不同孔径的羟基磷灰石对组织工程骨血管化促进效果的研究

目的：探讨不同孔径的羟基磷灰石材料对组织工程骨血管化效果的影响。方法采用 Wistar雄性大鼠,随机分为A、B、C 3组,分别在其背部皮下植入孔径为200~300、350~450、500~600μm 的羟基磷灰石生物陶瓷(复合4μg 骨形态发生蛋白),大小约5 mm×5 mm×1 mm,重约40 mg。分别于植入后第1、2、3、4周后处死动物,取出植入物及周围组织,采用苏木素-伊红染色组织学观察,分析局部新生血管化情况。结果3组不同时间点的血管化面积,组内比较：A 组第2、3周差异有统计学意义、B、C 组不同时间点差异有统计学意义(P <0.05);组间比较：术后1周,仅 C 组有血管化面积;术后2~4周,B、C 组增加的面积高于 A 组(P <0.05),C 组可见大量新生血管并形成清晰可见的骨小梁。结论孔径为500~600μm 的羟基磷灰石生物陶瓷能够更好地促进组织工程骨的血管化。     

组织工程骨血管化的研究新进展

组织工程骨经过大量试验研究证明是修复骨缺损较理想的方法和未来的研究方向,但在临床应用方面仍不理想.主要原因就是受制于组织工程骨血管网缺乏造成的细胞供养障碍而导致失败.组织工程骨血管化贯穿整个移植修复过程,对骨再生与融合的方式及效果起决定性作用.研究表明,单纯组织工程学方法构建出的组织工程骨厚度不能大于0.7 mm,仅能培养出微小的颗粒状组织工程骨,否则骨块中心的成骨细胞将因缺少营养而死亡,因此使其应用受到了明显限制.由此可见充足的营养对于组织工程骨的构建至关重要,组织工程骨血管化是解决其营养和代谢的唯一途径[1-2].     

带血管蒂组织瓣预构组织工程骨血管化的研究

目的:比较复合骨髓间充质干细胞(MSCs)的β-TCP生物陶瓷和单纯β-TCP生物陶瓷在大鼠体内与不同带血管蒂组织瓣联合植入后的血管再生能力。方法:80只成年SD大鼠,根据植入材料不同分2组,即左侧的复合MSCs的β-TCP生物陶瓷(实验组)和右侧的单纯β-TCP生物陶瓷(空白组),再按不同的处理因素分为带膝最上血管骨膜支的骨膜瓣包裹组和贯穿组,带腹壁浅血管的深筋膜包裹组和直接股部皮下埋放组。于术后第2,4,8,16周处死动物后进行Masson染色、墨染大体透明标本、墨染切片HE染色及血管内皮细胞Ⅷ因子相关抗原(Ⅷ-RAg)免疫组织化学染色观察比较新血管的生成。结果:实验组墨染区和Ⅷ-RAg阳性区比例(Pv值和Pr值)在2-8周时均高于对照组。(实验组和对照组)带血管蒂组织瓣处理组4-8周时的Pv值和Pr值均高于非组织瓣处理组。结论:MSCs在材料植入后2周内对诱导新血管形成起主要作用;带血管蒂组织瓣在材料植入后4-8周对诱导新血管生成起主要作用;带血管蒂骨膜瓣有较好的血管化和成骨能力。     

内皮祖细胞与骨髓间充质干细胞构建血管化组织工程骨的研究进展

组织工程骨早期血管化是促进形成新生骨的先决条件,骨髓间充质干细胞(BMSCs)是成骨细胞的起源,体外诱导条件下可分化为成骨细胞,是组织工程骨常用的种子细胞,但很难解决组织工程骨血管化的问题。内皮祖细胞(EPCs)作为内皮细胞前体细胞,已应用于多种缺血组织模型的血管再生研究。目前已有研究者将其引入组织工程骨构建体系,为解决组织工程骨血管化问题提供了新思路和方法。     

组织工程骨血管化的研究进展

由各种创伤、感染、先天畸形、恶性肿瘤等造成的大范围、大节段骨缺损在临床上经常见到,其修复一直是临床治疗的难点。多年来,许多研究者摸索了大量修复骨缺损的方法,先后经历了自体骨移植、同种异体骨移植、异种移植、人工组织代用品及组织化人工骨几个阶段,但都存在不足。现今组织工程骨在组织工程学中研究较多,发展较快,在基础研究方面取得了一定的进展,但临床应用时却发现效果并不理想。经进一步研究发现,     

