BMSCs/EPCs联合移植治疗兔股骨头坏死的实验研究

目的 检测骨髓来源内皮祖细胞（endothelial progenitor cells,EPCs）与骨髓基质细胞（bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs）移植到股骨头缺血坏死部位促进坏死区局部成骨和成血管能力.方法 使用密度梯度离心法分离培养兔BMSCs、EPCs并鉴定.共培养细胞进行碱性磷酸酶活性检测以确定EPCs与BMSCs最佳比例.培养的细胞分成3组植入兔股骨头坏死模型：A组（单独移植BMSCs）、B组（单独移植EPCs）、C组（最佳比例联合移植BMSCs与EPCs）,于术后4周对兔股骨头坏死模型进行成骨及成血管指标检测.结果 EPCs与BMSCs的最佳共培养比例为1∶1.与A组及B组相比,C组有着更高的BMP-2蛋白表达和更多的新生血管形成（P＜0.05）.组织学检测显示：A组可见类骨质结构;B组可见血管结构,但类骨质生成较少;C组可见类骨质结构,并且可见密集的血管结构.结论 以1∶1比例联合移植EPCs和BMSCs到股骨头坏死部位具有很强的成骨以及成血管能力.     

内皮祖细胞与骨髓间充质干细胞构建血管化组织工程骨的研究进展

组织工程骨早期血管化是促进形成新生骨的先决条件,骨髓间充质干细胞(BMSCs)是成骨细胞的起源,体外诱导条件下可分化为成骨细胞,是组织工程骨常用的种子细胞,但很难解决组织工程骨血管化的问题。内皮祖细胞(EPCs)作为内皮细胞前体细胞,已应用于多种缺血组织模型的血管再生研究。目前已有研究者将其引入组织工程骨构建体系,为解决组织工程骨血管化问题提供了新思路和方法。     

EPCs与BMSCs干细胞联合培养体系修复机体骨缺损

目的 为解决整形外科骨缺损修复, 促进移植骨成活, 应用干细胞联合培养体系复合部分脱蛋白生物骨 (PDPBB) , 对机体胫骨缺损进行修复.方法 新西兰大耳兔18只, 分别抽取骨髓液及外周血提取骨髓间充质干细胞 (BMSCs) 及外周血内皮祖细胞 (EPCs) , 构建联合培养体系后, 复合PDPBB构建组织工程骨;于兔胫骨制造1 cm长骨缺损, 将组织工程骨植入缺损区, 分别于术后14 d、28 d及2个月观察骨缺损修复的情况.结果 BMSCs组、联合培养细胞组和空白组各个时间点及组间的吸光度值比较, 差异均有统计学意义 (P<0.001) ;组织工程骨植入体内后骨胶原蛋白含量逐渐升高, 各分组差异有统计学意义 (P<0.01) ;复合联合干细胞体系的PDPBB修复骨缺损能力最强, 修复了胫骨缺损区的结构和功能.结论 EPCs与BMSCs联合干细胞体系复合PDPBB构建的组织工程骨是良好的骨缺损修复材料.     

移植过表达人VEGF165的BMSCs促进放疗损伤大鼠模型的组织修复

背景 骨髓间充质干细胞（BMSCs）的多向分化潜能在组织再生的研究应用中显示出了极大的潜力,同时血管内皮生长因子165（VEGF165）能够促进血管的生成从而促进组织的再生。本研究用VEGF165基因修饰BMSCs移植的方法来恢复放疗大鼠损伤模型的组织修复能力。 方法 从大鼠胫骨分离获取BMSCs;用脂质体将hVEGF165转染至BMSCs;以60Coγ射线照射大鼠右后肢,总吸收剂量为30 Gy,总共40只,照射结束后第1天,将实验分为四组（n=10）：不注射组作为未治疗对照组（组1）,空转染BMSCs组（组2）、未转染BMSCs组（组3）及hVEGF165-BMSCs组（组4）,分别注射照射区组织,共治疗2次,间隔2周。治疗结束1周后行血管造影及血管染色体视学图像分析,对后肢肌肉标本行血管、肌肉显微结构观察、RT-PCR、Western Bloting及免疫组化染色。 结果 结果表明分离得到的BMSCs具有多向分化能力;转染后的BMSCs高表达hVEGF165基因和蛋白;组2、3、4的血管数量、密度、平均管径、平均截面积各项指标及MyoD、myogenin、α-SMA蛋白、CD31蛋白表达均高于组1。hVEGF165mRNA及蛋白的表达及上述指标在注射hVEGF165转染的BMSCs（组4）均高于组2和组3。 结论 过表达VEGF165基因的BMSCs通过促进血管新生和肌纤维的再生有效地增强了组织的修复能力,过表达VEGF165基因的BMSCs具有潜在的临床应用价值。     

