Geminin基因RNA干扰对大鼠血管平滑肌细胞增殖的影响

目的以RNA干扰抑制血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)Geminin基因的表达观测VSMCs增殖情况及表型标志物。方法分别利用RT-PCR,Western blot检测VSMCs中Geminin基因、蛋白表达的变化,筛选出干扰效果最为显著的序列用于构建慢病毒包裹的稳定干扰模型。应用[3H]-TdR、EdU掺入试验检测VSMCs增殖的情况;同时使用Western blot分别检测干扰前后相关标志性基因的表达。结果①siRNA转染后,以第1亚组干扰效果最为显著,与另外2个阳性亚组及对照组比较差异具有统计学意义(P<0.05)。②[3H]-TdR、EdU掺入实验显示:阳性干扰组的掺入量较两对照组明显升高(P<0.05)。③siRNA转染使Geminin基因表达减弱后,阳性组VSMCs合成型标志物骨桥蛋白(osteopontin,OPN)表达水平显著升高,收缩型标志物平滑肌肌动蛋白(smooth muscle actin,α-Actin)表达水平明显降低,与对照组间比较,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论 RNA干扰介导的Geminin基因沉寂可显著增强VSMCs的增殖能力,并有助于VSMCs的表型由收缩型向合成型转化。     

Geminin基因过表达对VSMCs表型转化的影响

目的探讨Geminin基因过表达对血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)表型转化的影响。方法构建真核表达载体pEGFP-N1-Geminin,脂质体2000介导转染不同表型(去分化型和分化型)的大鼠VSMCs株,设置阳性组、阴性组和空白组(n=3),检测转染效果、VSMCs主要表型标志物(α-actin、OPN)和肌动蛋白相关蛋白1(actinrelated protein,ARP1)的变化情况。结果 Geminin基因成功过表达VSMCs株。与2个对照组(阴性组和空白组)比较,分化型VSMCs中表型标志物(α-actin和OPN)及ARP1含量变化不大;去分化型VSMCs中,OPN在阳性组中表达下调,与2个对照组(阴性组和空白组)比较差异具有统计学意义(P<0.05),α-actin和ARP1在阳性组中表达上调,与2个对照组(阴性组和空白组)比较差异具有统计学意义(P<0.05),免疫共沉淀实验结果提示经protein G plus-Agarose沉淀ARP1相互作用蛋白复合物后,用Geminin抗体进行Western blot检测,可以检测到Geminin的表达。结论 Geminin基因过表达有助于VSMCs由去分化型向分化型转化;免疫共沉淀结果提示Geminin和ARP1之间存在相互作用,ARP1可能参与了上述VSMCs表型转化过程。     

Effect of RNA interference targeting geminin on proliferation of vascular smooth muscle cells in rats

目的 以RNA干扰抑制血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs) Geminin基因的表达观测VSMCs增殖情况及表型标志物.方法 分别利用RT-PCR,Western blot检测VSMCs中Geminin基因、蛋白表达的变化,筛选出干扰效果最为显著的序列用于构建慢病毒包裹的稳定干扰模型.应用[3H] -TdR、EdU掺入试验检测VSMCs增殖的情况;同时使用Western blot分别检测干扰前后相关标志性基因的表达.结果 ①siRNA转染后,以第1亚组干扰效果最为显著,与另外2个阳性亚组及对照组比较差异具有统计学意义(P＜0.05).②[3H] -TdR、EdU掺入实验显示:阳性干扰组的掺入量较两对照组明显升高(P＜0.05).③siRNA转染使Geminin基因表达减弱后,阳性组VSMCs合成型标志物骨桥蛋白(osteopontin,OPN)表达水平显著升高,收缩型标志物平滑肌肌动蛋白(smooth muscle actin,α-Actin)表达水平明显降低,与对照组间比较,差异均有统计学意义(P＜0.05).结论 RNA干扰介导的Geminin基因沉寂可显著增强VSMCs的增殖能力,并有助于VSMCs的表型由收缩型向合成型转化.     

