马兜铃酸Ⅰ致肾小管上皮细胞DNA损伤的逆转性实验

目的:研究探讨马兜铃酸Ⅰ(AAⅠ)对猪肾小管上皮细胞(LLC -PK1细胞)DNA损伤和细胞周期阻滞是否具有可逆性。　方法:采用LLC- PK1细胞为实验对象,选择不同浓度的AAⅠ(80, 320,和1 280ng/ml)体外刺激LLC- PK1细胞24h,然后去除含有AAⅠ的培养基,换不含AAⅠ的培养基继续培养细胞24和48h。同时设不加AAⅠ的细胞为对照组。采用单细胞凝胶电泳(又称彗星实验)检测经不同剂量AAⅠ处理的LLC- PK1细胞不同时间点DNA损伤情况,流式细胞仪技术检测它们对LLC -PK1细胞周期的影响。　结果:AAⅠ(80ng/ml)组细胞彗星实验为阴性,但AAⅠ(320和1 280ng/ml)导致细胞DNA损伤,出现明显的彗星拖尾现象,且细胞在G2 /M期的比例也明显增加,均呈剂量依赖性(P<0. 01 )。用不含AAⅠ的培养基继续培养细胞24和48h后,AAⅠ( 320ng/ml)组彗星拖尾现象明显减轻至消失,G2 /M期细胞的比例与同时间对照组比较无明显差异(P>0 .05 )。而AAⅠ(1280ng/ml)组彗星拖尾现象无明显改善(P<0. 01),G2 /M期细胞的比例仍明显高于同时间正常对照组(P<0 .05)。　结论:AAⅠ可导致LLC- PK1细胞DNA损伤,使细胞周期阻滞在G2 /M期。低剂量AAⅠ造成的DNA损伤可完全恢复,细胞进入正常的细胞周期,但高剂量所致DNA损伤不可逆转。     

马兜铃酸诱导肾小管上皮细胞损伤中Ngal和Kim-1的变化及其意义

目的:研究马兜铃酸(AA)损伤的肾小管上皮细胞中急性肾损伤标志物中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(Ngal)、肾损伤因子(Kim-1)的表达、分泌特点,并对其在AA肾毒性损伤中的意义进行探讨。方法:采用20μg/mlAA作用于体外培养人近端肾小管上皮细胞(HK2细胞),通过RT-PCR和免疫荧光法分别检测Ngal、Kim-1基因和蛋白的表达,ELISA法检测培养上清中Ngal、Kim-1的分泌,底物显色法监测培养上清中N-乙酰-β-葡萄糖苷酶(NAG)的释放,流式细胞术观察细胞周期改变和凋亡情况。结果:AA处理HK2细胞6～12h内,Ngal基因呈一过性表达增加,而Kim-1基因在处理24～48h内持续高水平表达。培养上清中Ngal、Kim-1和NAG的分泌呈不同变化规律:给药12h出现Ngal的一过性分泌高峰;Kim-1的分泌高峰出现在24h并持续48h;NAG的分泌在12h后开始增加,并持续增加至48h。诱导Ngal、Kim-1表达和诱导细胞凋亡的AA有效剂量不同。诱导Ngal和Kim-1显著分泌的AA剂量仅引起少量细胞凋亡;而引起大量细胞凋亡的AA剂量不能诱导Ngal和Kim-1分泌。结论:AA诱导的肾小管上皮细胞损伤伴有Ngal和Kim-1的异常表达和分泌。Ngal是AA损伤早期一过性表达和分泌的分子,而Kim-1和NAG则在损伤过程中呈持续分泌,因此对于临床监测AA所致肾小管损伤具有重要意义。Ngal和Kim-1在AA所致肾小管上皮细胞损伤中的异常表达,为进一步阐明AA肾毒性机制以及临床上早期发现马兜铃酸肾病提供了新的指标。     

