、NKx2.5和心肌细胞特异性标志物心肌肌钙蛋白Ⅰ(cTnⅠ)表达;通过免疫荧光技术检测Tbx18组及GFP组HCN4蛋白表达。结果与GFP组和空白组比较,Tbx18组HCN4、Tbx3和cTnⅠ mRNA和蛋白表达明显上调,NKx2.5蛋白表达明显降低,差异有统计学意义(0.135±0.033 vs 0.291±0.104、0.344±0.067,P<0.05)。免疫荧光结果显示,倒置荧光显微镜下Tbx18组HCN4蛋白发出红色荧光,并且与细胞转染的绿色荧光和细胞核蓝色荧光大致重合,而GFP组几乎无红色荧光发出。结论 Tbx18腺病毒载体在体外能够将升主动脉平滑肌细胞重编程为起搏样细胞。     

携带TBX18的慢病毒载体转染脂肪干细胞并诱导其向起搏样细胞分化的研究

目的观察TBX18慢病毒载体在体外转染脂肪干细胞(ADSCs),能否诱导其向起搏样细胞分化。方法取40~50g SD大鼠的腹股沟脂肪,采用酶混合消化法分离培养ADSCs,光学显微镜下观察细胞形态,将细胞随机分为TBX18组、GFP组、null组,TBX18组转染携带TBX18转录因子和绿色荧光蛋白(GFP)的TBX18慢病毒,GFP组转染等量的GFP慢病毒作为空病毒对照组,null组不转染病毒作为空白对照组。一周后通过蛋白质免疫印迹(Western blotting)检测三组相关转录因子TBX3、ISL1、SHOX2,缝隙连接蛋白CX45、CX43、CX30.2及心肌细胞特异性标志物心肌肌钙蛋白I(cTNI)、肌动蛋白(α-SMA)的蛋白表达量;通过免疫荧光技术检测TBX18组及GFP组的α-SMA蛋白的表达。病毒转染后第7、14、21、28天分别采用实时荧光定量聚合酶链式反(RT-PCR)检测TBX18组及GFP组TBX18及HCN4水平。结果 TBX18组转染ADSCs后,细胞形态发生改变,转染后4周内可通过荧光显微镜下观察到持续的荧光表达,诱导分化后,TBX18组TBX3、ISL1、SHOX2、CX45、CX30.2、cTN1、α-SMA蛋白水平明显高于GFP组及null组,而CX43蛋白表达低于null组;TBX18组免疫荧光检测到了α-SMA,而GFP组表达阴性;TBX18组TBX18及HCN4表达在慢病毒转染后4周内持续表达,明显高于GFP组(P0.05)。结论 TBX18慢病毒载体体外转染入ADSCs,能在细胞内稳定表达,且能使其向起搏样细胞分化。     

miR-630靶向Slug信号通路影响人肾癌细胞株侵袭、迁移的作用

目的 探讨微小核糖核酸(miR)-630靶向锌指转录因子Slug信号通路调节人肾癌细胞株ACHN侵袭、迁移的作用。方法 取人肾癌细胞株ACHN培养传代,分为正常组(未转染)、阴性对照组(转染携带miR-630抑制剂阴性对照的慢病毒)、过表达组(转染携带miR-630模拟物的慢病毒)、低表达组(转染携带miR-630抑制物的慢病毒)。培养48 h后,Transwell小室实验检测各组细胞侵袭能力,划痕实验检测各组细胞迁移能力;实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)测量miR-630、E-钙黏蛋白(cadherin)、Slug、波形蛋白(Vimentin)和N-cadherin信使核糖核酸(mRNA)表达;Western印迹法检测各组Slug、E-cadherin、N-cadherin和Vimentin蛋白表达;双荧光素酶报告基因检测验证miR-630是否靶向Slug信号通路。结果 阴性对照组、过表达组和低表达组转染效率分别为(87.39±17.36)%、(86.11±17.01)%和(85.43±16.98)%,各组间差异无统计学意义(P>0.05)。与正常组和阴性对照组比较,...     

RNA干扰基质金属蛋白酶-9对骨肉瘤MG-63细胞侵袭、迁移的影响

目的探讨RNA干扰基质金属蛋白酶(MMP)-9基因对人骨肉瘤MG-63细胞体外侵袭和迁移能力的影响。方法通过慢病毒载体介导shRNA-MMP-9转染MG-63细胞,实验分为:转染组(转染shRNA-MMP-9序列)、对照组(转染shRNA-MMP-9-NC序列)、空白组(磷酸盐缓冲液);RT-PCR检测各组MMP-9和血管内皮生长因子(VEGF)mRNA的表达;Western印迹检测各组MMP-9和VEGF蛋白的表达;Transwell小室侵袭实验检测细胞的侵袭能力;细胞划痕实验检测各组细胞迁移能力。结果转染组MMP-9和VEGF的mRNA和蛋白表达量显著低对照组和空白组(P0.05);转染组穿膜细胞数[(56.37±3.29)个/视野]显著低于对照组和空白组[(92.06±3.56)个/视野、(93.05±1.52)个/视野](P0.05);转染组划痕愈合率(23.63%±1.47%)显著低于对照组和空白组(57.17%±3.86%、58.13%±2.35%)(P0.05)。结论 RNA干扰沉默骨肉瘤MG-63细胞的MMP-9基因表达,通过作用于VEGF靶基因,抑制其细胞侵袭及迁移能力。     