Geminin over-expression promotes differentiation in rat vascular smooth muscle cells from dedifferentiation

目的 探讨Geminin基因过表达对血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)表型转化的影响.方法 构建真核表达载体pEGFP-N1 -Geminin,脂质体2000介导转染不同表型(去分化型和分化型)的大鼠VSMCs株,设置阳性组、阴性组和空白组(n=3),检测转染效果、VSMCs主要表型标志物(α-actin、OPN)和肌动蛋白相关蛋白1(actin related protein,ARPl)的变化情况.结果 Geminin基因成功过表达VSMCs株.与2个对照组(阴性组和空白组)比较,分化型VSMCs中表型标志物(α-actin和OPN)及ARP1含量变化不大;去分化型VSMCs中,OPN在阳性组中表达下调,与2个对照组(阴性组和空白组)比较差异具有统计学意义(P＜0.05),α-actin和ARP1在阳性组中表达上调,与2个对照组(阴性组和空白组)比较差异具有统计学意义(P＜0.05),免疫共沉淀实验结果提示经protein G plus-Agarose沉淀ARP1相互作用蛋白复合物后,用Geminin抗体进行Western blot检测,可以检测到Geminin的表达.结论 Geminin基因过表达有助于VSMCs由去分化型向分化型转化;免疫共沉淀结果提示Geminin和ARP1之间存在相互作用,ARP1可能参与了上述VSMCs表型转化过程.     

ORC1基因RNA干扰对大鼠血管平滑肌细胞表型的影响

目的 以RNA干扰抑制血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)ORC1基因,探讨ORCl基因表达抑制后对VSMCs表型的影响.方法 实验设置正常对照组、阴性siRNA组及阳性siRNA组.应用Western blot检测ORC1基因表达的变化;免疫荧光染色后激光共聚焦显微镜观察细胞形态结构;应用流式细胞仪检测细胞表型标志蛋白表达.结果 ①siRNA转染后,阳性siRNA组ORCI基因表达水显著降低,而正常对照组及阴性siRNA组间ORC1基因表达水平无显著差异.②siRNA转染后,阳性转染组细胞呈现收缩型形态特征,空白对照组及阴性对照组细胞呈现合成型形态特征.③siRNA转染使ORCI表达减弱后,VSMCs收缩型标志物α-平滑肌肌动蛋白(α-SM actin)和平滑肌肌动蛋白重链2(SM-2)表达水平明显升高.合成型标志物骨桥蛋白(osteopontin)表达水平明显降低,空白对照组及阴性对照组间3种标志物表达水平无显著差异.结论 RNA干扰介导的ORC1基凶沉寂可促使VSMCs由合成型向收缩型转化.     

两种原代培养方法对血管平滑肌细胞收缩表型的影响

目的：探究胶原酶消化法和植块法培养原代血管平滑肌细胞（VSMCs）对细胞收缩表型影响的特点。方法：使用II型胶原酶消化法和植块法分别离体培养原代VSMCs,并获取第1代、第2代、第4代、第8代、第12代VSMCs,Western blot检测不同代数表型标志蛋白α平滑肌肌动蛋白（SMA-α）、调宁蛋白（calponin）和骨桥蛋白（OPN）表达情况;随后检测不同培养方法间表型标志蛋白表达差异,并用划痕实验和MTT实验检测迁移、增殖水平,免疫荧光检测SMA-α胞内表达。结果：消化法最初可获得明显优于植块法的VSMCs收缩表型,表现为SMA-α和calponin高表达,OPN较低表达,增殖、迁移能力相对较弱。培养至第8代后,2种方法的细胞都发生显著的表型改变,增殖、迁移能力增强且消化法细胞呈现更强的去分化表型趋势。结论：II型胶原酶消化法可快速获得良好收缩表型的VSMCs,在第4代前具有优于植块法的收缩表型。     

micro RNAs调控平滑肌细胞表型转化及其在心血管疾病中的作用

血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)的表型转化在心血管疾病的发生发展过程中起着重要的作用.生理状态下,VSMCs处在静止期,保持着收缩表型;然而,在病理状态下(如内皮损伤、细胞因子刺激),VSMCs由收缩表型转变为合成表型,由分化状态变为去分化状态.与此同时,其收缩蛋白...     