单细胞凝胶电泳检测吸烟者外周血淋巴细胞DNA的损伤

目的检测吸烟者外周血淋巴细胞DNA的损伤状况,探讨单细胞凝胶电泳在分子流行病学研究中的应用价值.方法单细胞凝胶电泳.结果吸烟者的外周血淋巴细胞DNA损伤显著重于非吸烟者,拖尾长度分别为(27.5±2.8)μm和(16.2±1.5)μm;尾矩分别为11.3±1.7及3.0±0.9,并且呈现剂量反应关系;随着吸烟剂量的增加,外周血淋巴细胞的DNA损伤加重.结论吸烟可以造成外周血淋巴细胞DNA损伤.单细胞凝胶电泳能够较灵敏地反映人群因有毒化学物质造成的DNA损伤,在分子流行病学研究中具有重要的应用价值.     

用SCGE法观察砷、氟、黄绿青霉素和T-2毒素引起的SGC-7901细胞基因组DNA损伤

目的观察砷、氟、黄绿青霉素和T-2毒素对SGC-790l细胞基因组DNA的损伤作用及特点。方法染毒剂量lOμmol／L，染毒后4h应用单细胞凝胶电泳技术结合“彗星图像分析系统”检测DNA损伤。结果NaAsO2组尾长明显大于对照组；NaF组拖尾率显著高于对照组；CIT组总拖尾率、尾长和尾动量均高于对照组；而T-2毒素组各指标均高于对照组。结论NaAsO2、NaF、CIT和T-2毒素均可引起DNA损伤，但各有特点，说明它们引起DNA损伤的机制可能是不同的。     

砷与氟单独及联合染毒对SGC-7901细胞基因组DNA损伤作用的SCGE法观察

目的观察砷、氟及砷氟联合染毒对SGC-7901细胞基因组DNA的损伤作用及特点。方法砷、氟染毒剂量10μmol／L，染毒后4h应用单细胞凝胶电泳技术结合彗星图像分析系统检测DNA损伤。结果①NaAsO2组尾长和尾动量明显大于对照组，NaF组拖尾率显著高于对照组；②氟砷联合染毒组拖尾率、尾DNA含量、尾长和尾动量与对照组差异均有显著意义，但氟与砷引起的DNA损伤作用之间没有观察到交互作用。结论NaAsO2与NaF均可引起DNA损伤，但它们的损伤机理可能是不同的；氟与砷联合染毒仅表现为简单相加作用。     

SO2慢性染毒对中国仓鼠肺成纤维细胞DNA损伤的实验研究

目的 探讨低浓度SO2长期暴露对哺乳动物肺细胞DNA的影响.方法 采用单细胞凝胶电泳技术(彗星试验)观察不同染毒浓度SO2对中国仓鼠肺成纤维细胞(chinese hamster lung fibroblast,CHL)DNA的损伤作用及其程度,以研究其致癌作用和致癌机制.结果 SO2浓度为(20±1)mg/m3、(30±1) mg/m3时,CHL细胞的细胞核DNA迁移长度分别为(11.23±2.56)μm、(23.33±19.65)μm,拖尾长度明显增加(P＜0.01).结论 浓度较低的SO2也具有引起哺乳动物肺细胞DNA突变的潜在危险.     

高糖诱导的牛视网膜毛细血管周细胞氧化应激与DNA损伤

体外培养3代融合的牛视网膜血管周细胞,分别在对照组(5.5mmol/L)与高糖各组(15,25,35mmol/L)中孵育6d,透射电镜观察周细胞超微结构改变,硫代巴比妥酸法检测培养液丙二醛(MDA)水平;黄嘌呤氧化酶反应系统检测培养液超氧化物歧化酶(SOD)水平;单细胞凝胶电泳检测DNA损伤情况。结果与对照组相比,高糖各组MDA含量/SOD活力比值增加(P0.01)。高糖各组周细胞彗尾长度及拖尾率均增高,差异有统计学意义(P0.01),相同剂量组周细胞彗尾长度与MDA/SOD比值呈正相关(r=0.729,P0.01)。结论:高糖可引起牛视网膜毛细血管周细胞氧化应激和DNA损伤,氧化应激可能在高糖诱导的牛视网膜毛细血管周细胞DNA损伤中起重要作用。     

