基于多重PCR技术检测蜡样芽胞杆菌3种毒素基因方法的建立及评价

目的：基于多重PCR技术,建立一种快速检测蜡样芽胞杆菌nhe、cytK和entFM 3种毒素基因的方法,并评价其效能。方法：煮沸法提取蜡样芽胞杆菌DNA,以蜡样芽胞杆菌nhe、cytK和entFM特异性毒素基因作为靶基因,采用NCBI primer-BLAST 5.0软件设计特异性引物,优化反应体系。建立三重PCR检测体系,并检测其特异性、灵敏度和稳定性。结果：煮沸法提取蜡样芽胞杆菌DNA,浓度为227 mg·L^-1,纯度为1.50～1.60。采用多重PCR体系同时检测蜡样芽胞杆菌3种毒素致病基因,于退火温度56℃时,蜡样芽胞杆菌基因引物nhe499的扩增片段为499 bp,基因引物cytK191的扩增片段为191 bp,基因引物entFM363的扩增片段为363 bp。PCR体系扩增蜡样芽胞杆菌3种毒素基因后条带清晰明亮,且无非特异性条带,与金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌和铜绿假单胞菌均无扩增,表明蜡样芽胞杆菌基因引物nhe499、cytK191和entFM363特异性强;3种引物在同一反应体系中互不干扰。灵敏度检测,多重PCR体系最低检测限可同时达到10^...     

五种生物恐怖细菌基因悬浮芯片多重检测方法的建立

目的 建立5种生物恐怖细菌的快速、高通量的基因悬浮芯片检测方法 ,即炭疽芽胞杆菌、鼠疫耶尔森菌、布鲁菌、土拉弗朗西斯菌和类鼻疽伯克霍尔德菌的多重检测.方法 针对炭疽芽孢杆菌、鼠疫耶尔森菌、布鲁菌、土拉弗朗西菌、类鼻疽伯克霍尔德菌的特异性基因序列设计6对引物和相应的特异性探针,经多重PCR扩增并用生物素标记相应的基因片段,标记的PCR产物与包被在不同编码微球上的相应探针杂交,用悬浮芯片扫描仪检测.结果 多重PCR悬浮芯片检测体系能够正确的检测和鉴定5种生物恐怖细菌,特异性好,灵敏度高,可用于恐怖样本的高通量筛查.结论 建立了多重PCR基因悬浮芯片快速检测几种生物恐怖细菌的方法 .     

多重PCR检测蜡样芽胞杆菌的研究

目的 建立多重PCR方法检测蜡样芽胞杆菌.方法 根据蜡样芽胞杆菌(B.cereus)的hblA、hblC、nheA、nheB、cytK、cer、entFM、bceT基因和苏云金芽胞杆菌(B.thuringiensis)的cry基因设计引物,优化反应条件.应用单一引物PCR和国标法对多重PCR反应结果进行确认.结果 蜡样芽胞杆菌溶血性基因hblA和hblC检出率为57.5％和25.0％,非溶血性基因nheA、nheB检出率分别为75.0％和80.0％,细胞毒素cytK基因检出率为37.5％.肠毒素entFM和bceT检出率分别为28.7％和18.7％.蜡样芽胞杆菌和苏云金芽胞杆菌cer基因检出率分别为97.5％和100.0％,cry基因检出率为分别为0.0％和100.0％.cer基因和cry基因同时检测,条带区分清晰,可作为蜡样芽胞杆菌和苏云金芽胞杆菌快速鉴别的首选方法.结论 三重PCR结果非常好,三对引物所扩增出的DNA条带明显区分开,电泳条带清晰,敏感度高,特异性强.单重PCR和三重PCR检测结果没有显著性差异.     

