人白细胞介素2受体α链基因第三内含子的克隆与核苷酸序列分析

应用ＰＣＲ技术扩增了人白细胞介素２受体α基因第三内含子２．５ｋｂ片段，并成功地克隆到ｐＢＳ－ＳＫ载体中，构建了一系列亚克隆并测定了２．５ｋｂ全核苷酸序列，其中２２２８ｂｐ碱基序列为国内外首次测定，其数据已被ＧｅｎＢａｎｋ接受，接受号为Ｕ５６３８９。     

IL—2／HBV PreS融合基因的克隆及序列测定

目的：获得ＩＬ－２／ＨＢＶｐｒｅＳ融合基因克隆，为表达ＩＬ－２／ＨＢＶｐｒｅＳ融合蛋白奠定基础，方法：用ＰＣＲ方法从乙肝全序列中扩增ＨＢＶｐｒｅＳ基因片段，并克隆入带ＩＬ－２基因的ｐｌｙ５质粒中，挑出的阳性克隆再亚克隆到ｐＵＣ１８中进行序列测定。结果：基因全长９３０ｂｐ，编码３１０个氨基酸，序列内有起始码和终止码。结论：所克隆的基因为ＩＬ－２与ＨＢＶｐｒｅＳ的融合基因。     

鼻咽癌细胞株SUNE1中EB病毒LMP1全基因克隆及部分序列的测定

目的　研究广东地区鼻咽癌（ＮＰＣ） 细胞株ＳＵＮＥ１ 中ＥＢ病毒ＬＭＰ１ 基因的结构特征。方法　利用聚合酶链反应从ＳＵＮＥ１ 细胞基因组中扩增ＬＭＰ１ 全长ＤＮＡ,并克隆到ｐｃＤＮＡ３ 载体中,采用Ｓａｎｇｅｒ 双脱氧末端终止法测定ＳＵＮＥ１ＬＭＰ１ ３ 个外显子及２ 个内含子覆盖的序列,并与病毒原型Ｂ９５８ＬＭＰ１ 进行比较分析。结果　克隆到ｐｃＤＮＡ３ 中的ＳＵＮＥ１ＬＭＰ１ 全基因长度为２－６ ｋｂ,测序长度为１３１２ ｂｐ,与Ｂ９５８ＬＭＰ１ 比较,核苷酸与氨基酸的同源性分别为９８－５ ％ 和９６ ％ ,核苷酸及氨基酸变异主要在第３ 外显子,但无Ｃ端３４３～３５２ 密码子３０ 个碱基的缺失,第１ 外显子上有ＸｈｏⅠ酶切位点的丢失。结论　广东地区ＮＰＣ细胞株ＳＵＮＥ１ 中,病毒ＬＭＰ１ 基因与原型株之间尽管致瘤性存在差异,但仍具有较高的同源性。提示ＮＰＣ细胞中ＬＭＰ１ 的致瘤特征可能并非由于ＬＭＰ１ 基因某些特定核苷酸突变所致     

利用噬菌体肽库确定IL-2Rα表位序列

目的：确定ＩＬ－2Ｒα表位,为研制高效特异性强的小分子肽类免疫抑制剂奠定基础。方法：用抗ＩＬ－２Ｒα单克隆抗体５Ｇ１对噬菌体六肽库进行筛选,选择出与５Ｇ１结合较强的克隆,经ＤＮＡ序列分析,获得保守序列。对合保守序列的克隆进行生物学活性鉴定。结果：选择出３１个与５Ｇ１结合较强的克隆。获得Ｓｅｒ－Ｓｅｒ－Ｐｈｅ和Ｓｅｒ－Ｓｅｒ－Ａｒｇ两种保守序列。生物学活性鉴定表明：含Ｓｅｒ－Ｓｅｒ－Ａｒｇ序列克隆较含Ｓｅｒ－Ｓｅｒ－Ｐｈｅ被抑制效果好。结论：Ｓｅｒ－Ｓｅｒ－Ａｒｇ是ＩＬ－２Ｒα表位的关键序列。以此表位序列合成的小分子肽可作为ＩＬ－２Ｒα的拮抗剂而成为免疫抑制剂。     

hIL-15成熟肽段基因的克隆及其原核表达载体的构建

本文采用ＲＴ ＰＣＲ的方法自成人脾脏中扩增出ｈＩＬ １５成熟肽段基因，定向克隆入ｐＵＣ１９中，筛选带有插段的阳性克隆。经序列测定证实后，插入大肠杆菌融合表达载体ｐＧＥＸ ４Ｔ １中，构建重组表达质粒ｐＧＩＬ １５。ＳＤＳ ＰＡＧＥ证实ｐＧＩＬ １５大肠杆菌中可表达分子量为３８６ｋＤ的融合蛋白带，表达量约占菌体总蛋白的１８５％。目的蛋白经纯化后具有促进靶细胞ＤＮＡ合成的作用。     