脱钙骨基质为骨组织工程支架修复骨缺损实验研究

目的：利用骨组织工程原理对节段性骨缺损进行修复,探讨脱钙骨基质（demineralized bone matrix,DBM）在骨组织工程中的应用。方法：从兔股骨分离骨髓间质干细胞（bone mesenchymal stem cells,BMSCs）,经体外诱导分化、条件培养、5-溴-2′-dexyouridine,5-BrdU）标记后,接种到兔海绵状脱钙骨基质（sponge of DBM ,SDBM）支架上,然后分别植入兔背部肌肉内及兔桡骨中段10mm长的骨膜骨缺损内。对照组为缺损内单纯植入SDBM及空白组。术后观察6周。结果：经条件培养的BMSCs可在体外表达Ⅰ型胶原、碱性磷酸酶,并形成钙结节;体内异位植入组织工程骨块可形成软骨及骨组织;组织工程骨块及单纯SDBM在术后6周完全修复骨缺损（6/6）;极限压缩强度测量显示,组织工程骨块植入组新生骨与正常桡骨段差异无显著性（P=0.623）,单纯SDBM植入组新生骨在生物力学方面低于正常桡骨段（P=0.038）。结论：脱钙骨基质在骨组织工程中是一种有效的生物活性支架材料。     

EPCs促血管化组织工程骨修复大段骨缺损的早期组织学评价

目的 评价血管内皮祖细胞(EPCs)促血管化组织工程骨修复大段骨缺损的早期组织学结果.方法 将来源于自体骨髓的EPCs与经成骨诱导的骨髓间充质干细胞(BMSCs)及脱钙骨基质(DBM)共同构建的促血管化组织工程骨修复兔桡骨大段骨缺损,通过光镜、扫描电镜、透射电镜等方法观察术后2、4周时骨缺损区的组织学改变.结果 实验组(EPCs+BMSCs+DBM)软骨细胞和成骨细胞数量更多,功能更活跃,骨小梁更成熟,并可见较多梭形的血管内皮细胞,新生血管更丰富.结论 EPCs促血管化组织工程骨能在骨愈合早期促进新生血管形成,并进一步促进成骨,加速骨愈合.     

Brdu标记VECs和ADSCs构建组织工程骨体内增殖研究

目的研究联合培养的血管内皮细胞(vascular endothelial cells,VECs)和脂肪干细胞(adipose-derived stromal cells,ADSCs)构建组织工程骨,在体内增殖和分化情况.方法 (1)用猪椎骨制备部分脱蛋白骨,纤维粘连蛋白修饰制成部分脱蛋白生物骨,电镜扫描生物骨表面情况;(2)选用大鼠脐血单个核细胞诱导分化的血管内皮细胞和大鼠脂肪干细胞,体外1:1浓度联合培养;(3)分别用Brdu标记的血管内皮细胞、脂肪干细胞和联合培养细胞体外复合部分脱蛋白生物骨,体外培养6 d后植于SD大鼠两侧股部肌袋处;2周、4周、8周、12周取材,硬组织切片中Brdu抗体免疫荧光染色,观察植入的种子细胞在机体内的增殖分化情况.结果 (1)猪椎骨制备部分脱蛋白骨孔隙分布均匀,由大量的羟基磷灰石纤维编织而成;部分脱蛋白生物骨表面可见大量颗粒状蛋白结晶;(2)Brdu免疫荧光染色各组植入种子细胞开始呈分散状分布,细胞逐渐增殖呈巢状,血管内皮细胞组和联合培养细胞组植入内皮细胞增殖形成大量新生血管;未标记Brdu空白组未见阳性细胞出现.结论组织工程骨植入种子细胞在体内能大量增殖,参与新组织和新生血管的形成.     