辽宁省2021—2022年餐饮食品蜡样芽胞杆菌毒力基因和耐药特征检测

目的 了解辽宁省2021—2022年食品中蜡样芽胞杆菌（Bacillus cereus）污染状况、携带的毒力因子及药物敏感性的特征。方法 对辽宁省2021—2022年分离自15个监测点4大样品种类共620份样品,应用GB4789.14—2014进行分离鉴定蜡样芽胞杆菌,并用PCR方法进行菌群特异性基因groEL和gyrB及11种毒力基因检测;采用微量肉汤稀释法检测菌株对抗生素的敏感性。结果 79株蜡样芽胞杆菌都检出了蜡样芽胞杆菌毒力基因,占比较大的分别是非溶血性的肠毒素nheC、nheA和nheB,检出率分别是100.0%(79/79)、93.3%(74/79)和83.5%(66/79),肠毒素entFM基因检出率98.7%(78/79)。79株餐饮食品中蜡样芽胞杆菌携带19种毒力基因模式,基因模式中IX和XVII比例最多占到16.5%(13/79)。79株蜡样芽胞杆菌对氨苄西林、青霉素耐药率均为100.0%,对氯霉素、庆大霉素耐药率均为0;对其他6种抗菌药物的耐药率分别为：复方磺胺甲恶唑65.8%(52/79)、亚胺培南10.1%(8/79)、红霉素73.4%(58/79)、克林霉素...     

核酸试纸条快速检测蜡样芽胞杆菌entFM毒素基因方法的建立

目的 基于核酸试纸条技术,建立一种快速检测蜡样芽胞杆菌entFM毒素基因的方法。 方法 煮沸法提取蜡样芽胞杆菌DNA,以蜡样芽胞杆菌entFM毒素基因作为靶基因,采用NCBI primer-BLAST 5.0软件设计特异性引物并通过克隆转化鉴定PCR产物,建立并组装核酸试纸条,评价核酸试纸条的特异性、灵敏度和稳定性。 结果 蜡样芽胞杆菌DNA浓度为300 mg?L^－1,纯度约为1.60。PCR产物阳性条带经切胶回收、克隆转化和测序比对,与GenBank数据库中已登记的entFM相似性为100%。在pH值7.0条件下,每100 μL 胶体金溶液加入3.3 μg链霉亲和素浓度标记,质控线浓度为1.8 g?L^－1,检测线浓度为1 g?L^－1时,硝酸纤维素膜上质控线与检测线均可与PCR产物反应出现清晰的红色条带。按照最适条件组装成核酸试纸条,PCR产物6 μL,样品展开液100 μL,检测10 min后可观察结果。核酸试纸条特异性与电泳结果一致,仅蜡样芽胞杆菌为阳性结果,与金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞杆菌、大肠埃希菌和沙门氏菌皆无交叉反应,为阴性结果;灵敏度检测,核酸试纸条DNA质量浓度同时降至10^－3 mg?L^－1仍可准确检测,普通PCR电泳结果显示DNA质量浓度同时降至10^－1 mg?L^－1出现目的条带,核酸试纸条比普通PCR灵敏度提高100倍;稳定性检测,核酸试纸条在第6、9和12个月进行检测稳定性一致。 结论 建立的核酸试纸条检测蜡样芽胞杆菌entFM毒素基因灵敏度高、特异性强且具有良好稳定性,适用于快速鉴别蜡样芽胞杆菌entFM毒素基因。     

rpoB作为蜡样芽胞杆菌群快速检测的标志基因的实验研究

目的探讨常规PCR和实时荧光定量PCR(Q-PCR)方法检测蜡样芽胞杆菌群rpoB基因的特异性和敏感性。方法提取蜡样芽胞杆菌群和其他各种对照细菌的基因组DNA,合成蜡样芽胞杆菌群rpoB基因扩增引物,采用常规PCR和SYBRgreen实时定量PCR两种方法扩增rpoB基因片段,并将PCR产物克隆到pMD18-T载体后进行DNA测序。结果常规PCR和Q-PCR均能扩增出蜡样芽胞杆菌群rpoB基因的174bpDNA片段,而各种对照菌株均未见扩增。序列比对发现蜡样芽胞杆菌群细菌在该片段中存在5处核苷酸的不同,差异率为2.88%。以炭疽芽胞杆菌基因组DNA系列稀释作为扩增模板显示常规PCR最小检出量为3.42pg,Q-PCR的敏感性达到171fg,3次重复实验显示Q-PCR检测rpoB基因的灵敏度为(3.32×101±7.45×100)拷贝。结论以rpoB基因为检测靶基因的Q-PCR方法具有高度的特异性和良好的敏感性,能实现对蜡样芽胞杆菌群快速而准确的检测。     