噬菌体肽库确定IL—2Rα表位序列

目的：确定ＩＬ－２Ｒα表位，为研制高效特异性强的小分子肽类免疫抑制剂奠定基础。方法：用抗ＩＬ－２Ｒα单克隆抗体５ＧＩ对噬菌体六肽库进行筛选，选择出与５ＧＩ结合较强的克隆，经ＤＮＡ序列分析，获得保守序列。对含保守序列的克隆进行生物学活性鉴定。结果：选择出３１个与５ＧＩ结合较强的克隆。获得Ｓｅｒ－Ｓｅｒ－Ａｒｇ两种保守序列。生物学活性鉴定表明：含Ｓｅｒ－Ｓｅｒ－Ａｒｇ序列克隆较含Ｓｅｒ－Ｓｅｒ－Ｐｈｅ     

呼吸道合胞病毒G蛋白胞外区基因克隆及序列分析

目的 对呼吸道合胞病毒Ｇ蛋白胞外区基因进行克隆及序列分析。方法 从ＲＳＶ感染的喘息型支气管炎患儿咽试子分离的病毒培养物中提取病毒ＲＮＡ,进行逆转录及ＰＣＲ扩增,克隆到Ｇ蛋白胞外区基因ＤＮＡ序列分析。结果 克隆片段全长６９０ｂｐ,编码一个含有２２９个氨基酸的多肽。与５个ＧｅｎＢａｎｋ中不同的ＲＳＶ分离株（包括Ａ,Ｂ亚型）的Ｇ蛋白胞外区的氨基酸序列相比,Ａ亚型的ＲＳＶ毒株氨基酸水平的同源率为９５．２％     

直接从中国人胎肝染色体DNA中克隆粒细胞集落刺激因子（G－CSF）外显子及其在大肠杆菌中的高效表达

利用聚合酶链反应（ＰＣＲ）技术，直接从正常人胎肝染色体ＤＮＡ库中分离克隆了中国人粒细胞集落刺激因子（ｃ－ＣＳＦ）外显子，全长５３７ｂｐ，它包括除信号肽氨基酸外的所有编码区，为了使克隆的Ｇ－ＣＳＦ外显子在大肠杆菌中高效表达，对其５’端进行了修饰，去除第１个编码Ｔｈｒ的密码子，在不改变氨基酸的前提下，变换为ＡＴ丰富的密码子；并将某些密码子换成大肠杆菌喜用的密码子。对于每段目的ＤＮＡ所进行的２次独立的ＰＣＲ反应所获得的产物分别进行了核苷酸序列测定。结果完全一致，证明所克隆的Ｇ－ＣＳＦ外显子的序列是可靠的，与国外发表的Ｇ－ＣＳＦ外显子序列相比，未发现变异。将上述人Ｇ－ＣＳＦ外显于基因插入ｐＢＶ２２０表达载休，构建了ｐＢＶ２２０／Ｇ－ＣＳＦ质粒，将其转化入ＤＨ５ａ菌，ＳＤＳ－ＰＡＧＥ表明其表达量约占菌体总蛋白量的２０％，用依赖性细胞系ＮＦＳ－６０进行测定，活性为５ｘ１０ｖＩＵ／Ｌ。     