血管内皮细胞生长因子基因转染血管内皮祖细胞移植促进缺血皮瓣存活的实验研究

目的探讨VEGF165基因转染血管内皮祖细胞(EPCs)移植促进缺血皮瓣的血管新生,提高皮瓣存活率。方法体外分离、培养人脐血中EPCs,利用脂质体介导血管内皮细胞生长因子165(VEGF165)基因体外转染EPCs,然后移植于裸鼠随意皮瓣,皮瓣早期断蒂。结果脐血中分离培养的EPCs表达CD34、KDR及CD133,VEGF165基因转染EPCs体外及体内检测均有VEGF165蛋白的表达。转染VEGF165基因的EPCs组和EPCs组移植裸鼠皮瓣后,EPCs整合到缺血部位新生血管中,与对照组的皮瓣存活率分别为97 2% ±2 8%、60 3% ±2 1%、34 2% ±1 8% (P<0 05 ),而且前二组毛细血管密度、血流灌注差异均有统计学意义(P<0 05),较对照组均有明显改善(P<0 05)。术后第7d时三组皮瓣中的EPCs密度分别为136个/mm2 ±10个/mm2、75个/mm2 ±6个/mm2、0个/mm2 (P<0 05 ); 第11天时EPCs密度分别为305个/mm2 ±26个/mm2、199个/mm2 ±18个/mm2、0个/mm2 (P<0 05)。结论脐血中的EPCs体外培养后移植体内可促进缺血皮瓣的血管新生,提高存活率,而转染VEGF165基因的EPCs具有更强大的促血管新生的作用。     

血管化组织工程骨修复兔股骨干骨缺损

目的 观察血管化组织工程骨修复兔股骨干骨缺损的成骨特点,初步探讨其修复骨缺损的机制.方法 32只新西兰大白兔均制备左侧股骨干15 mm段性骨缺损模型,随机分为两组,实验组:兔自体骨髓基质干细胞复合β-磷酸三钙(β-TCP)构建组织工程骨同时联合血管柬植入骨缺损;对照组:单纯植入组织工程骨.于术后2、4、8、12周行组织学观察骨形成与改建情况,同时行免疫组织化学,荧光定量聚合酶链反应,免疫印迹检测修复骨段内血管内皮生长因子(VEGF)的表达.结果 组织学观察显示随着时间发展,两组成骨量均逐渐增加,从4周起实验组骨修复优于对照组;实验组各时间点组织工程骨中VEGF的表达量高于对照组,随着时间延长,VEGF呈先增高后降低趋势,在4周时表达量最大.结论 血管化组织工程骨可有效促进兔股骨缺损的修复,植入血管束能促进VEGF的表达,VEGF是促进骨再生和血管再生的重要因子.     

富血小板血浆对骨髓间充质干细胞向成骨细胞定向分化的影响

目的 观察富血小板血浆（platelet-rich plasma,PRP）对兔源骨髓间充质于细胞（bone mesenchymal stem cells,BMSCs）定向分化为成骨细胞的作用及机制. 方法 离心法分离兔骨髓后,体外培养BMSCs,体积分数5％和10％的PRP与BMSCs共培养,观察BMSCs诱导分化过程中茜素红染色阳性率,应用酶标仪检测碱性磷酸酶（alkaliphosphatase,ALP）活性,应用ELISA法检测BMSCs诱导分化过程中骨钙素（osteocalcin,OCN）及结缔组织生长因子（connective tissue growth factor,CTGF）的含量,应用real time-PCR检测成骨相关基因CTGF、ALP、成骨细胞核心结合因子α1（core-binding factor alpha 1,Cbf-α1）、兔Ⅰ型胶原（Col-Ⅰ）和OCN的表达. 结果 BMSCs诱导分化后细胞茜素红染色阳性率、ALP活性、OCN及CTGF含量升高,CT-GF、ALP、Cbf-α1、Col-Ⅰ和OCN的mRNA表达增加. 结论 PRP可促进BMSCs向成骨细胞分化,可能与PRP促进BMSCs中CTGF、ALP、Cbf-α1、Col-Ⅰ和OCN表达有关.     

共培养大鼠内皮祖细胞对白体骨髓基质干细胞成骨作用的影响

目的探讨体外培养大鼠外周血内皮前体细胞（EPCs）与自体骨髓基质细胞（BMSCs）共培养时对BMSCs成骨作用的影响。方法采用密度梯度离心法分离、培养大鼠BMSCs和EPCs,培养细胞分为四组：A组（BMSCs组）、B组（EPCs组）、C组（BMSCs成骨诱导组）及D组（BMSCs和EPCs联合培养组）。通过观察细胞克隆形态、免疫细胞化学、细胞增殖、碱性磷酸酶活性,从酶学、组织学及生化等不同方面观察EPCs对BMSCs成骨活性及生长情况的影响。结果免疫细胞化学染色证实C组培养的细胞具有晚期EPCs的特性。倒置相差显微镜、HE染色均证实共培养的BMSCs和EPCs生长良好,并能够形成与单纯成骨诱导培养的BMSCs相似的钙结节。MTr检测结果：各组细胞增殖差异无统计学意义（P〉0．05）。碱性磷酸酶活性检测结果：C、D组显著高于A、B组（P〈0．05）。结论EPCs和BMSCs联合培养具有良好的细胞相容性,EPCs能够增强成骨细胞的ALP活性,提高成骨细胞的增殖能力。     