用SCGE法观察砷、氟单独及联合染毒致SGC-7901细胞基因组DNA的损伤作用

目的观察砷、氟及砷氟联合染毒对SGC-7901细胞基因组DNA的损伤作用及特点.方法染毒剂量分别为10、5和1μmol/L,染毒后4 h应用单细胞凝胶电泳技术结合"彗星图像分析系统"检测DNA损伤.结果①剂量为10μmol/L和5 μmol/L时NaAsO2没有增加受累细胞的数量,增加了已受损细胞DNA的损伤程度;NaF染毒只是增加了受累细胞的数量,并没有增加受累细胞DNA的损伤程度;②氟砷联合染毒组拖尾率、尾DNA百分含量、尾长和尾动量与对照组均有显著差异,但氟与砷引起的DNA损伤作用之间没有观察到交互作用.结论 NaAsO2与NaF均可引起DNA损伤,但它们的损伤机制可能是不同的;氟与砷联合染毒仅表现为简单相加作用.     

百令提取液对环孢素A导致肾小管损伤的防治作用

目的：从细胞水平观察百令提取液对环他素A(CsA)肾毒性的影响。方法：体外培养肾小管上皮细胞，通过^3H-TdR掺入、MTT比色法、PI染色法和细胞LDH释放等观察百令提取液对CsA引起的肾小管上皮细胞毒性的防治作用。结果：^3H-TdR掺入和MTT比色法显示在一定的剂量范围百令提取液可明显促进培养的肾小管上皮细胞增生，5mg／L以上的CsA抑制细胞增殖；细胞周期的石研究显示15mg／L以上的CsA使小管上皮细胞细胞周期5且滞在G2期；此外，更大剂量的CsA(25mg／L)对细胞有直接的毒性作用，使培养上清LDH值升高。百令提取液能部分逆转CsA引起的细胞增殖受抑和细胞周期阻滞，但足对CsA导致的细胞培养上清LDH的升高没有明显的影响。结论：本研究证实了百令提取液可以促进体外培养的肾小管上皮细胞增生，对CsA的肾小管细胞毒性具有一定的拈抗作用。     

H_2O_2致小鼠淋巴细胞DNA的损伤及修复

目的　应用单细胞电泳检测 (SCGE)过氧化氢 (H2 O2 )致小鼠淋巴细胞 DNA损伤及其修复。方法　标准 SCGE条件下荧光显微镜观察。结果　 H2 O2 不同浓度 80、16 0和 32 0μmol/ L ,3个组 H2 O2 浓度均可致小鼠淋巴细胞 DNA损伤 ,较低剂量即可造成细胞拖尾 ,可逆性损伤在 6 0 m in内可获得明显修复。结论　单细胞电泳可快速灵敏地检测氧化损伤 ,也可能用于流行病学研究。     

应用单细胞凝胶电泳比较研究砷对人类细胞DNA的损伤

目的：探讨不同细胞对砷的基因毒性反应及其机理,探讨快速,敏感及经济的细胞基因毒性检测方法。方法：应用单细胞凝胶电泳（Single cell gel electrophoresis,SCGE)或彗星试验（comet assay)比较研究,结果;细胞DNA损伤与砷处理量间呈显著的剂量反应关系和时效关系。受试细胞对砷的基因毒性反应的敏感性强弱顺序为：PMA－HL60＞DMSO－HL60＞HL60＞淋巴细胞,人工计数彗星尾分级频数与计算机自动测量慧星尾DNA泳动量的结果完全一致,用非参数Mann-Whitney多变量检验分析彗星尾分级频数的显著性与参数Tukey多变量检验分析量彗星尾DNA泳动量的显著性完全相同,而且不同浓度的砷与5级彗星尾频数的相关性比其与阳性彗星尾总数间的更为显著,结论：微量砷即可引起细胞不同程度的DNA损伤,不同细胞亚群对砷的基因毒性反应不同,SCGE是一个简便,快速,敏感及经济的细胞基因毒性检测方法,可应用于各级水平的环境与人类疾病（砷污染）监测与研究。     