逆转录病毒介导的IL－2和TNF－α融合基因在卵巢癌细胞中的表达及其对肿瘤细胞生长的影响

ＩＬ－４和ＴＮＦ－α是引人注目的抗肿瘤活性因子，两者在抗肿瘤及免疫调节方面具有协同作用。我们利用逆转录病毒载体Ｘｄ１构建了插入ＩＬ－２和ＴＮＦ－α融合基因的重组逆转录病毒载体ＸｄＦ，融合基因包括编码ＩＬ－２前导肽和ＩＬ－２和ＴＮＦ－α成熟肽的序列。重组载体用Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ方法引入病毒包装细胞ＰＡ３１７，挑选Ｇ４１８抗性克隆，用ＮＩＨ３Ｔ３细胞测定病毒滴度，获得一滴度为１×１０￣４ＣＦＵ／ｍｌ的高滴度克隆。超速离心浓缩这一重组病毒上清，转导人卵巢癌细胞系ＳＫＯＶ３，经Ｇ４１８筛选获得抗性克隆。ＰＣＲ可从融合基因转导的细胞ＤＮＡ中扩增出１．１ｋｂ的融合基因片断，证明目的基因完整的整合在细胞的基因组ＤＮＡ中，测其上清中的ＩＬ－２和ＴＮＦ－α活性结果显示：ＩＬ－２的活性为８－１５Ｕ／１０￣６ｃｅｌｌｓ／２４ｈ，ＴＮＦ－α的活性为１５０－４００Ｕ／１０￣６ｃｅｌｌｓ／２４ｈ。这一结果表明逆转录病毒介导的融合基因可以在卵巢癌细胞中获得有效表达，表达的融合基因产物在体内和体外部对肿瘤细胞的生长具有抑制作用。     

白细胞介素2基因转移的肿瘤细胞克隆的建立及其体内外生长特性的研究

为了开展ＩＬ－２基因转移后免疫原性增强的新型瘤苗抗肿瘤作用的研究，须首先获得ＩＬ－２基因转移后、能够高分泌ＩＬ－２的肿瘤细胞并确定其生长特性。本室构建了含５６３ｂｐ的小鼠ＩＬ－２全长ｃＤＮＡ的真核表达载体ＢＭＧＮｅｏ－ＩＬ－２，采用磷酸钙ＤＮＡ共沉淀法将ＢＭＧＮｅｏ－ＩＬ－２转移入Ｂ１６黑色素瘤细胞中，通过Ｇ４１８抗性筛选、有限稀释法及活性检测，获得一株高分泌ＩＬ－２（５０６Ｕ／ｍｌ）克隆，并经Ｓｏｕｔｈｅｒｎ印迹法证实ＩＬ－２基因已转入该克隆中。结果表明ＩＬ－２基因转移的肿瘤细胞体外生长能力没有明显变化，但体内致瘤原性显著下降，从而为制备新型瘤苗打下了基础。     

人IL—2／GM—CSF融合基因的克隆及序列测定

通过ＰＣＲ技术，对人ＩＬ２和ＧＭＣＳＦ基因分别改构，克隆了通过Ｐｒｏ（ＣＣＣ）连接臂相连的ＩＬ２／ＧＭＣＳＦ融合基因。经酶切鉴定和序列测定证实后，将上述融合基因克隆至原核表达载体ｐＬＹ４，为表达具有ＩＬ２，ＧＭＣＳＦ双功能活性的新型融合蛋白，以及发现细胞因子的新生物学功能等研究提供了有利条件     

肾综合征出血热患者血清IL—6测定的临床意义

应用双抗体夹心ＥＬＩＳＡ法、放射免疫测定法和间接免疫荧光测定法，同步检测了４８例ＨＦＲＳ患者血清ＩＬ６，β２ＭＧ，特异性ＩｇＭ和ＩｇＧ的动态变化。结果表明，ＨＦＲＳ患者血清ＩＬ６水平发热期已高于正常组（Ｐ＜００１），并达较高水平，少尿期达高峰，与临床病情的进展相一致；ＩＬ６、特异性ＩｇＭ和ＩｇＧ分别于病程的第６ｄ，第９ｄ及第１１ｄ达高峰，ＩＬ６与血清球蛋白呈明显的正相关，ＩＬ６与ＨＦＲＳ患者病程中特异性抗体的升高有明显关系；轻、中、重和危重型患者血清ＩＬ６与ＩｇＧ间呈正相关，且ＩＬ６随病情加重而升高。提示：ＩＬ６可能与体液免疫功能亢进所致免疫病理损伤有关，并根据ＩＬ６与血清β２ＭＧ，尿素氮（ＢＵＭ）和肌酐（Ｃｒ）均呈高度正相关，表明ＩＬ６参与了肾脏的免疫损伤。     