海口市市售海南粉中蜡样芽胞杆菌污染及毒力基因携带率调查

目的 调查海口市市售海南粉中蜡样芽胞杆菌污染情况及毒力基因分布,为海口市市售海南粉中蜡样芽胞杆菌污染防控策略制定提供依据。方法 对采集自海口市四个区四类销售点的219份海南粉样品进行蜡样芽胞杆菌的分离鉴定,并用普通PCR方法检测菌株的10种毒力基因,采用统计学方法分析不同地区、不同销售点来源的海南粉中蜡样芽胞杆菌的检出率和毒力基因携带率差异。结果 海口市售海南粉的蜡样芽胞杆菌总检出率为62.6%（137/219）。美兰区检出率最高,为77.1%（81/105）,龙华区最低,为44.3%（27/61）。四类销售点中流动餐车检出率最高,为76.9%（20/26）,大中型饭店最低,为23.1%（9/39）。非溶血性肠毒素基因和entFM基因为研究菌株携带的主要毒力基因,美兰区和龙华区菌株的hblA和hblD基因携带率高于其他两区,其余基因在不同地区间无统计学差异;不同销售点的菌株毒力基因携带率无统计学差异显著性。结论 海口市售海南粉蜡样芽胞杆菌污染较为严重,在美兰区和小餐馆尤为严重,应加大力度进行食品安全监管。     

食源致病菌96 微孔板DNA 诊断芯片的研制及在一起食物中毒突发事件中的应用

目的研制能同时检测9种常见食源致病菌的96微孔板DNA诊断芯片。方法针对金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、大肠杆菌O157:H7(Stx1和Stx2)、志贺氏菌、产单核细胞李斯特菌、蜡样芽胞杆菌、小肠结肠炎耶尔森菌、副溶血弧菌、霍乱弧菌等9种最常见的食源性致病菌,首先选择合适的保守基因,设计种特异性的PCR引物(5'端标记生物素)和检测探针,通过参数优化建立一管多重PCR扩增体系;然后按5×5的阵列格式将探针点制到96微孔板的微孔内,通过条件优化建立稳定的PCR产物与固化探针的微孔杂交体系;采用链霉抗生物素蛋白碱性磷酸酶和化学显色底物NBT/BCIP来检测特异性的PCR杂交产物。结果20株标准菌株验证已建立的食源致病菌微孔板DNA诊断芯片,获得比较特异和稳定的实验结果。在一起食物中毒事件中,该芯片在采样后12h内检出金黄色葡萄球菌,与传统的细菌分离培养和生化鉴定的结果相符。结论本研究建立的新型食源致病菌96微孔板DNA诊断芯片具有快速、准确、自动化和高通量等特点,为快速应对食物中毒等突发公共卫生事件提供了非常有价值的检测技术。     

PCR法检测葡萄球菌肠毒素A基因

目的 建立PCR方法快速检测葡萄球菌肠毒素A(Staphylococcal enterotoxin A,SEA)基因.方法 根据SEA基因的序列,设计PCR引物特异性扩增靶基因片段,对1株产SEA金黄色葡萄球菌和9株对照菌株进行PCR检测,评价其特异性和敏感性.另检测30株金黄色葡萄球菌SEA基因的携带情况.结果 建立PCR方法快速检测SEA基因,扩增产物长度为439bp.PCR反应体系中有29cfu的产SEA金黄色葡萄球菌即可检出SEA基因,30株分离的金黄色葡萄球菌中有10株携带有SEA基因.结论 PCR法可以快速、敏感地检测SEA基因,为金黄色葡萄球菌食物中毒诊断提供依据.     