组织工程骨血管化生长因子的研究进展

由于外伤、肿瘤术后及整形外科等原因可以造成骨组织缺损、功能丧失,临床上多采用自体骨移植和异体骨移植来修复治疗,但二者均有明显不足。随着组织工程的提出与发展,组织工程人工骨经过大量的实验研究被证明是较为理想的修复方法,但是单纯人工骨构建方法在静态培养条件下不能建造出厚度〉0．7cm的骨组织^[1],应用生物反应器和灌流培养体系则可明显提高其成骨能力。复合物植入体内后,细胞只有在200μm之内才可以通过血液弥散营养和氧气而存活^[2]。因此解决成骨区血供的问题成为了骨组织工程领域的焦点。     

磁共振灌注成像监测组织工程骨血管化的实验研究

目的探讨磁共振灌注成像在组织工程骨血管化监测中的应用价值。方法在13只恒河猴的25个胫骨上制备20mm的骨膜与骨缺损，依据填充的材料不同随机分为五组，A组：β-磷酸三钙（β-TCP）＋骨髓基质干细胞（BMSCs）＋血管束；B组：β-TCP＋血管束；C组：β-TCP＋BMSCs；D组：β-TCP；E组：空白对照。术后4、8、12周行磁共振灌注成像检查并计算信号强度-时间（SI-T）曲线的最大线性斜率（SSmax）和基线值（SIbeseline），拍摄恒河猴胫骨X线片并计算其透光度，同时行放射性核素骨显像检查。结果术后4、8、12周A组的SSmax值最高，术后8周与4周相比SSmax有较大幅度的提高（P=0．003）。术后8周A组5个样本的同位素计数比值与磁共振灌注成像检查的SSmax呈正相关关系（rs=0．899，P=0．038），术后12周A组5个样本的SSmax与X线片透光度呈负相关（rs=0．892，P=0．042）。结论SI-T曲线的SSmax能够准确地反映组织工程骨的血管化情况，磁共振灌注成像检查具有无创、无辐射、高灵敏度和可定量分析的优点。     

脱钙骨基质支架构建组织工程骨的实验研究

目的以同种异体骨脱钙骨基质(demineralized bone matrix,DBM)为支架材料,复合体外诱导培养的人骨髓间充质干细胞(human mesenchymal stem cells,hMSCs),构建组织工程骨并通过裸鼠皮下异位成骨实验及裸鼠皮下致瘤性实验验证其成骨效果及安全性.方法贴壁法培养hMSCs,体外诱导培养扩增,以1.857×106/ml的密度与DBM复合构建组织工程骨,体外培养,并在扫描电镜下观察细胞与材料复合情况,进行组织学观察.同时进行了裸鼠皮下异位成骨实验.结果细胞与支架复合后3 d,细胞与DBM表面及孔隙可实现良好复合;复合后5 d,扫描电镜观察到细胞基质分泌旺盛,充满支架孔隙.裸鼠皮下成骨实验证明其成骨效果良好.结论以本实验中使用的细胞培养方法扩增、诱导分化的种子细胞生物安全性好,自制的DBM具有良好的生物相容性,可为种子细胞生长提供较好的三维空间,按照标准化工艺流程制备的组织工程骨安全、有效.     

单克隆抗体CD133在内皮祖细胞表达的实验研究

目的 研究CD133在内皮祖细胞（endothelial progenitor cell，EPC）表面表达，为内皮祖细胞的鉴定提供依据。方法 取兔髂骨骨髓，经密度梯度离心法分离并培养骨髓间充质干细胞（mensenchymal stem cell，MSC），在血管内皮生长因子、成纤维细胞生长因子等诱导条件下定向向内皮祖细胞分化，流式细胞仪检测不同时间内皮祖细胞CD133表达。结果 定向诱导分化细胞形态学呈现“鹅卵石”样或“铺路石”样外观，流式细胞仪检测发现细胞表达CD133，并随时间推移表达逐渐下降。结论 内皮祖细胞高表达CD133与培养时间密切相关。     

