聚合酶链反应检测间日疟原虫感染的探讨

研究一种适用于流行式人群聚合酶链反应检测间日疟原虫感染的方法。方法：用滤纸片与毛细管两种方法收集血样本，１％Ｔｒｉｏｎｘ－１００裂解，煮沸法处理血样，对全部血样进行ＰＣＲ检测，并与常规镜检作比较。结果２００例血样ＰＣＲ法阳性８．０％高于镜检阳性率３．５％，滤纸血样与毛细管血样ＰＣＲ扩增取得相同的效果。结论ＰＣＲ检测间日疟原虫方法具有快速，敏感，实用性强等优点，有一定的推广应用价值。     

干血滤纸片试剂盒和水煮法提取间日疟原虫DNA用于PCR检测的比较

目的：比较水煮法和干血滤纸片基因组DNA分离试剂盒提取间日疟原虫DNA用于PCR检测及克隆研究的差异。方法：采集间日疟患者末梢血制备干血滤纸片,分别用水煮法和QIAamp DNAmini kit试剂盒提取间日疟原虫基因组DNA10份。PCR扩增LDH基因,并克隆质粒pGEM-PvLDH。分析比较2种提取方法的差异。结果：水煮法和试剂盒法提取的间日疟原虫gDNA,均扩增出LDH基因特异条带,但试剂盒提取的gDNA目的条带亮于水煮法。结论：水煮法操作简便、快速、经济,在等量血源条件下,所得DNA量较少、纯度较低;试剂盒提取可获得较高的得率,在定量检测和复合扩增时受到的影响因素较少,成功率较高。     

PCR检测食蟹猴疟原虫的实验研究

目的 建立一种特异、敏感、简捷的PCR检测食蟹猴疟原虫（P.C）的方法。方法 检测样品来自人工接种感染P.C的阳性猴血膜及滤纸血斑。根据P.C　SSUrRNA基因序列,设计P.C特异引物Pc1和Pc3,用PCR常规操作对P.C DNA模板扩增。同时用多对间日疟原虫（P.V）特异引物对照比较。结果 从 P.C血样中扩增出 425bp特定扩增带,而P.V红内期和子孢子、恶性疟原虫、伯氏疟原虫、人基因组DNA和健康猴血均未见扩增带;敏感度可检测 1.68 ×10-6的原虫感染水平。同时发现P.C对多对 P.V特异引物均出现阳性扩增带,以往一直未被注意。结论 该方法检测 P.C特异、敏感和简捷,提供了鉴别 P.V与 P.C的准确诊断。建议在 PCR的P.V引物设计和特异性的检测过程,把应用P.C　DNA检测列为常规对照,以提高检测质量。     

巢氏PCR检测血片中低密度间日疟原虫的研究

【摘要】目的 探讨巢式PCR应用于检测低密度疟原虫血片DNA的方法。 方法 以健康人抗凝血为稀释液提取不同浓度梯度间日疟原虫血片DNA,测定其最低检出限,将一份含有高密度间日疟原虫的抗凝血样按照1：10、1：100、1：1000、1：2000、1：4000、1：8000、1：16000、1：32000比例进行稀释,制成9个浓度梯度血样。每个浓度血样按照厚血膜5ul、薄血膜2ul同时制作2张血片,连续稀释（9个稀释度）一份含有高密度间日疟原虫的EDTA抗凝血样本,制作标准血片,同时进行所制得的血片中厚、薄血膜通过显微镜计数后,分别用以提取DNA,进行和巢式PCR检测。 结果 间日疟原虫血片厚血膜的检出限为1：16000（08个虫/μl血）,薄血膜检出限为1：100,与镜下计数水平一致。 结论 巢式PCR适用于低密度血片中间日疟原虫DNA的检测,具有较高的检测意义。     

疟疾双重PCR检测方法的建立和初步应用研究

目的 建立一种适合于我国恶性疟、间日疟和两混合感染地区,一次性检测人体内或蚊体内的恶性疟原虫(P.f.)和间日疟原虫(P.v,)的双重聚合酶链反应(PCR)法。方法 根据疟原虫红内期SSUrRNA基因特定片段,设计合成3条寡核苷酸特异引物,在一个反应体系中,同时检测P.f．与P．v.的双重PCR技术,操作方法按PCR常规。结果 从P.f.和P．v．感染血样中,分别扩增出274bp和412bp的特异片段,检出水平达1-5个虫／μl血,而人基因组DNA、约氏疟原虫、伯氏疟原虫均未见扩增条带;但食蟹猴疟原虫(P．c,)与P.v．相似,在412bp可见扩增条带。经对采自不同疟区发热待查病人的滤纸干血滴和确诊疟疾病人的静脉血检测,344例血样中,检出阴性112例、P.f．109例、P.v.l114例、P．f. P.v.9例,阳性率67．4％;比常规镜检的阳性率66．3％稍高,尤以检出P．f． P．v．感染病例高。分别检测人工感染P.f．与P.v.各10只大劣按蚊的阳性唾腺,均被检出同种的阳性结果。结论一次性检测P．f.DNA与P.v.DNA的双重PCR法,敏感性高,特异性强,稳定性好,具有简化操作、提高工效、降低耗费的优点。对发热待查病人诊断和蚊媒感染疟原虫调查,以及疟疾病原学的检测质控方面,均有实用价值。     