微滴式数字聚合酶链反应检测金黄色葡萄球菌和蜡样芽孢杆菌

目的 采用微滴式数字聚合酶链式反应(ddPCR)技术快速检测饲料中金黄色葡萄球菌和蜡样芽孢杆菌,以满足对猪饲料中病原体精准检测需求.方法 通过已建立的荧光定量PCR方法中引物和探针,建立优化ddPCR条件,梯度稀释质粒,进行特异性、敏感性、重复性实验以及市售10种样品的本底检测.结果ddPCR法检测金黄色葡萄球菌和蜡样...     

血栓性疾病个体化用药指导基因芯片试剂盒的制备和效果评价

目的：探讨血栓性疾病（TD）个体化用药指导基因芯片的制备过程,阐明一种快速、高通量检测氯吡格雷和华法林药物代谢基因的方法。方法：根据氯吡格雷药物代谢基因位点（CYP3A4、CYP2C19*17、CYP2C19*2和CYP2C19*3）和华法林药物代谢基因位点（CYP4F2*3、GGCX、VKORC1-2、VKORC1-1、CYP2C9*2和CYP2C9*3）设计相应的探针和引物,制备TD个体化用药指导的基因芯片检测试剂盒。经过DNA提取、PCR扩增、杂交、洗脱和扫描等步骤对基因芯片的灵敏性、重复性和稳定性进行评价。收集3个地区的150例TD受试者样本并进行药物代谢基因检测,以受试者在临床中接受的用药指导及6个月后患者的疾病恢复情况为依据,评价基因芯片试剂盒的有效率。结果：基因芯片检测2种药物的代谢基因均出现良好的杂交信号;芯片检测PCR扩增产物的最低检测浓度为10³ copies·mL^-1;对不同批次的3张芯片及同一批次的10张芯片进行平行测定,符合率为100%;芯片具有稳定性,有效期长达6个月;来源于3个地区的150例TD样本验证基因芯片检测试剂盒的有效率在90%以上。结论：成功制备了高通量检测氯吡格雷和华法林药物代谢基因的TD个体化用药指导基因芯片试剂盒,该方法灵敏度高,重复性好,稳定性强,制备效果优良。     

Luminex液相芯片同时检测tPSA和fPSA方法的建立与评价

 目的 建立用Luminex液相芯片技术同时测定前列腺特异性抗原（total prostate specific antigen,tPSA）和游离前列腺特异性抗原（free prostate specific antigen,fPSA）的方法,并对该方法进行评价。方法 制备抗体交联微球及藻红蛋白标记二抗,用双抗体夹心法对临床血清标本进行测定,并与ELISA方法进行比较。结果 Luminex液相芯片技术同时测定tPSA、fPSA与ELISA测定结果高度相关。Luninex方法测定tPSA的灵敏度为0.03 ng/L,批内精密度为4.38%~5.86%,批间精密度为3.40%~6.73%;测定fPSA的灵敏度为0.013 ng/L,批内精密度为5.08%~7.94%,批间精密度为3.77%~5.74%。结论 Luminex方法同时测定tPSA、fPSA具有灵敏度高、重复性好、系统误差小等优点,具有广泛的临床应用前景。     

液相芯片技术在人乳头瘤病毒分型检测中的应用

目的构建人乳头瘤病毒(HPV)基因分型的液相芯片,针对中国常见的23种型别的HPV进行分型检测,并探讨其在临床应用中的特异性和敏感性。方法采用HPV通用型引物MY09/11以及一条简并引物对临床样本进行PCR扩增;针对HPV不同型别设计分型探针,并偶联到Luminex微球上,通过LuminexTM平台对PCR产物进行分型检测。同时以测序法作为验证标准,对液相芯片法(Luminex法)检测结果进行评价。结果以测序法作为验证标准,Luminex法对314例HPV样本的分型检测结果为灵敏度98.10%,特异性98.08%,符合率98.09%。Kappa一致性检验结果为0.962。结论 Luminex法用于HPV感染样本中的分型检测具有高灵敏度和特异性,可以用于临床HPV诊断。     