马兜铃酸I诱导人肾小管上皮细胞转分化的作用及机制

目的：探讨马兜铃酸Ｉ（Ａｒｉｓｔｏｌｏｃｈｉｓ ａｃｉｄ Ｉ,ＡＡＩ）在人类肾小管上皮细胞（ＨＫＣ）转分化中的可能作用,了解ＡＡＩ引起肾小管间质损害的机制。方法：将体外培养ＨＫＣ细胞分为无血清对照组（Ｃ组）和ＡＡＩ实验组两组,波形蛋白和α－平滑肌肌动蛋白（α－ｓｍｏｏｔｈ ｍｕｓｃｌｅ ａｃｔｉｎ,α－ＳＭＡ）表达的变化;应用流式细胞技术检测表达α－ＳＭＡ阳性（＋）的ＨＫＣ细胞百分率;采用免疫酶标     

HT-2毒素致DNA损伤的单细胞电泳观察

目的　测定HT-2毒素对Hela细胞DNA的损伤作用,检验单细胞电泳法（SCGE）在人群试验中的可行性。方法　应用SCGE和细胞生长抑制实验（MTT）。结果　HT-2毒素具有致DNA损伤的作用,并随着毒素剂量的增加,DNA损伤程度加重。800ng/ml的尾长为（28.4±5.67）μm,1600ng/ml时为（55.8±10.47）μm,呈剂量反应关系。结论　HT-2毒素具有致细胞DNA损伤的作用。     

Observation of DNA damage of human hepatoma cells irradiated by heavy ions using comet assay

AIM: Now many countries have developed cancer therapy with heavy ions, especially in GSI (Gesellschaft f r Schwerionenforschung mbH, Darmstadt, Germany), remarkable results have obtained, but due to the complexity of particle track structure, the basic theory still needs further researching. In this paper, the genotoxic effects of heavy ions irradiation on SMMC-7721 cells were measured using the single cell gel electrophoresis (comet assay). The information about the DNA damage made by other radiations such as X-ray, gamma-ray, UV and fast neutron irradiation is very plentiful, while little work have been done on the heavy ions so far. Hereby we tried to detect the reaction of liver cancer cells to heavy ion using comet assay, meanwhile to establish a database for clinic therapy of cancer with the heavy ions. METHODS: The human hepatoma cells were chosen as the test cell line irradiated by 80 Mev/u (20)Ne(10+) on HIRFL (China), the radiation-doses were 0, 0.5, 1, 2, 4 and 8 Gy, and then comet assay was used immediately to detect the DNA damages, 100-150 cells per dose-sample (30-50 cells were randomly observed at constant depth of the gel). The tail length and the quantity of the cells with the tail were put down. EXCEL was used for statistical analysis. RESULTS: We obtained clear images by comet assay and found that SMMC-7721 cells were all damaged apparently from the dose 0.5 Gy to 8 Gy (t-test: P<0.001, vs control). The tail length and tail moment increased as the doses increased, and the number of cells with tails increased with increasing doses. When doses were higher than 2 Gy, nearly 100 % cells were damaged. Furthermore, both tail length and tail moment, showed linear equation. CONCLUSION: From the clear comet assay images, our experiment proves comet assay can be used to measure DNA damages by heavy ions. Meanwhile DNA damages have a positive correlation with the dose changes of heavy ions and SMMC-7721 cells have a great radiosensitivity to (20)Ne(10+). Different reactions to the change of doses indicate that comet assay is a useful tool to detect DNA damage induced by heavy ions.     