大动物体内促组织工程骨成骨及血管化手段的研究

目的：探讨组织工程骨能否修复大动物大段负重骨骨缺损,筋膜瓣能否及如何促进组织工程骨体内成骨及血管化的过程。方法：中国青山羊9只作为空白组,制备单侧胫骨2cm的骨膜与肌缺损,缺损内不植入任何填充物,术后行放射性核素骨显像（ECT）、X线检查、组织学方法评价骨缺损自行修复情况。27只中国青山羊根据骨缺损植入物的不同分为3组：单纯材料组（单纯珊瑚羟基磷灰石coral hydroxyapatite,CHAP）、组织工程骨组（CHAP 经诱导分化的骨髓基质干细胞bone marrow stroma cell,BMSc）、筋膜瓣组（筋膜包裹CHAP 经诱导分化的BMSc）。组织工程骨组和筋膜瓣组分别取9只山羊的BMSc体外进行诱导分化,之后与CHAP复合。制备皮下带蒂深筋膜瓣。各组按不同的设计方案分别植入到骨缺损内。术后2、4、8周行ECT检查,4、8、12周行X线检查、组织学（V-G染色）检查,12周行生物力学检查。结果：术后各项检查结果表明,空白组山羊胫骨2cm的骨缺损是其自身无法修复的,因此是一个理想的骨缺损模型。单纯材料组未能修复骨缺损,仅表现出一个缓慢的爬行替代过程;组织工程骨组可基本修复骨缺损,在成骨质量和血管化过程方面表现出较理想的结果;筋膜瓣组修复骨缺损的效果更为满意,成骨质量和血管化程度亦高于组织工程骨组。结论：山羊胫骨2cm缺损模型不能自主成骨,符合骨组织工程实验的要求。组织工程骨具有良好的修复山羊大段骨缺损的能力。筋膜瓣促组织工程骨成骨的作用是通过其促进组织工程骨血管化这一方式实现的。     

人骨髓内皮前体细胞的体外培养和生物学特性

目的:体外分离纯化人骨髓内皮前体干细胞,研究其基本生物学特性.方法:利用密度梯度离心法分离成人骨髓得到单个核细胞,再用内皮细胞条件培养基培养得到内皮前体干细胞,观察细胞生长特性,通过检测细胞血管内皮生长因子受体-2(VEGFR-2)、Ⅷ因子相关抗原抗体表达和透射电镜对培养细胞进行鉴定.结果:原代培养后细胞贴壁生长,7～10 d形成集落或融合呈卵石形,免疫组化荧光染色后结果显示VEGFR-2, Ⅷ/vWF 阳性,透射电镜显示细胞内具有特征性的W-P小体.结论:用密度梯度离心法和条件培养可以从骨髓得到高纯度内皮前体干细胞,该细胞具有与血管内皮细胞共同的特征,可以进一步分化为血管内皮细胞,是理想的组织工程种子细胞.     

骨髓间充质干细胞在心脏组织工程中的应用

骨髓间充质干细胞(BMSCs)具有多向分化潜能，体外可诱导分化为心肌细胞，采用组织工程学技术可在体外构建组织工程化心肌组织。文章从心脏组织工程的角度对BMSCs作一概述。     

3 种不同组织来源的间充质干细胞促内皮祖细胞血管形成作用的比较

目的：比较人骨髓、脂肪和脐带来源的间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)促进内皮祖细胞 (endothelial progenitor cells,EPCs)形成血管以及维持血管稳定的能力。方法：采用体外共培养成血管试验比较3种来 源的MSCs促EPCs形成管状结构的能力;采用体内基质胶Matrigel成血管试验、免疫组织化学染色比较3种MSCs促进 EPCs在体内形成功能血管的能力。结果：EPCs在脂肪MSCs单层上形成的管状结构长度和节点数均高于在骨髓和脐带 MSCs单层上的形成数;EPCs与脂肪MSCs在Matrigel上共培养时形成的毛细血管样结构稳定性高于骨髓和脐带MSCs; 脂肪MSCs与EPCs在体内Matrigel中形成大量有血流灌注的功能血管,脐带MSCs与EPCs在体内Matrigel中形成少量有血 流灌注的功能血管,而骨髓MSCs与EPCs在体内Matrigel中只形成有血细胞渗漏的不完整血管。结论：脂肪MSCs在体 内、体外促EPCs形成血管结构并维持其稳定的能力高于骨髓和脐带MSCs。     

骨髓基质干细胞构建组织工程心脏瓣膜的初步研究

目的：探讨用骨髓基质干细胞(BMSCs)和脱细胞天然嚣唾支集体外构建组织工程心脏瓣膜(TEHV)的可行性。方法：髂嵴穿刺抽取狗骨髓液，Percoll密度梯度离心法获取BMSCs．DMEM培养液体外培养扩增，免疫组化染色及流式细胞术分析鉴定分化细胞表型。采用去污剂和酶消化法制作脱细胞猪主动脉瓣膜支架，将BMSCs分化细胞接种于瓣膜支架上构建TEHV。分别行石蜡包埋切片H-E染色、免疫组化染色、扫描电镜及透射电镜检查观察TEHV的组织学结构并鉴定细胞类型。结果：BMSCs分化细胞呈梭形，α-SMA及Vimentin染色阳性，其α-SMA表达与血管壁肌成纤维细胞相近。异种瓣膜支架细胞去除完全，纤维支架结构保留完整。石蜡切片示：BMSCs在脱细胞支架上呈复层生长，α-SMA阳性。扫描电镜示TEHV表面光滑，细胞层完整．透射电镜示其细胞成分为有活性的分泌型细胞．呈梭形，复层生长。结论：BMSCs的自然分化细胞具有肌成纤维细胞的特性，种植于脱细胞瓣膜支架上构建TEHV简便可行。TEHV的在体改建尚需进一步研究。     