miRNA-21调控胃癌细胞增殖及侵袭的机制

目的探讨靶向沉默miRNA-21表达对胃癌细胞增殖及侵袭的影响和机制。方法将人胃癌SGC-7901细胞分为正常对照组、转染siRNA Control的阴性对照组和转染siRNA miRNA-21基因的沉默组,按照Invitrogen公司的脂质体Lipofectamine~(TM)2000方法进行转染,48 h后,CCK8实验检测细胞增殖;Transwell小室检测细胞侵袭能力;Western印迹检测基质金属蛋白酶(MMP)-2、MMP-9、Notch1、Hes1蛋白表达。结果转染siRNA miRNA-21后能显著降低miRNA-21的表达(P<0.01);与正常对照组及转染阴性组比较,沉默组细胞存活率、细胞侵袭数显著降低,MMP-2、MMP-9、Notch1、Hes1蛋白表达显著下调(P<0.01)。结论靶向沉默miRNA-21表达能显著降低胃癌细胞的增殖及侵袭能力,其机制与抑制Notch1信号通路有关。     

双标细胞因子诱导的杀伤性细胞系构建

目的构建表达荧光素酶(Luc)及绿色荧光蛋白(GFP)双标细胞因子诱导的杀伤性(CIK)细胞系。方法体外原代培养C57BL/6小鼠CIK细胞,使用构建好的表达Luc及GFP的慢病毒载体包装重组慢病毒,感染培养第14天的CIK细胞,嘌呤霉素筛选2 w后,采用荧光倒置显微镜观察GFP表达情况,PCR、基因测序及体外活体成像系统对感染后的CIK细胞表达Luc进行验证。结果 Luc-GFP-CIK双标细胞系构建成功,能够稳定表达Luc及GFP。荧光倒置显微镜观察显示转染后CIK细胞形态正常且表达GFP;PCR和测序结果显示转染后CIK细胞获得Luc基因;体外活体成像系统检测显示转染后CIK细胞表达Luc。结论初步构建了简便、安全的双标CIK细胞系,该方法便于普及,可为CIK细胞在体内的进一步研究提供前期基础和实验工具。     

慢病毒转染的β3-AR基因对心肌肥厚的影响

目的:探讨β3肾上腺素能受体(β3-AR)对SD大鼠乳鼠心肌肥大的影响及其机制。方法:体外培养SD大鼠乳鼠心肌细胞,用携带β3-AR基因的慢病毒转染细胞后,用去甲肾上腺素(NE)诱导细胞48h,建立心肌细胞肥大模型。实验分4组:空白对照组(Control组)、心肌肥厚组(NE组)、β3-AR基因转染+NE组(β3-AR组)、空病毒转染+NE组(空病毒组)。用免疫荧光法鉴定心肌细胞,倒置荧光显微镜观察病毒转染组绿色荧光蛋白(GFP)表达,免疫印迹法(Western Blot)检测β3-AR、丝裂原活化蛋白激酶p38(p38MAPK)、细胞外信号调控激酶(ERK1/2)、磷酸化p38MAPK(p-p38MAPK)和ERK(p-ERK1/2)及原癌基因c-myc、c-fos蛋白水平的表达。结果:(1)慢病毒介导β3-AR基因转染心肌细胞,β3-AR表达较空白对照组明显升高。(2)用Western Blot检测各实验组细胞原癌基因c-myc、c-fos表达,其中NE组、β3-AR组、空病毒组表达均高于空白对照组,其中β3-AR组cmyc、c-fos表达明显高于NE组。(3)NE组、β3-AR组、空病毒组p38MAPK及ERK1/2的磷酸化水平较空白对照组明显上调,其中β3-AR组表达最高。结论:慢病毒介导的β3-AR基因转染使心肌细胞有效高表达β3-AR,β3-AR可能通过MAPK通路促进心肌肥厚。     

靶向UCP-2基因siRNA慢病毒转染对胰腺腺泡细胞AR42J坏死、凋亡的影响及机制探讨

目的观察靶向解偶联蛋白2(UCP-2)基因小干扰RNA(siRNA)慢病毒转染对胰腺腺泡细胞AR42J坏死、凋亡的影响,并探讨其相关机制。方法构建靶向UCP-2基因siRNA慢病毒载体,转染AR42J细胞(实验组),并设立阴性对照组及空白对照组。荧光显微镜镜检确定感染效率,实时定量PCR检测各组细胞的UCP-2 mRNA。以1×108mol/L的蛙皮素刺激AR42J细胞,采用Annexin V/PI双标流式细胞仪检测蛙皮素刺激后不同时间点AR42J细胞的坏死率和凋亡率,同时检测细胞内的ATP、活性氧簇(ROS)。结果成功构建了滴度为5×108TU/mL的UCP-2基因siRNA慢病毒载体;实验组细胞UCP-2 mRNA表达明显降低,各时间点AR42J细胞凋亡率及其ROS、ATP水平显著高于阴性对照组(P均<0.05),细胞坏死率则显著低于阴性对照组(P<0.05)。结论靶向UCP-2基因siRNA慢病毒转染可抑制AR42J细胞的UCP-2基因表达,促进细胞凋亡,抑制细胞坏死,其作用机制与其增加AR42J细胞内ROS、ATP表达有关。