一种快速简便的PCR检测恶性疟原虫方法的建立

作者建立了一种简便快速的PCR检测恶性疟原虫的方法。参照国外最新报道设计合成了一对引物扩增恶性疟原虫特异的重复序列,扩增片段206 bp,引物序列如下:A: CGCTACATATCTAGTTGCCAGACB: CGTGTACCATACATCCTACCAAC 方法:取冻存的西双版纳流行区疟疾患者外周     

套式PCR检测滤纸干血滴恶性疟原虫

套式ＰＣＲ检测滤纸干血滴恶性疟原虫孙明林陈培霞薛采芳刘忠湘（第四军医大学寄生虫学教研室西安７１００３３）关键词恶性疟原虫套式聚合酶链反应血迹中图号Ｒ３８２．９疟疾防治一直受到国际医学界的高度重视，有效的诊断是预防和治疗的前提，因而探索高效、灵敏、快速...     

间日疟原虫DNA片段的克隆及筛选

作者在国内首次构建了间日疟原虫基因文库,并从中筛选出可用作探针的特异性DNA片段的克隆。1 材料和方法 从疟疾流行区采集原虫血症大于     

5种提取恶性疟原虫DNA方法用于PCR的结果评价

目的 比较5种DNA模板制备方法的优缺点。方法 采用5种方法所制备的DNA进行PCR扩增，经统计学处理比较制备的成功率，与6对不同引物PCR反应的敏感性，方便性，快速和费用等因素进行综合。结果 用于PCR，方法1－3的成功率显高于法4和5（P＜0．001）；法3制备的DNA敏感性最高，适用性最强。结论 5种方法各有其优缺点，应根据实验目的的选用。     

Nested polymerase chain reaction in detection of Plasmodium vivax sporozoites in mosquitoes

目的　检测蚊体内间日疟原虫DNA。方法　以疟原虫SSurRNA为模板 ,采用套式PCR扩增间日疟原虫特异性 12 1bp片段。结果　在实验感染蚊中 ,套式PCR可检测到低至 3个间日疟原虫子孢子的DNA或 10 0只蚊中的一只阳性蚊 ,而其它 3种人疟原虫或正常蚊DNA未扩增出条带。结论　套式PCR的敏感性及特异性表明 ,该方法在检测蚊体内少量疟原虫感染时 ,比DNA探针或直接PCR具有更大优越性。     

Sequential check and computer analysis of a cloned DNA fragment specific for Plasmodium vivax

A cloned DNA fragment specific for Plasmodium vivax was cleaved from theplasmid pVA1 and ligated into phage M13mp18.The nucleotides of the insert were se-quenced by the dideoxy-chain termination procedure.The fragment was composed of 261base pairs and 3 Hinf Ⅰ sites but no tandem repeat sequences.Computer retrieval andanalysis show that the nucleotide sequence of the cloned DNA fragment is unique,forthere has not been any significant homologue with that of other Plasmodium genes pub-lished as yet.     

荧光定量聚合酶链反应诊断弓形虫感染的实验研究

目的 探讨荧光定量聚合酶链反应（FQ-PCR）对孕妇与新生儿弓形虫（TOX）感染的诊断价值。方法以完全闭管式的PCR和荧光探针杂交技术相结合所产生的实时检测定量PCR方法,检测了产妇的血清标本和新生儿脐血标本,同时与常规 PCR法和酶联免疫吸附法（ELISA）比较。结果 225例产妇中,FQ-PCR阳性28例,平均拷贝数值（ml-1）为 1.68×105,阳性率为12.44％,常规PCR阳性率为12.89％,TOX-IgG阳性29例,阳性率为 12.89％,IgM阳性33例,阳性率为14.67％。179例新生儿中,FQ-PCR阳性7例,平均拷贝数值（ml-1）为2.29×105,阳性率为3.91％,常规PCR阳性率为5.03％,TOX-IgG阳性11例,阳性率为6.15％,IgM阳性3例,阳性率为1.68％。结论FQ-PCR特异性比ELISA法高,可以检测TOX的真实感染和复制情况,对TOX的临床诊断、治疗方案的选择和疗效观察有较大的应用价值。     