分子生物学方法在结核分枝杆菌及其耐药性检测中的价值

目的探讨分子生物学方法在结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis,MTB）及其耐药性检测中的价值。方法以MTB标准菌株H37Rν作为对照,以单耐药及耐多药的MTB行梯度浓度稀释后作为检测样本,分析Xpert MTB/RIF法、基因芯片法、改良罗氏培养法、比例法检测MTB的准确性、最低检出限及检测周期等。结果改良罗氏培养法和Xpert MTB/RIF法检测MTB下限均为3×102 cfu/mL,基因芯片法检出下限为3×104 cfu/mL;Xpert MTB/RIF法在3×102 cfu/mL时检测利福平耐药性存在假阳性现象,无法检测异烟肼的耐药性;Xpert MTB/RIF法检测周期≤2 h,而基因芯片法≤8 h,比例法和改良罗氏培养法检测周期在5~8周。结论在MTB及其耐药性检测中分子生物学方法的检测周期优势明显,在最低检出限和准确性方面各有优势,因此,临床诊断中综合考虑病人的经济水平和病情危重程度,选择合适的检测方法。     

实时荧光PCR同时检测丙型副伤寒沙门菌和猪霍乱沙门菌方法的建立和应用

目的建立丙型副伤寒沙门菌和猪霍乱沙门菌的实时荧光PCR快速检测方法,用于沙门菌属内的分型鉴定。方法根据GenBank公布的丙型副伤寒沙门菌和猪霍乱沙门菌的保守序列,设计引物和改良分子信标探针,建立实时PCR检测方法。结果检测体系灵敏度高,纯DNA和菌液的最低检出限分别可达10fg和20CFU/反应体系;特异性好,对71株细菌的检测符合率达100%。20株沙门菌采取盲号模拟血培养标本进行血培养检测及鉴定,检出5株丙型副伤寒沙门菌和4株猪霍乱沙门菌,与试验的菌株相符。70份食品中用实时荧光PCR同时检测丙型副伤寒沙门菌和猪霍乱沙门菌均为阴性,而用传统方法分离培养未检出。结论建立的实时PCR检测方法可以快速、特异、灵敏地检测出丙型副伤寒沙门菌和猪霍乱沙门菌。     

化脓性脑膜炎脑脊液常见病原菌基因芯片的构建

 [摘要]目的研制化脓性脑膜炎常见细菌检测基因芯片,为化脓性脑膜炎病原学明确诊断提供新技术。方法在设计化脓性脑膜炎常见细菌：脑膜炎奈瑟菌、肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、大肠埃希菌、其他凝固酶阴性葡萄球菌的特异性探针的基础上,通过芯片基片的制备、点样、固定、样品扩增标记、杂交及扫描等工艺过程的优化,完成基因芯片研制。结果初步研制出常见化脓性脑膜炎病原菌检测的基因芯片。结论本课题研发的基因芯片能够用于化脓性脑膜炎常见病原菌的诊断和分型检测,有望成为一种化脓性脑膜炎脑脊液常见病原菌的高效检测技术。     

伤寒和甲、乙、丙型副伤寒沙门菌多重PCR及荧光PCR分型方法的建立与评价

目的建立伤寒和甲、乙、丙型副伤寒沙门菌的快速和特异的检测方法,用于沙门菌属内的分型鉴定。方法根据GenBank公布的伤寒和甲、乙、丙型副伤寒沙门菌的保守序列设计引物和改良分子信标探针,建立多重PCR检测方法和实时荧光PCR检测方法。结果采用所建立的多重PCR方法可分别检测到伤寒的3条特异性条带、甲型副伤寒沙门菌的2条特异性条带和丙型副伤寒沙门菌的1条特异性条带,但是乙型副伤寒沙门菌未出现特异性条带。建立的实时荧光PCR方法可以快速、特异、灵敏地检测出伤寒和甲、乙、丙型副伤寒沙门菌,纯DNA和菌液的最低检出限分别可达10 fg/reaction和20 CFU/reaction;对77株细菌的检测正确率达100%。结论建立的实时荧光PCR检测方法比多重PCR方法更能快速、特异、灵敏地检测伤寒和甲、乙、丙型副伤寒沙门菌。     