低剂量T-2毒素与脱氧雪腐镰刀菌烯醇单独及联合染毒对小鼠末梢血有核细胞DNA损伤的观察

目的 观察低剂量T-2毒素和脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)对小鼠末梢血有核细胞DNA损伤的特点及其程度,探索亚临床剂量下的毒性作用.方法 3周龄雌性Balb/c小鼠80只,体质量(14.0±1.5)g.将小鼠按体质量随机分为对照组、T-2毒素组、DON组、T-2+DON联合组,每组20只.经腹腔注射感染毒素,染毒剂量:T-2毒素5 μg·kg-1·d-1,DON 20 μg·kg-1·d-1;对照组给予等量生理盐水.染毒至16周和21周,分别取小鼠尾血,用单细胞凝胶电泳法(SCGE)观察小鼠末梢血有核细胞拖尾率、尾DNA含量、尾长、尾动量变化.结果 ①T-2毒素组,尾DNA含量、尾长、尾动量[16周:(27.71±15.85)%、(13.67±5.56)μm、4.26±3.83;21周:(28.38±15.57)%、(13.83±5.47)μm、4.37±3.82]均增加,与对照组[16周:(11.87±4.61)%、(10.59±6.70)μm、1.34±0.98;21周:(11.31±3.94)%、(10.83±7.05)μm、1.29±1.01]比较,差异有统计学意义(P均<0.05);②DON组拖尾率、尾DNA含量、尾动量[16周:5.62%、(28.13±13.31)%、3.39±2.35;21周:7.71%、(29.17±15.12)%、5.70±4.17]均增加,其中仅拖尾率与对照组(16周:4.34%;21周:4.38%)比较,差异有统计学意义(P均<0.05);③T-2+DON联合组拖尾率、尾DNA含量、尾长、尾动量[16周:6.21%、(30.14±15.48)%、(16.93±6.58)μm、5.54±4.22;21周:8.17%、(30.85±15.76)%、(17.21±6.45)μm、5.70±4.17]均增加,与对照组比较差异有统计学意义(P均<0.05);与T-2毒素或DON组比较,尾DNA含量和尾长均增加(P均<0.05).结论 低剂量T-2毒素和DON均可对小鼠未梢血有核细胞DNA产生明确损伤;T-2和DON联合染毒较单独染毒的损伤作用更明显.     

白蛋白结合型紫杉醇对人骨肉瘤OS-732细胞的体外抑制作用观察

目的观察白蛋白结合型紫杉醇（Abraxane）对人骨肉瘤OS-732细胞的体外抑制作用。方法取传代第3天、处于指数增殖期的人骨肉瘤OS-732细胞,分别加入不同浓度的阿霉素、紫杉醇（泰素）和Abraxane培养,于培养24、72、144 h时用MTT法测定细胞的光密度值（OD值）并计算细胞毒性指数（CI）,倒置相差显微镜观察细胞形态,流式细胞术检测细胞周期。结果骨肉瘤OS-732细胞加入Abraxane后,OD值下降,以加入100、1 000μg/ml的Abraxane组及培养72、144 h时下降明显,CI则相应升高,同时细胞变小、核碎裂,G2～M期细胞的比例逐渐增加;除100μg/ml浓度处理24 h和72 h后,泰素处理组的CI高于Abraxane组外,两组相同浓度、相同处理时间的CI相近;最高剂量Abraxane和最高剂量阿霉素组的CI也相近。结论 Abraxane在体外对骨肉瘤OS-732细胞有显著的抑制作用,能将骨肉瘤细胞阻滞于G2～M期。Abraxane与泰素和阿霉素的细胞毒性相似。     

DNA fragmentation in developing lung fibroblasts exposed to Stachybotrys chartarum (atra) toxins