血管平滑肌细胞表型转化影响因素及中药干预研究进展

成熟分化的血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)受机体不同刺激时具有表型可塑性,VSMCs由分化型和收缩表型转化为去分化型的过程称之为表型转化.VSMCs表型转化在动脉粥样硬化、高血压、血管成型术后再狭窄、糖尿病血管病变等增殖性血管疾病中具有重要作用.本文主要介绍VSMCs表型转化影响因素及中药干预VSMC表型转化的研究进展,为中药防治增殖性血管疾病提供新思路.     

血管平滑肌细胞表型转化与骨架蛋白表达之间的关系

目的:探讨体外培养血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)表型与细胞骨架蛋白表达之间的生物学意义.方法:体外培养大鼠主动脉VSMCs,实验分组为:对照组、血清饥饿组、血清再培养组,RT-PCR检测表型基因平滑肌22α(smooth muscle 22 alpha,SM22α)mRNA的表达;免疫细胞化学检测细胞骨架蛋白F-肌动蛋白(F-actin)的表达.结果:在体外培养条件下,对照组SM22α表达较低,细胞呈多角形或短梭形,细胞多有板状突起,F-actin的荧光强度明显减低;血清饥饿组SM22α表达恢复上调,VSMCs多细长,呈梭形,少见分裂相细胞,F-actin的荧光强度升高;血清再培养后SM22α表达减少,细胞呈增殖状态,见核分裂现象,F-actin的荧光强度减低.结论:VSMCs的表型和细胞骨架形态和数量表达之间有着重要的相互联系,它们在维持细胞功能、血管重构及在心血管疾病(高血压、动脉粥样硬化)的发生、发展中起重要作用.     

内皮祖细胞对血管平滑肌细胞增殖的影响

目的：观察内皮祖细胞(endothelial progenitor cell,EPCs)对血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell,VSMCs)增殖的影响。方法：采用6%羟乙基淀粉沉降红细胞和密度梯度离心法分离人脐血单个核细胞,EGM-2细胞培养基进行培养,诱导单个核细胞贴壁并向EPCs分化;采用荧光显微镜双染色、流式细胞术鉴定EPCs,间接免疫荧光检测VSMCs收缩表型标志物α-SM-actin和calponin的表达;Transwell培养板建立早期EPCs和大鼠VSMCs共培养模式,以20%胎牛血清刺激VSMCs增殖,分别共培养6,12,24,48,72 h后收集VSMCs,采用BrdU标记法、蛋白定量、流式细胞术分析VSMCs DNA合成能力、细胞总蛋白含量以及细胞周期进程。结果：从脐血单个核细胞成功培养了EPCs。EPCs和大鼠VSMCs共培养12,24,48,72 h后,VSMCs DNA合成能力、细胞总蛋白含量均较对照组明显降低(P＜0.05),其中以48 h最明显;流式细胞术显示,共培养组VSMCs细胞周期中S期细胞所占百分率较对照组显著降低(P＜0.05),而细胞周期中G1期细胞所占百分率均相应高于对照组(P＜0.05),其中均以48 h最明显。结论：早期EPCs能够抑制VSMCs增殖。     

兔血管平滑肌细胞体外培养及生长特性研究

目的 体外分离培养兔血管平滑肌细胞(VSMC)并观察其生长特征.方法 采用酶消化结合贴壁法原代培养兔胸主动脉来源的VSMC并传代,倒置显微镜观察和免疫荧光染色法鉴定培养细胞;锥蓝法、绘制生长曲线、MTT法和划痕法分别测定VSMC传代细胞的成活率及其生长、增殖和迁移能力.结果 原代培养5 d后,VSMC从组织块边缘长出,传代细胞呈典型"峰-谷"状生长,胞质内α-平滑肌肌动蛋白免疫荧光染色阳性;细胞成活率为96%;生长曲线近似"S"形;细胞生长第3～5 d内光密度值变化较明显;无血清培养的VSMC在24 h内划痕宽度变化最显著.结论 体外培养的兔动脉平滑肌细胞为收缩表型且活性高,生长3～5 d细胞增殖活力较强,无血清培养的细胞在24 h内迁移能力最强,为心血管疾病研究提供了良好的实验材料.     