自体骨髓间充质干细胞和同种异体肋软骨细胞共培养修复 五指山小型猪膝关节软骨缺损的实验研究

目的：探讨骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)和肋软骨细胞(costal chondrocytes,CCs)共培养构建组织工程软骨及共培养细胞修复五指山小型猪膝关节软骨缺损的可行性,为临床修 复关节软骨缺损提供理论依据和奠定实验基础。方法：密度梯度离心法分离五指山小型猪BMSCs,双酶消化法分离 CCs。取第3代BMSCs和第2代CCs,随机分为3组：BMSCs:CCs为1:2的共培养组为A组,单纯CCs为B组,单纯BMSCs 为C组。绘制细胞生长曲线图,测定软骨细胞外分泌基质糖胺多糖(glycosaminoglycan,GAG)的能力。将12只五指山 小型猪随机分为共培养细胞/胶原膜实验组、胶原膜对照组和空白组。共培养细胞/胶原膜实验组髁间窝软骨缺损处 植入共培养细胞/胶原膜,胶原膜对照组单纯植入胶原膜,空白组不做任何植入,于术后第8和16周分别处死6只动 物,每组2只。取材行大体观察、软骨组织学评分及病理组织学检测。结果：密度梯度离心法分离的BMSCs生长良 好,双酶消化法分离的CCs生物活性良好,共培养细胞生长良好。术后16周共培养细胞/胶原膜实验组修复组织呈透 明软骨样,表面光滑平坦,周围软骨及软骨下骨整合良好,而胶原膜对照组和空白组为纤维性修复和无修复。共培 养细胞/胶原膜实验组修复组织大体评分明显优于胶原膜对照组和空白组(均P<0.05),胶原膜对照组和空白组之间差 异无统计学意义(P>0.05)。结论： BMSCs,CCs和共培养细胞均适合作为软骨组织工程的种子细胞,其中共培养细胞 (BMSCs:CCs为1:2)更具优势;共培养细胞复合胶原膜修复软骨缺损近期效果满意。     

同种异体脱钙骨基质作为骨组织工程载体的实验研究

目的通过体外同种异体脱钙骨基质（DBM）和骨髓基质细胞（BMSC）的复合培养及体内异位成骨实验，研究DBM作为骨组织工程载体的生物相容性及成骨活性。方法参考Urist操作方法大量制备兔同种异体DBM。骨穿取兔骨髓单细胞悬液进行培养，将BMSC与同种异体DBM体外复合培养3～7d，相差显微镜、扫描电镜（SEM）和苏木精-伊红染色后光镜下观察结果。将DBM和BMSC复合培养3d的复合物植入家兔一侧骶棘肌肌袋内，分别在1、2、4周活体取材，扫描电镜和苏木精-伊红染色后光镜观察，对侧单纯植入DBM作为对照。结果体外培养发现BMSC在DBM中贴壁生长、增殖并有分泌活动。体内实验发现BMSC在DBM孔隙内均匀成骨，对照组则从DBM骨块的边缘到中心逐步成骨，成骨所需的时间长，而且成骨量要小于前者。结论DBM作为组织工程载体具有良好的生物相容性和成骨活性。     

血管内皮祖细胞对组织工程骨成骨能力影响的实验研究

目的观察血管内皮祖细胞（EPCs）时组织工程骨修复兔桡骨大段骨缺顿时成骨能力的影响。方法自体骨髓通过不同方法的体外培养，获得EPCs厦经成骨诱导的MSCs，与DBM构建组织工程骨修复兔桡骨大段骨缺损。观察术后不同时期的影像学及骨密度改变。结果术后2周，EPCs组与对照组的X线观察厦骨密度差异无统计学意义。术后4、8、12周，EPCs组的骨密度明显高于对照组，X线示EPCs组骨痂明显多于对照组，8周可见EPCs组髓腔部分再通，对照组髓腔尚封闭。12周EPCs组新生骨密度均匀，髓腔已完全再通，对照组新生骨仍可见部分低密度区，髓腔大部分再通。术后16周，两组骨密度差异无统计学意义，X线示EPCs组新生骨已基本完成塑形，对照组髓腔完全再通，新生骨处于重建塑形期。结论EPCs可以促进组织工程骨修复大段骨缺损时的成骨能力，加速骨愈合。     