QY1骨髓多能间质干细胞系向心肌细胞和血管内皮细胞分化

目的:探索QY1骨髓多能间质干细胞系在体外向心肌细胞、血管内皮细胞分化的能力;优化骨髓多能间质干细胞向心肌细胞分化的体外适宜诱导条件;并初步探讨骨髓间质干细胞向成心肌成血管细胞分化的能力.方法:分别用5-氮胞苷、血管内皮生长因子对QY1骨髓多能间质干细胞进行定向诱导分化.利用免疫组化、RT-PCR鉴定分化后的细胞.结果:在传代培养至72 h时,加入10 μmol/L5-氮胞苷诱导24 h后换液培养,以后每7 d换液1次,培养14 d进行再次诱导的条件下,细胞能出现自发性搏动的心肌细胞和肌管样结构,诱导率达(39.47±0.56)%.心肌特异性的表面抗体α-横纹肌肌动蛋白、心肌连接蛋白-43表达阳性,RT-PCR检测有心肌特异性因子α-肌球蛋白重链表达.在用血管内皮生长因子诱导48 h后,出现呈直线排列的血管内皮细胞;7 d后,有部分区域细胞相互连接呈血管内皮细胞网状;14 d时免疫组化检测,发现诱导后的细胞血管内皮特异性表面抗体CD31和Ⅷ因子表达阳性.结论:QY1骨髓多能间质干细胞系细胞在体外特定条件下具有分化为心肌细胞和血管内皮细胞的能力.     

Ectopic osteogenesis and scaffold biodegradation of tissue engineering bone composed of chitosan and osteo-induced bone marrow mesenchymal stem cells in vivo

Background Chitosan （CS） scaffolds combined with osteogenically induced bone marrow mesenchymal stem cells （BMSCs） have been proved to be promising substitutes for repairing bone defects.Nevertheless,the bone-forming and scaffold-biodegrading processes are seldom studied.This study aimed to determine the osteogenic ability of CS/osteoinduced BMSC composites by observing the bone-forming process and explore the relationship between bone formation and scaffold biodegradation.Methods The CS/osteo-induced BMSC composites （CS＋cells group） and the CS scaffolds （CS group） were,respectively,implanted into SD rat thigh muscles.At 2,4,6,8,and 12 weeks postoperatively,the rat femurs were scanned by CT,and the CT values of the implants were measured and comparatively analyzed.Subsequently,the implants were harvested and stained with hematoxylin and eosin and Masson trichrome,and the percentages of bone area,scaffold area,and collagen area were calculated and compared between the two groups.Results The imaging results showed that the densities of implants of the two groups gradually increased along with time,but the CT values of implants in the CS＋cells group were much higher than in the CS group at the same time point （P ＜0.05）.The histological results showed that the de novo bone and collagen formed in the pores of the scaffolds and gradually increased since 2 weeks postoperation in both groups,and the scaffold gradually degraded along with the boneforming process.However,the comparative analysis results showed that the CS＋cells group gained more de novo bone and collagen formation and had less scaffold than the CS group at the same time point （P ＜0.05）.Conclusion The CS/osteo-induced BMSC composites are excellent bone tissue engineering substitutes,and the scaffold biodegradation is accordant with the bone formation.     