新生血管抑制分子IP—10／Crg—2的cDNA克隆及序列鉴定

目的： 拟获得编码ＩＰ１０ （ＩＦＮγｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｐｒｏｔｅｉｎ１０） 和Ｃｒｇ２ （ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ ｇｅｎｅ２） 的ｃＤＮＡ 序列。方法： 针对ＩＰ１０ 和Ｃｒｇ２ 的ｃＤＮＡ序列设计相应引物， 通过反转录ＰＣＲ技术， 分别从用ＩＦＮγ及ＴＮＦα处理的人成纤维细胞及Ｂａｌｂ／ｃ 小鼠肝脏中， 扩增出编码ＩＰ１０ 和Ｃｒｇ２ 的全基因序列， 并将其克隆入载体ｐＵＣ１９及ｐＧＥＭ３Ｚｆ （＋ ） 中， 通过酶切及序列测定鉴定重组载体。结果： 经序列测定证实， 重组载体含有正确地分别编码ＩＰ１０ 及Ｃｒｇ２ 的ｃＤＮＡ序列。结论： 获得的阳性克隆分别含有３０６ｂｐ 和３１４ｂｐ 的重组片段， 为进一步对其生物学活性和配体进行研究奠定了基础。     

中华鳖MHC Iα2链基因克隆及序列分析

目的：为了探明中华鳖ＭＨＣ的结构与功能和寻找该种群的分子标记，对中华鳖ＭＨＣｃｌａｓＩα２基因中由两个半胱氨酸形成二硫键的区域进行了克隆和序列分析。方法：根据人和动物的ＭＨＣＩａα２链中两个半胱氨酸侧翼的保守序列设计了混合型引物，采用ＰＣＲ法从中华鳖基因组ＤＮＡ中克隆了ＭＨＣＩα２链（ＴｒｓｉＢＸ１）。结果：经氨基酸序列的同源性分析，ＴｒｓｉＢＸ１存在抗原多肽结合位点（Ｔ１４３、Ｋ１４６、Ｗ１４７、Ｙ１５９）以及β２微球蛋白结合位点（Ｑ１１５、Ａ１１７、Ｄ１１９、Ｇ１２０、Ｄ１２２），并与人和动物的ＭＨＣＩａα２存在４１１％～６３９％同源性。结论：ＴｒｓｉＢＸ１属ＭＨＣｃｌａｓｓＩａ类基因，可作为中华鳖种群的分子标记。     

抗人RBC血型B抗原双价小分子抗体基因的构建与表达

目的： 分离抗人红细胞血型Ｂ抗原单克隆抗体（ｍＡｂ） ５Ｄ１２ 可变区基因, 构建并表达其双价小分子抗体（ｄｉａｂｏｄｙ） 融合蛋白, 为用原核细胞生产抗血型Ｂ抗原工程抗体进行基础研究。方法： 设计合成抗体重、轻链可变区引物, 通过加端ＰＣＲ技术, 在ｍＡｂ ５Ｄ１２ ＶＨ 和ＶＬ基因两端引入连结短肽和适当的限制性酶切位点,体外连接构建５Ｄ１２ ｄｉａｂｏｄｙ 基因, 并将其克隆入融合表达载体ｐＧＥＸ４Ｔ２ 中, 在Ｅ－ｃｏｌｉ ＴＧ１ 中表达。运用ＰＣＲ和双脱氧核苷酸链末端终止法分析其核苷酸序列。结果： ＤＮＡ 序列分析表明, ５Ｄ１２ ｄｉａｂｏｄｙ 基因全长为６９９ｂｐ;其中ＶＨ 长３５１ｂｐ , 编码１１７ 个氨基酸; ＶＬ 长３２４ｂｐ , 编码１０８ 个氨基酸, 两者以五肽连接头相连; 重组体表达产物经ＳＤＳＰＡＧＥ显示, ＧＳＴ５Ｄ１２ ｄｉａｂｏｄｙ 表达产物的相对分子质量（ Ｍｒ） 为５１ ０００ 左右, 与预期结果相符。光密度扫描结果表明, ＧＳＴ５Ｄ１２ ｄｉａｂｏｄｙ 融合蛋白占菌体总蛋白的２４－６％ , 表达产物主要以不溶性的包涵体形式存在。结论： 成功地构建并表达了５Ｄ１２ 双价小分子抗体基因, 在原核细胞中获得较高水平     