兔血管平滑肌细胞体外培养及生长特性研究

目的体外分离培养兔血管平滑肌细胞（VSMC）并观察其生长特征。方法采用酶消化结合贴壁法原代培养兔胸主动脉来源的VSMC并传代,倒置显微镜观察和免疫荧光染色法鉴定培养细胞;锥蓝法、绘制生长曲线、MTT法和划痕法分别测定VSMC传代细胞的成活率及其生长、增殖和迁移能力。结果原代培养5d后,VSMC从组织块边缘长出,传代细胞呈典型＂峰-谷＂状生长,胞质内α-平滑肌肌动蛋白免疫荧光染色阳性;细胞成活率为96%;生长曲线近似＂S＂形;细胞生长第3～5d内光密度值变化较明显;无血清培养的VSMC在24h内划痕宽度变化最显著。结论体外培养的兔动脉平滑肌细胞为收缩表型且活性高,生长3～5d细胞增殖活力较强,无血清培养的细胞在24h内迁移能力最强,为心血管疾病研究提供了良好的实验材料。     

温脉通对VSMC增殖和迁移相关因子MMP-2、TIMP-1表达的影响

目的 观察温脉通对血管平滑肌细胞(VSMC)增殖、迁移及其相关因子基质金属蛋白酶_2(MMP-2)和其抑制因子(TIMP-1)的影响.方法 体外培养兔胸主动脉VSMC,以血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)作为诱导因素,复制VSMC增殖、迁移模型,用温脉通药物血清进行干预.应用四唑盐(MTT)比色法测定VSMC增殖活性,用免疫细胞化学检测方法 观察MMP-2、TIMP-1的表达.结果 细胞经AngⅡ作用后其增殖活性和迁移距离明显增加,与正常对照组比较有显著性差异(P<0.01);而加入药物血清后,细胞增殖活性降低、迁移距离变短,与AngⅡ组比较有显著性差异(P<0.01),其中以高剂量组最为明显.正常对照组MMP-2呈弱表达、TIMP-1呈中度表达;AngⅡ组MMP-2表达明显增强、TIMP-1表达减弱;温脉通组MMP-2表达明显受到抑制而TIMP-1表达增强.结论 温脉通可抑制AngⅡ诱导的VSMC增殖和迁移,抑制MMP-2蛋白表达、诱导TIMP-1蛋白表达,提示该方抑制VSMC迁移可能与影响细胞因子表达从而调节细胞外基质(ECM)代谢有关.     

温脉通对血管平滑肌细胞增殖及相关因子表达的影响

目的观察温脉通对血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)诱导血管平滑肌细胞(VSMC)增殖的抑制作用及其对促VSMC生长因子的影响,以期探讨温脉通防治早期肢体动脉硬化性闭塞症(ASO)的作用机制.方法体外培养兔胸主动脉VSMC,以AngⅡ作为诱导因素,复制VSMC增殖模型,分别用温脉通全方及拆方药物血清进行干预.应用四唑盐(MTT)比色法测定各组VSMC增殖活性,用免疫细胞化学检测方法观察各组对血小板源性生长因子(PDGF-BB)表达的影响.结果细胞经AngⅡ作用后其增殖活性明显增加,与空白组比较有显著性差异(P＜0.01);而分别加入各组药物血清后,细胞增殖活性降低,与AngⅡ组比较有显著性差异(P＜0.01),其中以大剂量组细胞增殖活性降低最为明显.血管平滑肌细胞PDGF-BB免疫组化显色,空白组,呈弱阳性表达( /-);AngⅡ组呈强阳性表达( ),与空白组比较有显著性差异;温脉通全方组PDGF-BB表达明显减弱( ),与空白组接近;温经益气拆方组和活血通脉拆方组PDGF-BB呈中度表达( ),其阳性反应强度高于全方组,低于AngⅡ组.结论温脉通可呈剂量依赖性地抑制AngⅡ诱导的VSMC增殖、抑制PDGF-BB的蛋白表达,提示温脉通防治ASO可能与抑制VSMC异常增殖及PDGF-BB的蛋白表达有关.     