壳聚糖复合成骨诱导后的骨髓间充质干细胞组织工程骨的异位成骨及支架降解的实验研究

摘要 背景及目的：壳聚糖支架复合成骨诱导后的骨髓间充质干细胞已经被证实是修复骨缺损的良好替代材料。然而,其成骨的具体过程以及支架的降解却研究较少。本研究的目的是通过观察壳聚糖支架复合成骨诱导后的骨髓间充质干细胞后的异位成骨过程来证实该复合材料的成骨能力,并探索支架降解与骨形成之间的关系。 方法：壳聚糖支架复合成骨诱导后的骨髓间充质干细胞（壳聚糖复合细胞组）和单纯壳聚糖支架（壳聚糖组）被分别植入SD大鼠的股骨肌袋内。 于术后2、4、6、8、12周,分别对大鼠股骨行CT扫描,并测定、统计分析两组的植入物CT值。随后取出标本,行HE染色和Masson染色,并测定、统计分析骨面积分数、支架面积分数以及胶原面积分数。 结果：影响学结果显示两组植入物的密度随时间延长而逐渐增高,但是在同一时间点,壳聚糖复合细胞组植入物的CT值明显高于壳聚糖组（P<0.05）。组织学检测结果显示从术后2周开始,两组均可观察到支架孔隙内的新骨和胶原蛋的形成并且随着时间延长而逐渐增加,以及支架随着骨形成的过程而逐渐降解。然而,统计分析结果显示,在同一时间点,壳聚糖复合细胞组的新生骨量以及胶原蛋白表达量明显高于壳聚糖组,而剩余支架要明显少于壳聚糖组。 结论：壳聚糖支架复合成骨诱导后的骨髓间充质干细胞是一种优秀的组织工程骨替代物,支架的降解与异位成骨过程一致。     

髓核去细胞基质复合骨髓间充质干细胞体外构建组织工程髓核的研究?

目的：体外培养兔骨髓间充质干细胞(rBMSCs)-髓核去细胞基质支架(NPAMS)复合体(rBMSCs-NPAMS)构建组织工程髓核。方法制备若干 NPAMS,接种 BMSCs 至 NPAMS 体外培养分为 NPAMS 组、实验组和正常对照组(正常髓核)。肉眼及显微镜观察复合体形态变化,并行扫描电镜(SEM)、苏木素-伊红(HE)染色、免疫组织化学、实时定量 PCR(qRT-PCR)、支架的生物力学等检测。结果肉眼下 rBMSCs-NPAMS 形态接近正常髓核;SEM 显示细胞在支架表面大量黏附、并向深部迁移,表面细胞密度比横截面细胞密度大;HE 染色表明随时间延长,rBMSCs-NPAMS 内细胞量递增,分布更广泛;免疫组织化学显示细胞外基质2型胶原(CollagenⅡ)分泌量随时间递增,且实验组 CollagenⅡ表达量大于 NPAMS 组,小于正常对照组;qRT-PCR结果：NPAMS 组未提取到 mRNA,实验组 CollagenⅡ、聚集蛋白聚糖(Aggrecan)mRNA 相对表达量呈时间依赖性递增,但均小于正常对照组(P <0.01),支架与正常髓核在相同位移下的压缩载荷差异无统计学意义(P >0.05)。结论采用髓核体外 NPAMS复合 rBMSCs 可成功构建组织工程髓核。     

不同接种密度体外构建组织工程骨的实验观察

目的观察不同接种密度对骨髓间充质干细胞(MSCs)与冻干脱钙骨基质(FDBM)体外构建组织工程骨的影响,以选择适宜的接种密度.方法将不同密度的羊MSCs与同种异体FDBM复合体外构建组织工程骨,通过细胞计数、相差显微镜观察、扫描电镜观察及MTT检测等方法评价细胞在材料中的黏附、生长情况.结果 MSCs在立体网孔结构的FDBM上能较好的黏附、铺展、增殖;接种细胞密度低于2×106/ml时,FDBM上的MSCs附着量随接种细胞密度升高而增加,超过该密度后上架细胞数不再增加,最大上架细胞数为(5.01±0.58) ×104/块(FDBM).结论 FDBM支架上的活细胞数存在一定极限,理想细胞接种密度应该在(1～2)×106/ml.     

用骨髓基质干细胞分化的内皮细胞体外构建组织工程心脏瓣膜

目的:探讨用骨髓基质干细胞(BMSCs)诱导分化产生的内皮细胞和去细胞异种天然瓣膜支架体外构建组织工程心脏瓣膜(TEHV)的可行性.方法:以含EGF、bFGF、IGF和肝素的M199培养液培养绵羊原代BMSCs,并以VEGF诱导BMSCs向内皮细胞分化.采用去污剂和酶消化法制作去细胞猪主动脉瓣支架,通过静态种植方法构建TEHV.经H-E染色、免疫组化、扫描电镜及透射电镜检查观察TEHV的组织学和超微结构.结果:诱导分化产生的内皮细胞在去细胞瓣叶支架及整体瓣膜支架上呈单层生长,形成完整的内皮细胞单层.瓣叶表面细胞呈梭形, CD34及Ⅷ因子相关抗原免疫组化染色阳性.结论:BMSCs诱导分化产生的内皮细胞具有与成熟内皮细胞相同的生物学特性.采用BMSCs诱导分化内皮细胞构建TEHV更为简便可行.