Stachybotrys chartarum (atra) is a toxic mold that grows on water-damaged cellulose-based materials. Research has revealed also that inhalation of S. chartarum spores caused marked changes in respiratory epithelium, especially to developing lungs. We analyzed the epigenetic potential of S. chartarum spore toxins on developing rat lung fibroblasts using single cell gel electrophoresis (comet assay). Isolated fetal lung fibroblasts were exposed to S. chartarum spore toxins for 15 min, 3, 14, or 24 hr and control cells were exposed to saline under the same conditions. Cells were embedded in agarose, electrophoresed under alkaline conditions and silver stained. DNA damage was assessed in terms of fragmentation as measured by comet tail length (DNA migration) and intensity (% DNA contained within head and tail). Upon visual inspection, control fibroblasts showed no DNA fragmentation whereas S. chartarum-treated cells had definable comets of various degrees depending upon the time-course. Analyses of the comets revealed that exposure to S. chartarum spore toxins for at least 15 min to 14 hr, induced increased DNA fragmentation in a time-dependent manner. The fact that exposure to toxins for 24 hr showed less damage suggested that developing lung fibroblasts may have the capability of repairing DNA fragmentation.     

棘霉素诱导肝癌SMMC7721细胞凋亡的研究

目的研究棘霉素诱导肝癌SMMC7721细胞凋亡的作用,探讨其抗肿瘤的作用机制。方法通过细胞计数获得不同浓度棘霉素作用SMMC7721细胞的生长抑制率,观察棘酶素对肝癌细胞生长的影响;通过流式细胞仪分析棘霉素对细胞凋亡和细胞周期的影响。结果棘霉素浓度〉10 ng/ml时可抑制SMMC7721细胞的生长。结论棘霉素在体外可诱导肝癌细胞凋亡,具有很强的抗肿瘤作用。     

干扰素α对Ⅰ型胶原及转化生长因子β1基因表达的影响

目的 观察干扰素α(IFN α)对血小板衍生生长因子-BB(PDGF-BB)刺激的大鼠肝星状细胞(HSC)分泌Ⅰ型胶原及转化生长因子β1(TGF β1)基因表达的影响,探讨IFN α抗肝纤维化的可能机制.方法 体外培养大鼠HSC系rHSC-99,分别用0、0.0125、0.0250、0.0500,0.1000、0.2000,0.4000 ng/ml IFN α,PDGF-BB干预和两者共同干预,用四甲基偶氮唑盐实验观察各组对HSC细胞活力的影响,采用逆转录聚合酶链反应方法测定各组对HSC细胞Ⅰ型胶原mRNA和TGF β1 mRNA表达的影响.结果 (1)HSC细胞活力(A值)PDGF-BB干预组为1.35±0.22,空白对照组为0.89±0.12,两组比较,F=16.311,P＜0.05,差异有统计学意义,说明PDGF-BB可提高HSC细胞活力.0.025,0.050、0.100、0.2000,0.400ng/ml IFN α加PDGF-BB共干预组,A值分别为0.84±0.18.0.45±0.15、0.26±0.01、0.33±0.07,0.30±0.06,较空白对照组明显降低,F=7.430,P＜0.05,差异有统计学意义,说明IFN α与PDGF-BB共同作用可抑制HSC细胞活力,且在0.025-0.100 ng/ml范围内随着IFN α浓度的增加其抑制作用越明显.(2)0.050、0.100、0.200ng/ml IFN α加PDGF-BB共干预各组Ⅰ型胶原mRNA相对表达值分别为0.94±0.19、0.61±0.12,0.52±0.02,空白对照组为1.41±0.01,共干预各组比空白对照组均明显降低,F=127.921,P＜0.05,差异有统计学意义.0.050、0.100,0.200ng/mlIFN α加PDGF-BB共干预组各组TGFβ1 mRNA相对表达值分别为1.18±0.06、1.15±0.10、1.39±0.04,空白对照组为1.62±0.12,共干预各组比空白对照组均明显降低,F=82.115,P＜0.05,差异有统计学意义,说明IFN α与PDGF-BB共同作用对HSC细胞Ⅰ型胶原、TGFβ1基因的表达有抑制作用,且随着浓度的增加其抑制作用越明显.结论 IFN α对PDGF-BB诱导的HSC细胞活力及Ⅰ型胶原、TGF β1基因的表达有抑制作用,且随着浓度的增加其抑制作用越明显.这可能是IFN α发挥抗肝纤维化作用的途径之一.