体外诱导骨髓基质干细胞向内皮细胞分化的实验研究

目的：探讨成体骨髓基质干细胞体外定向诱导分化为内皮细胞的可行性，为心血管组织工程提供新的种子细胞来源。方法：骨髓穿刺抽取绵羊骨髓液，密度梯度离心法获取骨髓单个核细胞，通过贴壁培养纯化骨髓基质干细胞。以含EGF、bFGF、IGF和肝素的M199培养液培养原代细胞，并以VEGF诱导骨髓基质干细胞向内皮细胞分化。通过CD34、CD31流式细胞仪分析，免疫组化CD34、CD31、Ⅷ因子相关抗原染色鉴定内皮细胞，UEA结合实验及NO含量测定评价内皮细胞功能。结果：骨髓基质干细胞表达α-SMA，不表达CD34和CD31。体外定向诱导2周后分化为内皮细胞。呈梭形，表达CD34和CD31及Ⅷ因子相关抗原，UEA结合试验阳性，并具有分泌NO的功能。结论：体外培养条件下骨髓基质干细胞能够分化为内皮细胞，并具有成熟内皮细胞的生物学特性和功能。     

小肠黏膜下层复合骨髓间充质干细胞体外构建心肌组织薄片的实验研究

目的 探讨利用小肠黏膜下层（SIS）复合骨髓间充质干细胞（BMSCs）体外构建心肌组织薄片的可行性。方法 将自大鼠骨髓分离培养的BMSCs经5-氮胞苷（5-Aza）诱导培养3周后种植在经脱细胞处理的SIS浆膜面,在体外动态条件下共培养2周,构建组织工程心肌组织薄片,并进行病理组织学、超微结构和免疫组织化学染色观察。结果 与BMSCs体外共培养2周的SIS经苏木精-伊红（HE）染色显示,细胞在SIS上不只局限于材料表层,呈多层分布,部分细胞逐步向深层迁移和渗透。扫描电子显微镜观察发现,细胞较好地在SIS上黏附、生长和迁移,细胞分泌大量的细胞外基质。免疫组织化学染色结果显示,SIS上的细胞为表达α-actin、cTnⅠ和connexin-43的心肌样细胞。结论 在体外将SIS复合经5-Aza诱导的BMSCs,成功地初步构建出组织工程化心肌组织薄片。SIS是一种良好的心肌组织工程生物支架材料。     

全骨髓贴壁培养兔骨髓间充质干细胞的初步研究

目的：探讨兔骨髓间充质干细胞作为组织工程种子细胞修复骨缺损的可能性。方法：选取2月龄约2．5kg重健康新西兰兔8只,采用全骨髓贴壁培养法体外分离、培养兔骨髓间充质干细胞,通过倒置相差显微镜观察、MTT检测、细胞贴壁率检测观察细胞生物学特性。结果：全骨髓贴壁培养法培养出的原代骨髓间充质干细胞活力良好,细胞数量经传代后扩增,且细胞纯度提高,但细胞扩增速度较慢。结论：全骨髓贴壁培养法简便易行,能有效的在体外获得原代骨髓间充质干细胞。所提取的细胞活性良好、纯度较高,能用作组织工程种子细胞治疗骨缺损。     

兔骨髓间充质干细胞的制备及诱导成骨的实验研究

目的:在体外原代培养兔骨髓间充质干细胞,观察兔骨髓间充质干细胞的体外生长特性,为用于组织工程学的种子细胞培养提供实验基础。方法:自兔股骨、胫骨取骨髓,分离骨髓间充质干细胞,分别采用常规培养液及含矿化液的培养液两组进行培养,对第3代细胞进行酶动力学法碱性磷酸酶(ALP)活性检测及钙结节茜素红染色,观察细胞在体外长期培养时钙结节形成情况。结果:两组细胞其培养液中的ALP含量不断升高,经过两独立样本t检验,矿化液诱导组第2,6,10天的ALP水平较正常对照组均明显升高(P<0.05)。细胞表现出成骨细胞特性,在体外长期不传代培养时可形成钙结节。结论:兔骨髓间充质干细胞在体外适当的培养条件下,增殖能力很强,可以向成骨细胞方向分化,可作为组织工程学的种子细胞。