用血清药理学研究益气通络丹对大鼠血管平滑肌细胞的影响

目的观察益气通络丹 (YQTLD)含药血清对培养SD大鼠胸主动脉平滑肌细胞 (VSMC)的影响 ,探讨该药抗冠心病、脑梗塞等心脑血管疾病的作用机制。方法血清药理学方法制备含药血清 ;MTT法测定含药血清对VSMC增殖活性的影响 ;NO试剂盒测定含药血清对VSMC作用与NO的关系。结果YQTLD含药血清能显著降低培养的SD大鼠VSMCMTT法的D(()值 ,与空白血清组有显著性差异 (P <0 0 1) ;YQTLD含药血清组培养基中NO含量明显增多 ,与空白血清组有显著性差异 (P <0 0 1)。结论YQTLD有抗VSMC增殖的作用 ,此作用可能与NO有关 ,YQTLD可能通过抗VSMC增殖 ,促进NO释放来延缓AS的发生、发展 ,从而在冠心病、脑梗死等心脑血管疾病中发挥作用。     

WORT对血清饥饿及辐射诱导血清饥饿的SHG44增殖抑制作用的影响

目的研究磷脂酰肌醇-3-激酶的相对特异性抑制剂WORT(Wortmannin,渥漫青霉素)对血清饥饿的SHG44细胞及辐射诱导血清饥饿的SHG44增殖抑制作用的影响。方法用甲基噻唑基四氮唑盐(Methyl thiazolyltetrazolium,MTT)比色法测定不同浓度的WORT处理的血清饥饿及血清饥饿后5 Gy照射的SHG44细胞的存活率。结果血清饥饿后,1.00×10-8mol/L~5.00×10-7mol/L的WORT使细胞存活率随WORT浓度的升高而降低(P<0.05),5.00×10-7mol/L~5.00×10-6mol/L的WORT使细胞存活率的降低出现平台期,1.50×10-5~3.00×10-5mol/L范围内细胞存活率再一次出现下降(P<0.05)。实验结果表明WORT可使血清饥饿后再接受5 Gy照射的细胞存活率进一步降低(P<0.05)。结论血清饥饿后,渥漫青霉素可抑制SHG44细胞的增殖,并提高辐射诱导血清饥饿细胞的增殖抑制作用,其机制可能与抑制PI3K通路以及PI3K家族其他成员相关。     

诱导血红素氧合酶-1及雷帕霉素对PDGF诱导的大鼠平滑肌细胞表型转化的抑制作用

目的观察血红素氧合酶-1（HO-1）与雷帕霉素对血小板源性生长因子-BB（PDGF-BB）诱导的大鼠血管平滑肌细胞（VSMCs）表型转化的作用。方法原代大鼠VSMCs给予PDGF-BB诱导表型转化。同时给予不同剂量的血红素氧合酶诱导剂氯血红素诱导HO-1的表达,和雷帕霉素共培养24h。结果PDGF-BB20nmol/ml作用原代VSMCs24h后,SM-α-actin与PCNA表达减弱,PCNA表达增强。氯血红素诱导HO-1后可以抑制PDGF-BB诱导的VSMCs表型改变,并且随剂量的增加,抑制强度增加。较低剂量的雷帕霉素可以抑制PDGF诱导的VSMCs表型转化。结论PDGF-BB亚型可以促进原代培养的大鼠VSMCs由收缩表型向合成表型转化,给予氯血红素诱导HO-1表达可以对抗PDGF-BB诱导的大鼠VSMCs表型转化,并呈剂量相关。     

三七总皂甙、大鼠高胆固醇血清对大鼠血管平滑肌细胞增殖的影响

目的：为观察tPNS对HCS刺激的VSMC增殖的影响。方法：通过MTT法和电镜观察法，观察了tPNS对VSMC的保护作用。结果：HCS可明显刺激VSMC增殖并导致其表型的改变，tPNS可呈浓度依赖性抑制VSMC的增殖（r=-0.972)，与对照组相比具显著差异；tPNS还可明显抑制HCS对VSMC的刺激增殖作用，与HCS组相比具有显著差异。结论:tPNS可抑制VSMC增殖而抗动脉粥样硬化，这种抑制作用没有种属差异性。