金黄色葡萄球菌肠毒素B基因克隆、表达及其抗血清在食物中毒快速检测上的应用

目的克隆和表达金黄色葡萄球菌肠毒素B（SEB）基因,制备金黄色葡萄球菌肠毒素B（SEB）的多克隆抗体,应用于金黄色葡萄球菌引起的食物中毒的诊断。方法用核酸扩增技术从金黄色葡萄球菌菌株中分离产生肠毒素B的标准菌株,采用高保真PCR技术从金黄色葡萄球菌野生株中扩增全长SEB,目的片段经TA克隆后DNA序列测定,重组质粒pGEM—SEB经酶切获得的SEB基因片段与真核表达载体pGEX-4T-3连接,将重组真核载体pGEX-4T-3-SEB转化人E．coli BL21（DE3）株,在0．1mmol／LIPTG诱导下,诱导SEB基因在E-coli BL21（DE3）株中表达,用谷光苷肽Sepharose4B柱分离纯化GST融合蛋白,用SDS—PAGE检测重组SEB（rSEB）的表达,重组蛋白免疫BALB／c小鼠获得抗血清,并用抗血清与天然的SEB和rSEB进行Westembolt分析。结果成功克隆了822bpSEB基因,编码272个氨基酸,在E．coli BL21（DE3）株中表达了rSEB,分离纯化的rSEB能够诱导小鼠产生IgG抗体,此抗体不仅能够与rSEB反应,而且能够与天然的SEB特异性的反应。结论重组SEB具有抗原特性,制备的特异性抗体可应用于金黄色葡萄球菌引起的食物中毒的快速诊断,将能够建立特异性强、敏感性高的金黄色葡萄球菌的诊断体系,同时也有助于对SEB在抗肿瘤机制、炎症过程中的作用等方面研究。     

悬浮阵列技术检测循环肿瘤细胞基因预测乳腺癌术后复发

目的建立可以同时检测乳腺癌患者外周血中循环肿瘤细胞多个基因表达水平的悬浮阵列方法,探讨多基因联合检测在乳腺癌术后复发早期预测中的应用价值。方法以悬浮阵列技术检测73例乳腺癌患者外周血循环肿瘤细胞癌基因,并用COX比例风险模型寻找影响乳腺癌复发转移的独立预后因素。结果成功建立了可以同时检测乳腺癌患者外周血中8种循环肿瘤细胞基因表达水平的悬浮阵列方法,基因阳性率从大到小排列的结果为乳腺珠蛋白（hMAM）、人类表皮生长因子受体2（HER2）、细胞角蛋白19（CK19）、乳腺小黏蛋白（SBEM）、肿瘤相关钙信号转导蛋白1（EPG2）、端粒酶逆转录酶（hTERT）、人绒毛膜促性腺激素β亚基（β-HCG）和B305D基因,分别为57．5％、57．5％、53．4％、52．1％、31．5％、26．1％、21．9％和15．1％。1个及1个以上基因表达的阳性率为79％,高于血清CA15—3检测（44％,P〈0．05）。SBEM的表达与临床分期有关（P〈0．05）;hMAM、SBEM、HER2、雌激素受体（ER）为乳腺癌复发转移的独立预后因素（均P〈0．05）。结论建立的悬浮阵列方法在乳腺癌的预后判断方面具有实用价值。外周血循环肿瘤细胞hMAM、SBEM和HER2的表达可以作为分子标记物预测乳腺癌的复发转移。     

B型流感亚系单碱基延伸终止荧光偏振快速检测的研究

目的 建立一种利用单碱基延伸终止结合荧光偏振技术(Fluorescence polarization,FP)快速检测B型流感By(B/Yamagata)和By(B/Victoria)亚系的新方法. 方法 从GenBank下载By和Bv血凝素(HA)基因各50条序列,通过MEGA软件进行分析,利用Primer Premier 5.0设计B型流感病毒亚系特异性引物和单标记延伸引物,建立单碱基延伸终止法与荧光偏振检测方法. 结果 40株By和40株By病毒用单碱基延伸终止法与荧光偏振检测,与传统的基因测序结果一致性达100％. 结论 本方法操作简便、敏感性及特异性高、判读结果直观明确、检测费用低,适合于流感监测实验室对流感病毒的快速分子诊断.