不同地理株间日疟原虫SSUrRNA基因序列比较

目的测定我国间日疟原虫不同地理株红内期SSUrRNA基因序列,比较分析其分子特征。方法收集深圳、海南、湖北和河南四地间日疟患者血样5份（其中海南2份）,并提取核酸DNA,采用PCR从核酸提取物中扩增出间日疟原虫SSUrRNA基因片段,纯化后分别与pGEM—Teasy质粒连接构建重组子并转化大肠杆菌JM109;阳性克隆以双酶切鉴定后,双脱氧末端终止法测定序列,采用BLAsT和MEGA4软件分析序列相互关系特征。结果5株间日疟原虫SSUrRNA基因扩增片段大小一致,约为998bp;核酸序列测定结果显示,所克隆的SSUrRNA基因片段均含有998个核苷酸,不同地理株间SSUrRNA基因序列有9个位点存在变异的可能,两两比对的同源性均高于99．5％,其中河南与湖北株序列的同源性为100．0％;与GenBank中报道的国外6株间日疟原虫相同序列作分子系统进化分析。国内5株间日疟原虫SSUrRNA基因序列与Sa11株遗传距离小,亲缘关系接近。结论测定的国内间日疟原虫SSUrRNA基因序列在不同地理株间相对保守．其间存在的单核苷酸多态性与地理变化有一定程度的关系。     

PCR法与荧光定量PCR法在人巨细胞病毒检测中的作用比较

目的 比较常规PCR法与荧光定量RCR（RQ-PCR）法在人巨细胞病毒（HCMV）检测中的作用,寻找更适合于HCMV检测的方法。方法 构建携带CMV-DNA的标准质粒,利用常规PCR技术及FQ-PCR技术分别对不同稀释度的标准质粒进行检测。结果 FQ-PCR法对HCMV,标准质粒检测的灵敏度及线性范围均显著高于常规RCR法。结论 RCP法比常规PCR法更适合HCMV病毒的检测。     

间日疟原虫部分乳酸脱氢酶基因的克隆及序列分析

目的克隆并测定我国间日疟原虫乳酸脱氢酶(PvLDH)的部分基因序列并进行生物信息学分析。方法根据PvLDH基因已知序列设计合成一对引物,应用PCR技术从间日疟原虫基因组DNA中扩增LDH基因,定向克隆入pMD18质粒。阳性质粒经酶切及PCR鉴定后,用双脱氧链末端终止法进行基因序列测定。应用生物信息学网站www.ncbi.nlm.nih.gov、www.expasy.ch对获得的基因及其推导的氨基酸序列进行生物信息学分析。结果PCR扩增得到特异的间日疟原虫LDH基因序列。酶切及PCR鉴定获得了正确的重组质粒。测序结果表明,获得的间日疟原虫LDH基因全长897bp,编码299个氨基酸。DNAMAN预测PvLDH存在10个潜在抗原表位,均与PfLDH的相应预测表位间有同源序列。同源性分析显示,我国间日疟原虫与SalvadorⅠ株和Belem株间日疟原虫的氨基酸序列同源性为99%,与其它疟原虫LDH的同源性为88%～90%。结论成功克隆了我国间日疟原虫LDH基因,其基因序列与其它疟原虫LDH基因序列有高度同源性。     

环介导等温扩增技术检测间日疟原虫方法的建立及应用分析

目的建立一种快速、简便的检测间日疟原虫的环介导等温扩增方法(LAMP)并与常规PCR方法作比较。方法根据间日疟原虫环子孢子蛋白(CSP)基因序列合成2对特异性LAMP引物,优化Mg2+浓度、dNTPs浓度、BstDNA聚合酶添加量、反应温度、时间以及设计引物缺省试验。评估优化后的LAMP反应的特异性和灵敏性。检测133份患者血样,以显微镜检方法为金标准,比较LAMP和多重PCR法检测间日疟原虫的敏感性和特异性。结果 LAMP法检测重组质粒DNA(Pv-rDNA)的灵敏度达到10-10,为传统PCR方法的100倍。镜检确诊的68例间日疟、43例恶性疟和22例非疟疾患者中,LAMP法和多重PCR检测间日疟原虫的敏感性为98.53%和97.06%,两法基本相当(χ2=0.34,P>0.05);特异性为86.15%和100%,LAMP法低于多重PCR法,差异有统计学意义(χ2=9.67,P<0.05)。LAMP法的阳性预测值和阴性预测值分别为88.16%和98.25%,多重PCR的阳性预测值和阴性预测值分别为100%和97.01%。结论 LAMP法检测间日疟原虫具有快速简便、敏感性高、设备要求低的特点,具有较好的应用前景。