单纯疱疹病毒I型胸苷激酶基因部分缺失 重组质粒的构建及序列分析

目的：构建ＨＳＶ１ 型胸苷激酶基因部分缺失的重组质粒并进行序列测定。方法：以ｐ ＵＣ１８／ ＴＫ 重组质粒ＤＮＡ 为模板,用ＰＣＲ 方法扩增ＴＫ５′端５０３ｂｐ 基因片段,并将扩增的片段克隆入载体ｐ ＵＣ１８ 中（ｐ ＵＣ１８／ＴＫ１） ;用Ｐｓｔ Ｉ 和Ｈｉｎｄ Ⅲ双酶切ｐＵＣ１８／ ＴＫ, 获得ＴＫ３′端３８３ｂｐ 片段, 将此酶切片段克隆入ｐＵＣ１８／ ＴＫ１ 中, 并进行测序。结果： 构建成重组质粒ｐＵＣ１８／ ＴＫ－ 。经酶切鉴定获得１ 条约９００ ｂｐ 的基因片段; 序列测定证实, ＨＳＶ１１７ｓｙｎ ＋ ＴＫ 基因缺失了第４９３ ～７４４ 位２５１ 对碱基。结论：成功地构建了部分缺失的ＨＳＶ１／ＴＫ－ 基因重组质粒,为研制其突变株奠定了基础。     

分子伴侣基因的克隆及表达

用聚合酶链反应方法从大肠杆菌染色体ＤＮＡ中扩增得到２０００ｂｐ的ＤＮＡ片段，并克隆到ＰＧＥＭ３ｚｆ（＋）载体中，经限制性图谱分析和部分ＤＮＡ序列测定，证实２０００ｂｐ的ＰＣＲ产物为ＧｒｏＥ基因全部编序列。将ＰＣＲ产物构建在ＰＬＰＲ启动子控制下的ＰＢＶ２２０表达质粒中，转入大肠杆菌ＤＨ５ａ，经４２℃热诱导，获得ＧｒｏＥ基因的表达产物，在ＳＤＳ－ＰＡＧＥ上出现分子量约６００００（ＧｒｏＥＬ）及１５００     

大肠杆菌甲硫氨酸氨肽酶编码基因的分子克隆及其在 …

利用聚合酶链反应（ＰＣＲ）技术从大肠杆菌染色体ＤＮＡ中克隆了大肠杆菌甲硫氨酸氨肽酶约０．８ｋｂ的编码基因，序列测定表明其序列与已发表资料一致，将此０．８ｋｂ的甲硫氨酸氨肽酶的编码基因克隆到原核高效表达载体ｐＢＶ２２０上，转化大肠杆菌后进行表达，ＳＤＳ－ＰＡＧＥ表明表达产物分子量为３２０００，表达量约占菌体蛋白的２０％左右，活性测定表明其活性中达２０Ｕ／ｍｌ菌液。     

人整合素分子α4亚基片段的克隆及大肠杆菌的表达

目的 克隆并原核表达α４亚基笥段。方法 从ＩＬ－６细胞系中提取总ＲＮＡ,以ＲＴ－ＰＣＲ方法分两段扩增人整素分子α４亚基片段２．０ｋｂ ｃＤＮＡ,将两片段连接,并将其中的１．７ｋｂ基因片段亚克隆至表达载体ＰＧＥＸ－ＫＧ中,ＩＰＴＧ诱导表达。结果 ＲＴ－ＰＣＲ扩增并克隆了α４的两段ＣＤＮＡ,序列分析表明：与文献报道的μ４ＣＤＮＡ序列基本一致。两片段成功连接后将其中的１．７ｋｂ亚克隆至表达载体ＰＧＥＸ－     

IL-2R反义S-ODNs抑制人淋巴细胞增殖及IL-2R表达

ＩＬ ２Ｒα、β、γｍＲＮＡ上起始密码子ＡＵＧ的下游序列, 合成与之互补的硫代反义寡聚脱氧核糖核酸（ＩＬ ２Ｒα、β、γＳ ＯＤＮｓ） , 长度为２０ｎｔ。实验结果表明,ＩＬ ２ＲαＳ ＯＤＮｓ 对外周血淋巴细胞生长最高抑制率可达到８１－９２％ ; 而ＩＬ ２ＲβＳ ＯＤＮｓ和ＩＬ ２ＲγＳ ＯＤＮｓ 的抑制作用较低, 其最高抑制率均为５９－１ ％ 。在１０μｍｏｌ／ＬＩＬ ２ＲαＳ ＯＤＮｓ 作用后的第４８ 小时,ｓＩＬ ２Ｒ 的表达下降８０％ ; ｍＩＬ ２Ｒα的表达下降５１－５％ 。